严重脓毒症是临床常见的危重疾病，免疫抑制是导致严重脓毒症患者病情恶化的重要因素之一^[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是严重脓毒症患者常见的合并症。最近在一项包含1 104例脓毒症患者的调查中发现21.8%的人合并糖尿病^[2]。随着T2DM的患病率与日俱增，糖尿病对脓毒症的影响及发病机制逐渐受到关注^[3]。程序性死亡因子-1(processed death-1，PD-1)作为CD28超家族的新成员之一，是负性共刺激分子，能介导负性协同刺激信号^[4]。PD-1能有效抑制T细胞功能，使T细胞增殖受抑，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌^[5-6]，该抑制途径在免疫调节中发挥着重要的作用^[7]。研究表明，PD-1在脓毒症患者的表达升高，而且与患者的院内感染率及病死率密切相关^[8-9]。这可能与PD-1对脓毒症的免疫抑制作用有关^[10]。T2DM可能影响体内固有免疫系统。PD-1抑制信号的缺乏可以导致CD8⁺ T细胞在胰岛的浸润，破坏胰岛β细胞并释放炎性细胞因子^[11]。研究表明严重脓毒症合并T2DM患者外周血T淋巴细胞PD-1的表达水平是升高的^[12]。有研究显示脓毒症合并T2DM患者的病死率随血糖水平变化而改变^[13]，但严重脓毒症合并T2DM患者在不同血糖状态下的免疫情况却少有报道。本研究旨在探讨严重脓毒症合并T2DM患者不同血糖水平对28 d病死率及外周血T淋巴细胞PD-1表达的影响。

选取2016年1月至9月在首都医科大学附属北京朝阳医院急诊科就诊的严重脓毒症合并T2DM患者进行前瞻性研究。入选患者2型糖尿病的诊断符合2013美国糖尿病协会颁布的糖尿病诊断标准和分类标准^[14]，严重脓毒症的定义符合2012国际严重脓毒症及脓毒性休克诊疗指南的诊断标准^[15]。患者排除标准：年龄 < 18岁，手术外伤患者，有血液系统疾病、自身免疫性疾病、HIV/AIDS、肝脏疾病(如肝炎、肝硬化)、终末期肾病(需要透析治疗)、肿瘤、妊娠、以及正在使用激素治疗的患者。根据患者入院时血糖水平分为三组：血糖＜6.1 mmol/L组、血糖6.1~11.1 mmol/L组、血糖＞11.1 mmol/L组。对所有入选患者进行28 d随访，以患者28 d转归情况为终点，记录生存和死亡例数。住院患者记录28 d转归情况，未满28 d离院者电话随访记录患者转归。同时选取年龄和性别匹配的50名健康志愿者作为对照组。本研究符合医学伦理学标准，经医院伦理委员会批准，并获得患者或家属的知情同意。

记录患者的临床特征包括年龄、性别、住址、电话号码、生命体征、既往病史，入院时血常规、血气分析、肝功能、肾功能、入院时的血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、胸片、痰或血液、尿液的细菌学检测结果等。患者入院后即留取4 mL肘静脉血，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，用于流式细胞学检测。并在入院后24 h内进行急性生理及慢性健康情况评价系统Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分和感染相关脏器衰竭(SOFA)评分。临床医生对患者的评分和流式细胞学检测结果并不知情。应用西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪(美国，Siemens Diagnostics公司)采用葡萄糖氧化酶法测定血糖。通过Tosoh HLC-723 G8自动糖化血红蛋白分析仪(日本，Tosoh公司)采用高效液相色谱的原理进行糖化血红蛋白测定。Hs-CRP采用免疫比浊法分析检测(芬兰，Orion Diagnostica公司)。

对标本进行细胞染色和红细胞裂解。每100 μL抗凝血中分别加入荧光单克隆抗体标记：BV421标记的鼠抗人PD-1(5 μl，clone EH12.1), APC-H7标记的鼠抗人CD3 (5 μl，clone SK7), FITC标记的鼠抗人CD4 (5 μl，clone OKT4), FITC标记的抗CD8抗体(20 μl，clone RPA-T8)，所有抗体均购买自美国BD Bioscience公司或者美国eBioscience公司，所用剂量均为厂家推荐剂量。样品应用Gallios^TM流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)和Gallios^TM软件1.0版(BeckmanCoulter公司)进行分析。T淋巴细胞亚群由CD3⁺和CD4⁺或CD3⁺和CD8⁺染色确定。每个样品至少检测5 000个CD4⁺ T淋巴细胞和5 000个CD8⁺ T淋巴细胞。

使用SPSS 17.0统计软件分析数据。年龄、评分、及各化验检测结果为非正态分布数据，以中位数(四分位数)[M(QL, QU)]表示，两组以上非正态分布的计量资料的比较采用非参数的Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料采用χ²检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并对生存曲线进行Log Rank检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

共有106名严重脓毒症合并T2DM患者和50名健康对照者纳入此项研究。严重脓毒症合并T2DM组与健康对照组相比白细胞、淋巴细胞、Hs-CRP、血糖、糖化血红蛋白均升高，差异存在统计学意义(P＜0.05)，两组间性别和年龄差异无统计学意义2(P＞0.05)。严重脓毒症合并T2DM患者的外周血PD-1⁺CD4⁺ T淋巴细胞百分比和平均荧光强度、PD-1⁺CD8⁺T淋巴细胞百分比和平均荧光强度均高于健康对照组，差异存在统计学意义(P＜0.05)(见表 1)。

对严重脓毒症合并T2DM患者按入院血糖水平分为三组：血糖＜6.1 mmol/L组(23例)、血糖6.1~11.1 mmol/L组(37例)、血糖＞11.1 mmol/L组(46例)。三组间性别、年龄、白细胞计数、淋巴细胞计数、Hs-CRP及合并症差异无统计学意义2(P＞0.05)。血糖＜6.1 mmol/L组的病死率和APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、糖化血红蛋白均高于血糖6.1~11.1 mmol/L组和血糖＞11.1 mmol/L组(P＜0.05)(表 2)。Kaplan-Meier生存曲线显示，血糖＜6.1 mmol/L组的28 d死亡风险高于血糖6.1~11.1 mmol/L组和血糖＞11.1 mmol/L组(Log-rank检验值分别为6.523和5.794，P值分别为0.011和0.016)。血糖6.1~11.1 mmol/L组和血糖＞11.1 mmol/L组的28 d死亡风险差异无统计学意义(P=0.724)(图 1)。

血糖＜6.1 mmol/L组的28 d死亡风险高于血糖6.1~11.1 mmol/L组或血糖＞11.1 mmol/L组(Log-rank检验值分别为6.523和5.794，P值分别为0.011和0.016)。血糖6.1~11.1 mmol/L组和血糖＞11.1 mmol/L组的28 d死亡风险差异无统计学意义(P=0.724) 图 1 不同血糖水平的严重脓毒症合并T2DM患者Kaplan-Meier生存曲线的比较 Figure 1 The comparison of Kaplan-Meier survival curves in different blood glucose levels of patients with severe sepsis and T2DM

图选项

血糖＜6.1 mmol/L组的外周血PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞百分比的中位数(四分位数)为54.88%(45.00%，62.06%)，高于血糖6.1~11.1 mmol/L组的41.24% (31.77%，45.54%)和血糖＞11.1 mmol/L组的39.46% (34.58%，46.22%)(P＜0.05)，但PD-1⁺CD8⁺ T细胞百分比在血糖6.1~11.1 mmol/L和血糖＞11.1 mmol/L的患者之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图 2)。PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞的平均荧光强度结果与百分比结果类似。PD-1⁺CD4⁺ T淋巴细胞的百分比和平均荧光强度在三组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 2。

入院血糖＜6.1 mmol/L的患者PD-1+CD8+ T细胞百分比高于入院血糖在6.1~11.1 mmol/L和血糖＞11.1 mmol/L的患者(P＜0.05)，但血糖在6.1~11.1 mmol/L和血糖＞11.1 mmol/L的患者PD-1+CD8+ T细胞百分比差异无统计学意义(P＞0.05) 图 2 不同血糖水平严重脓毒症合并T2DM患者外周血T淋巴细胞PD-1+CD8+水平比较 Figure 2 The comparison of peripheral blood T lymphocyte PD-1+CD8+ levels in different blood glucose levels of patients with severe sepsis and T2DM

图选项

PD-1是具有负性调节免疫功能作用的分子，可以产生抑制性信号，导致效应细胞活化、增殖和效应功能受到抑制^[6]。严重脓毒症患者死亡的一个主要原因是免疫抑制所造成的免疫系统损伤^[16-17]。PD-1在脓毒症的免疫抑制过程中发挥了重要的作用^[10]。Huang等^[18]在研究脓毒症模型小鼠外周血中PD-1的变化时发现，脓毒症外周血巨噬细胞及单核细胞表面的PD-1表达增加，同时发现PD-1基因缺陷型小鼠的感染率及病死率均有所改善。还有研究发现，应用PD-1拮抗剂可明显改善脓毒症小鼠生存率^[19]。近年的临床试验也证实外周血中T细胞表达的PD-1在脓毒症患者中明显升高^{[8-9, 20]}。本研究发现，严重脓毒症合并T2DM患者外周血T淋巴细胞表达的PD-1水平较健康对照者明显增加，说明严重脓毒症合并T2DM患者可能存在免疫功能抑制。进一步分组后发现，入院血糖＜6.1 mmol/L的严重脓毒症合并T2DM患者的APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、28 d病死率和PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞水平均高于入院血糖6.1~11.1 mmol/L组或入院血糖＞11.1 mmol/L组。说明入院时血糖＜6.1 mmol/L的严重脓毒症合并T2DM患者，病情可能更重，28 d死亡风险更高，并可能存在更严重的免疫抑制。

本研究发现严重脓毒症合并T2DM患者入院血糖＜6.1 mmol/L会增加患者28 d死亡风险。许多研究已证实，感染时的应激性高血糖会增加无糖尿病患者的死亡风险^[21]，无糖尿病的危重症患者中，出现应激性高血糖的患者常伴有组织灌注不良，可引起胰岛β细胞分泌功能失调或减退，导致患者的糖代谢障碍^[22]。但有糖尿病与无糖尿病的患者在出现脓毒症时的血糖变化可能是不同的。糖尿病患者脓毒症时的血糖控制还有待进一步研究^[23]。在一项对急诊7 754例脓毒症患者的多中心前瞻性队列研究中提示, 虽然糖尿病和病死率间无相关性，但是无糖尿病的脓毒症患者初期血糖高于200 mg/dL病死率增加，而有糖尿病的患者并未发现此现象；但当初期血糖低于100 mg/dL时，有糖尿病的脓毒症患者病死率增加，而无糖尿病的患者病死率不增加^[13]。因此，对于急诊脓毒症合并糖尿病的患者，早期血糖控制应适当放宽，因为糖尿病患者比非糖尿病患者可能更能适应高血糖^[21]。适当的血糖升高表明机体有应激能力，可能是一种保护性机制。本研究结果提示对于入院血糖低的患者，应警惕其潜在的死亡风险，因为此类患者可能应激反应能力差，同时还可能存在严重的免疫功能抑制。

越来越多的研究表明，T2DM是一种与免疫相关的慢性炎症性疾病，T2DM患者胰岛的慢性炎性反应可导致β细胞数量减少和胰岛素分泌障碍^[24]，而CD8⁺T细胞则可促进β细胞损伤的细胞炎性反应和自身免疫应答^[25]。脓毒症患者存在T淋巴细胞亚群的异常表达^[26]。但近期的研究指出，糖尿病并未使严重脓毒症患者的免疫功能进一步恶化^[12]。本研究结果提示，不同入院血糖水平的严重脓毒症合并T2DM患者，其免疫功能存在差异。入院血糖＜6.1 mmol/L的患者PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞水平高于入院血糖≥6.1 mmol/L的患者。此外，入院血糖＜6.1 mmol/L的患者HbA1c水平最高，提示这组患者入院前血糖水平较高，血糖控制差、胰岛素缺乏可能是入院血糖＜6.1 mmol/L组患者病死率增加的另一个原因。

本研究并未发现外周血PD-1⁺CD4⁺ T淋巴细胞水平在不同血糖水平的区别。这可能与葡萄糖代谢对CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺ T淋巴细胞的影响不同有关。CD8⁺ T淋巴细胞的糖酵解代谢率要高于CD4⁺T淋巴细胞，在葡萄糖缺乏的环境中CD8⁺ T淋巴细胞可以进行分裂和增殖^[27]。因此，对于不同的血糖水平，PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞可能比PD-1⁺CD4⁺ T淋巴细胞更敏感，更能反映免疫情况。

本研究有以下局限性：一是本研究选取了到急诊就诊的有T2DM的严重脓毒症患者，但未能排除T2DM的诸多混杂因素，如糖尿病病程时间长短、代谢控制情况、糖尿病相关并发症、肥胖、胰岛素及药物治疗等因素对严重脓毒症合并糖尿病患者预后的影响；二是研究中的患者均选自急诊，在患者初到急诊时进行化验及采血，未对患者进行连续检测，并且是单中心的研究，因此需要更大样本量的多中心研究进一步验证本研究结果；最后，此研究仅是观察性研究，其进一步的分子机制还有待进一步研究。