2 新乡医学院第一附属医院肿瘤科,453100
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistant staphylococcus aureus, MRSA)是重症监护病房中感染率极高的一种革兰氏阳性球菌。近十年来社区获得性MRSA的感染率日益升高,甚至出现了对万古霉素耐药的菌株,给MRSA的治疗带来了新的挑战[1]。绝大多数重症感染患者存在免疫麻痹或免疫功能衰竭,因此,免疫调节治疗已成为重症感染治疗的研究热点[2-3]。自然杀伤(natural killer, NK)细胞是固有免疫的重要成员之一,可通过分泌细胞因子和抗体依赖性细胞介导的毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)发挥细胞杀伤作用[4]。多种因素(如:病原微生物感染、肿瘤、怀孕等)均可诱导NK细胞表型和功能的改变[5-6],研究发现,基质金属蛋白酶(matrix met alloproteinase, MMP)可诱导人类免疫缺陷病毒感染者NK细胞功能障碍,促进感染慢性化[7]。但有关NK细胞及其调控因素在MRSA脓毒症中作用的研究较少。因此,本研究观察MRSA脓毒症患者外周血NK细胞亚群和功能的变化,探讨MMP对MRSA脓毒症患者NK细胞功能的影响,以期阐释NK细胞在MRSA脓毒症中发挥的作用,为MRSA脓毒症免疫疗法的研发提供实验依据。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取2017年1月至2018年6月新乡医学院第一附属医院感染疾病科三病区收治的的MRSA脓毒症患者21例,男性17例,女性4例,年龄范围23~61岁,所有患者两套血培养均提示MRSA感染。罹患基础疾病中,重症肺炎14例(其中呼吸机相关肺炎9例)、肝衰竭4例(均为药物性肝损害)、中枢神经系统感染2例、蜂窝织炎1例。纳入标准:(1)年龄18 ~ 65岁;(2)获得知情同意。排除标准:(1)血培养提示合并其他细菌感染;(2)合并慢性病毒感染;(3)合并恶性肿瘤。同时入组年龄和性别相匹配的健康志愿者11例作为对照(normal control, NC),男性8例,女性3例,年龄范围27 ~ 50岁。本研究方案通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会审核通过,所有研究对象及其法定委托人签署知情同意书。
1.2 主要仪器、试剂和细胞FACS Aria Ⅱ流式细胞(美国BD公司);实时定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)。淋巴细胞分离液(自美国Sigma公司);NK细胞分选试剂盒(德国美天旎公司);抗人CD3-APCCy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7、抗人CD69-FITC、抗人CD107aPE-Cy5(美国BD公司);抗人CD16-PE Texas Red(美国Invitrogen公司);P815抗体(P815-Ab)(美国Accurate公司);RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(美国Thermo公司);MMP抑制剂GM6001(美国Gallardin公司)。人EB病毒转染的B淋巴细胞系721.221细胞、人高度低分化红白血病细胞系K562细胞、小鼠淋巴母细胞样肥大细胞瘤细胞系P815细胞由新乡医学院第一附属医院中心实验室保存,使用RPMI 1640培养液+10 %胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)于37℃、5%CO2孵箱中无菌培养。
1.3 研究方法 1.3.1 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分离清晨、空腹抽取患者和健康志愿者10 mL EDTA抗凝外周血。立即使用淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMC,冻存于液氮中备用。
1.3.2 NK细胞亚群分析复苏PBMC,于37℃、5%CO2孵箱中培养2 h,转入FACS管中,PBS洗涤后加入抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7和抗人CD16- PE Texas Red各5 μL,于4℃避光孵育20 min,PBS洗涤后加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定,FACS Aria Ⅱ流式细胞仪分析,CellQuest Pro软件获取细胞,FlowJo 8.6.2软件分析结果。
1.3.3 NK细胞功能测定721.221细胞表达MHC-Ⅱ类分子,不表达MHC-Ⅰ类A、B、C分子,NK细胞可结合表面细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptor, NCR;即:NKp30、NKp44、NKp46)识别721.221细胞,评估NK细胞NCR识别的限制杀伤作用;K562细胞MHC-Ⅰ类分子表达降低,NK细胞可结合其表面NKG2D受体识别K652细胞,评估NK细胞NKG2D识别的限制杀伤作用;P815细胞不表达NK细胞受体的配体,无法被NK细胞识别和杀伤,但结合其特异性兔抗鼠多克隆抗体P815-Ab,则可被NK细胞表面CD16(FcγⅢ A)所识别,评估NK细胞的ADCC功能。取含有106个P815的细胞悬液1 mL,加入P815-Ab 10 μL,于37℃、5%CO2孵箱中培养1 h,洗涤2次后调整细胞浓度至106个/mL,另取含有106个721.221细胞、K562细胞和P815细胞各1 mL备用。向每管无菌FACS管中加入含有106个PBMC 1 mL,加入抗人CD107a-PE-Cy5各20 μL和终浓度为10 μg/mL的布雷非德菌素A,并分别加入准备好的靶细胞悬液100 μL(效应细胞/靶细胞=10: 1),充分混匀后于37℃、5% CO2孵箱中培养4 h。洗涤后加入抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7、抗人CD16- PE Texas Red和抗人CD69-FITC各5 μL,于4℃避光孵育20 min,使用PBS洗涤后,加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定,FACS Aria Ⅱ流式细胞仪分析,CellQuest Pro软件获取细胞,FlowJo 8.6.2软件分析结果。
1.3.4 NK细胞分选选择9例MRSA脓毒症患者和7例NC,取2×107个复苏的PBMC,离心后加入80 μL NK细胞分离缓冲液重悬细胞,混匀后加入20 μL NK细胞生物素抗体混合物,混匀后于4℃孵育5 min,然后加入60 μL缓冲液和40 μL NK细胞磁珠混合物,混匀后于4℃孵育10 min,加入缓冲液,调整总体积至500 μL。将吸附柱置于MACS磁力分离架上,加入500 μL分离缓冲液预混,将上述细胞悬液加入预混的吸附柱中,收集吸附柱中流出的未标记细胞,即为富集的NK细胞。
1.3.5 实时定量PCR检测NK细胞中MMP mRNA取105个分选的NK细胞,提取总RNA,取1 μg总RNA,建立如下反转录反应体系:总RNA 1 μg、Oligo(dT)引物1 μL、5×First Strand缓冲液4 μL、DDT(0.1 mol/L)1 μL、RNase抑制剂1 μL、dNTP 1 μL、RevertAid M-MulV反转录酶1 μL,加入DEPC处理ddH2O调整总体积至20 μL,反应条件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,产物cDNA立即进行PCR。实时定量PCR反应体系:cDNA 1 μL、上游引物(10 μmol/L)0.25 μL、下游引物(10 μmol/l)0.25 μL、2×qPCR Mix 12.5 μL、ddH2O 11 μL,反应条件:95℃预变性10 min,然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,共40个循环。引物序列如前所述[7],采用2-ΔΔCT法、以GAPDH为内参照,检测NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9 mRNA相对表达量。
1.3.6 抑制MMP对NK细胞功能影响的检测取纯化的NK细胞,加入含IL-2(终浓度为50 U/ mL)的RPMI1640+10%FBS培养,设立2个复孔,其中一个复孔加入MMP抑制剂GM6001(终浓度为10 μmol/L),另一复孔加入等量培养液,刺激培养12 h后与721.221细胞、K562细胞、P815细胞、P815-Ab细胞共培养,检测CD107a水平,评估NK细胞的功能。
1.4 统计学方法使用SPSS 21.0软件进行数据分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对标本的正态性进行分析,所有样本均符合正态分布,计量资料使用均数±标准差(Mean±SD)表示,采用成组t检验对两组数据进行分析,采用配对t检验对GM6001刺激前后的数据进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NK细胞亚群在MRSA脓毒症中的变化根据FCS和SSC对PBMC进行圈门,然后阴性选择CD3/CD14/CD19-APC-Cy7标记的细胞,排除T细胞、单核细胞和B细胞,然后根据CD16和CD56的表达水平,将NK细胞分为CD56brightCD16-、CD56-CD16+和CD56 -CD16+三个亚群,NC和MRSA脓毒症患者中NK细胞亚群典型流式散点图见图 1。总NK细胞占PBMC的比例在NC和MRSA脓毒症患者中的差异无统计学意义,见表 1。CD56brightCD16-NK细胞比例在MRSA脓毒症患者中较NC升高(表 1),CD56-CD16+NK细胞比例在MRSA脓毒症患者中较NC降低(表 1),CD56 -CD16+NK细胞比例在MRSA脓毒症中较NC亦升高,见表 1。
指标 | NC (n=11) | MRSA脓毒症(n=21) | t值 | P值 |
总NK细胞占PBMC (%) | 13.38±3.03 | 11.72±2.23 | 1.771 | 0.087 |
CD56brightCD16- NK细胞(%) | 5.36±1.02 | 4.30±0.89 | 2.903 | 0.0069 |
CD56dimCD16+ NK细胞(%) | 71.22±13.03 | 87.64±7.05 | 3.872 | 0.0005 |
CD56-CD16+ NK细胞(%) | 24.04±2.92 | 9.70±1.54 | 15.15 | < 0.0001 |
分别以721.221细胞、K562细胞和P815-Ab细胞为靶细胞,检测NK细胞通过NCR、NKG2D和CD16(即ADCC)介导的细胞毒性作用。NK细胞受刺激活化后,细胞表面CD107a(脱颗粒释放穿孔素、颗粒酶的标志)和CD69(活化标志)均显著升高,但CD16表达水平下调(图 2)。MRSA脓毒症患者的NK细胞通过NCR、NKG2D及CD16介导的识别和杀伤相应靶细胞系后,CD107a比例较NC降低(表 2)。进一步对NK细胞ADCC功能相关标志物进行检测发现,P815-Ab细胞刺激后,NK细胞表面CD69比例在MRSA脓毒症患者较NC降低(表 2),而CD16平均荧光强度(mean fl uorescence intensity, MFI)在MRSA脓毒症中较NC升高,见表 2。
指标 | NC (n=11) | MRSA脓毒症(n=21) | t值 | P值 |
CD107a (与721.221细胞共培养) (%) | 18.64±1.64 | 14.85±1.24 | 7.371 | < 0.0001 |
CD107a (与K562细胞共培养) (%) | 19.49±1.58 | 14.46±0.79 | 12.12 | < 0.0001 |
CD107a (与P815-Ab细胞共培养) (%) | 33.44±3.84 | 25.34±6.20 | 3.995 | 0.0004 |
CD69 (与P815-Ab细胞共培养) (%) | 18.80±1.49 | 14.96±1.47 | 7.010 | < 0.0001 |
CD16 MFI (与P815-Ab细胞共培养) | 189.4±57.54 | 247.1±50.31 | 2.933 | 0.0064 |
分选9例MRSA脓毒症患者和7例健康志愿者的NK细胞,检测NK细胞中MMP mRNA的相对表达量。MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA相对表达量均较NC升高(表 3),而NK细胞中MMP-7 mRNA相对表达量在NC和MRSA脓毒症患者中的差异无统计学意义,见表 3。
指标 | NC (n=7) | MRSA脓毒症(n=9) | t值 | P值 |
MMP-1 mRNA | 1.04±0.22 | 4.26±1.12 | 7.405 | < 0.0001 |
MMP-2 mRNA | 1.04±0.12 | 4.93±1.34 | 7.610 | < 0.0001 |
MMP-3 mRNA | 0.89±0.19 | 9.89±2.35 | 10.02 | < 0.0001 |
MMP-7 mRNA | 1.01±0.12 | 0.98±0.12 | 0.404 | 0.693 |
CMMP-9 mRNA | 1.04±0.17 | 23.56±3.88 | 15.23 | < 0.0001 |
取9例MRSA脓毒症患者分选的NK细胞,加入MMP抑制剂GM6001刺激培养后分别与721.221细胞、K562细胞和P815-Ab细胞为靶细胞共培养。抑制MMP后NK细胞对721.221细胞和K562细胞杀伤功能无明显变化,CD107a比例差异无统计学意义(表 4),而抑制MMP后NK细胞对P815-Ab细胞的杀伤作用增强,CD107a比例升高(表 4)。
指标 | 无GM6001刺激 | 经GM6001刺激 | t值 | p值 |
CD107a (与721.221细胞共培养) (%) | 14.55±1.64 | 14.61±2.71 | 0.081 | 0.937 |
CD107a (与K562细胞共培养) (%) | 14.34±0.91 | 14.59±2.63 | 0.280 | 0.786 |
CD107a (与P815-Ab细胞共培养) (%) | 25.87±6.23 | 33.67±8.03 | 2.962 | 0.018 |
NK细胞根据CD16和CD56表达水平可分为CD56brightCD16-、CD56dimCD16+和CD56 -CD16+三个亚群。CD56brightCD16-NK细胞主要分泌干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等多种细胞因子,参与机体免疫调控[8];CD56dimCD16+NK细胞是成熟的、具有细胞毒性的亚群,通过CD16发挥ADCC作用,杀伤靶细胞[9];CD56 -CD16+NK细胞是失能NK细胞,增殖能力低下,分泌细胞因子和细胞毒性作用均显著降低[10]。本研究发现,MRSA脓毒症患者中总NK细胞比例无明显变化,细胞毒性CD56dimCD16+NK细胞显著减少,而失能的CD56 -CD16+NK细胞和分泌细胞因子的CD56brightCD16-NK细胞均显著增多,这与既往研究发现的脓毒症患者NK细胞比例升高的结果并不完全一致[11-12]。而在新生儿脓毒症和动物模型中,CD56dimCD16+NK细胞的比例在急性期显著降低[13-14],这与本研究结果相似。更为重要的是,失能的CD56 -CD16+NK细胞在MRSA脓毒症中显著升高,与在慢性病毒感染中的研究结果一致[7, 15]。本研究结果提示MRSA感染可能通过改变NK细胞亚群分布,使CD56表达进一步降低,实现CD56dim亚群向CD56 -亚群的转化[16],导致NK细胞亚群失衡,降低细胞毒性,促进MRSA脓毒症的发生发展。但分泌细胞因子的CD56brightCD16- NK细胞升高,其在MRSA脓毒症中的作用尚有待进一步研究。
NK细胞接受MHC-Ⅰ类分子缺陷的721.221细胞、K562细胞及抗体包被的P815细胞刺激后,可分别通过NCR、NKG2D及CD16途径发挥细胞毒性作用[17]。NK细胞活化后,细胞表面脱颗粒标志物CD107a和活化标志CD69表达上调,而介导ADCC作用的CD16在发挥细胞毒性作用时表达下调,与细胞活化和脱颗粒同步[7]。本研究发现,MRSA脓毒症患者的NK细胞在活化后CD107a和CD69的表达均较NC降低,但CD16表达上调,这提示MRSA脓毒症患者NK细胞通过NCR、NKG2D及CD16途径发挥细胞毒性的功能存在明显异常,进一步提示MRSA脓毒症患者中存在NK细胞功能衰竭,难于清除细菌感染,促进疾病进展。
MMP是一种锌依赖性的内肽酶家族成员,其水解底物为细胞外基质成分,在多种病毒、细菌感染及肿瘤中的表达上调,参与疾病发生发展。在结肠癌患者中,MMP-9在促血管生成的蜕膜NK样细胞中的表达上调。在胃癌患者中,抑制MMP活性可重建NKG2D表达,提高NK细胞的杀伤敏感性。人类免疫缺陷病毒感染者NK细胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高,抑制MMP活性增加NK细胞CD16的表达,促进NK细胞介导的ADCC功能[7]。本研究亦发现,MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA表达上调,抑制MMP后可增强NK细胞的ADCC作用,介导P815-Ab细胞杀伤,但对NCR和NKG2D介导的细胞杀伤无显著影响,提示MMP可能主要通过影响NK细胞的ADCC作用发挥免疫调控功能。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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