中华急诊医学杂志  2020, Vol. 29 Issue (6): 835-840   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2020.06.019
基质金属蛋白酶对MRSA脓毒症患者NK细胞的调控作用
梁海军1 , 崔艳慧2 , 王燕平2 , 王新伟2 , 高海丽2 , 陈宝鑫2 , 杨道坤2     
1 新乡医学院第一附属医院感染疾病科,453100;
2 新乡医学院第一附属医院肿瘤科,453100
摘要: 目的 观察耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)脓毒症患者外周血自然杀伤(NK)细胞亚群和功能,探讨基质金属蛋白酶(MMP)对MRSA脓毒症患者NK细胞功能的影响。方法 选择2017年1月至2018年6月本科收治的MRSA脓毒症患者21例和健康对照者(NC)11例,分离外周血单个核细胞(PBMC),流式细胞术检测NK细胞亚群比例。通过检测PBMC与靶细胞共培养体系中CD107a、CD69、CD16的表达评估NK细胞功能。分选NK细胞,实时定量PCR法检测MMP mRNA,使用MMP抑制剂刺激NK细胞,检测共培养体系中CD107a变化。组间比较采用成组 t检验或配对 t检验。结果 总NK细胞比例在NC和MRSA脓毒症患者之间的差异无统计学意义(P>0.05),MRSA脓毒症患者CD56brightCD16-NK细胞[(5.36±1.02)% vs (4.30±0.89)%]和CD56 -CD16+NK细胞[(24.04±2.92)% vs(9.70±1.54)%]升高(P < 0.05),CD56dimCD16+NK细胞(71.22±13.03)% vs(87.64±7.05%)]降低(P < 0.01)。NK细胞通过不同受体介导相应靶细胞杀伤后,MRSA脓毒症患者NK细胞中CD107a[(33.55±3.84)% vs(25.34±6.20%)]和CD69[(14.96±1.47%)vs(18.80±1.49)%]比例低于NC(P < 0.01),CD16 MFI[(247.1±50.31)vs(189.4±57.54)]高于NC(P < 0.01)。MMP-1/2/3/9 mRNA在MRSA脓毒症患者NK细胞中的相对表达量升高(P < 0.01)。抑制MRSA脓毒症患者NK细胞MMP使CD107a比例升高[(33.67±8.03%)vs(25.87±6.23)%,P=0.018]。结论 MRSA脓毒症患者存在NK细胞亚群失衡和功能衰竭,这可能与MMP诱导的抗体依赖细胞介导的毒性作用降低有关。
关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌    感染    脓毒症    自然杀伤细胞    基质金属蛋白酶    固有免疫    免疫调控    免疫耐受    
Matrix metalloproteinase regulates natural killer cells function in methicilin-resistant staphylococcus aureus sepsis
Liang Haijun1 , Cui Yanhui2 , Wang Yanping,2 , Wang Xinwei2 , Gao Haili2 , Chen Baoxin2 , Yang Daokun2     
Department of Infectious Diseases Ward Ⅲ, the First Affi liated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China
Abstract: Objective To investigate the characteristics of natural killer (NK) cell subsets and function in methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) sepsis, and to assess the influence of matrix metalloproteinase (MMP) to NK cell function in MRSA sepsis patients. Methods Twenty-one MRSA sepsis patients who were hospitalized in our department between January 2017 and June 2018 were enrolled. Eleven healthy individuals were served as healthy controls. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated. NK cell subsets were investigated by flow cytometry. NK cell function was assessed by measuring CD107a, CD69, and CD16 expression in co-culture system between PBMCs and different target cells. MMP mRNA was semi-quantifi ed by real-time PCR in purifi ed NK cells. The infl uence of NK cell function was assessed by measuring CD107a expression in co-culture system between NK cells with MMP inhibitor stimulation and target cells. Results There was no signifi cant difference of total NK cell percentage between healthy controls and MRSA sepsis patients (P>0.05). CD56brightCD16- NK [(5.36±1.02)% vs (4.30±0.89)%] and CD56 -CD16+NK [(24.04±2.92)% vs (9.70±1.54)%] percentage was elevated (P < 0.05), while CD56dimCD16+NK percentage [(71.22±13.03)% vs (87.64±7.05)%, P < 0.01] was reduced in MRSA sepsis. NK cells recognized and killed target cells via different receptors upon activation. CD107a [(33.55±3.84)% vs (25.34±6.20)%] and CD69 percentage [(14.96±1.47)% vs(18.80±1.49)%] was decreased (P < 0.0001), while CD16 MFI was increased [(247.1±50.31) vs (189.4±57.54), P < 0.01] in MRSA sepsis patients in comparison with healthy controls. MMP-1/2/3/9 mRNA relative levels were elevated in purifi ed NK cells from MRSA sepsis patients (P < 0.01). Inhibition of MMP in NK cells from MRSA sepsis patients promoted CD107a percentage [(33.67±8.03)% vs (25.87±6.23)%, P=0.018]. Conclusion NK cell subsets imbalance and exhaustion is existed in MRSA sepsis, which might be due to the MMP-induced down-regulation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Key words: Methicillin-resistant staphylococcus aureus    infection    Sepsis    Natural killer cells    Matrix metalloproteinase    Innate immune    Immunoregulation    Immune tolerance    

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistant staphylococcus aureus, MRSA)是重症监护病房中感染率极高的一种革兰氏阳性球菌。近十年来社区获得性MRSA的感染率日益升高,甚至出现了对万古霉素耐药的菌株,给MRSA的治疗带来了新的挑战[1]。绝大多数重症感染患者存在免疫麻痹或免疫功能衰竭,因此,免疫调节治疗已成为重症感染治疗的研究热点[2-3]。自然杀伤(natural killer, NK)细胞是固有免疫的重要成员之一,可通过分泌细胞因子和抗体依赖性细胞介导的毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)发挥细胞杀伤作用[4]。多种因素(如:病原微生物感染、肿瘤、怀孕等)均可诱导NK细胞表型和功能的改变[5-6],研究发现,基质金属蛋白酶(matrix met alloproteinase, MMP)可诱导人类免疫缺陷病毒感染者NK细胞功能障碍,促进感染慢性化[7]。但有关NK细胞及其调控因素在MRSA脓毒症中作用的研究较少。因此,本研究观察MRSA脓毒症患者外周血NK细胞亚群和功能的变化,探讨MMP对MRSA脓毒症患者NK细胞功能的影响,以期阐释NK细胞在MRSA脓毒症中发挥的作用,为MRSA脓毒症免疫疗法的研发提供实验依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年6月新乡医学院第一附属医院感染疾病科三病区收治的的MRSA脓毒症患者21例,男性17例,女性4例,年龄范围23~61岁,所有患者两套血培养均提示MRSA感染。罹患基础疾病中,重症肺炎14例(其中呼吸机相关肺炎9例)、肝衰竭4例(均为药物性肝损害)、中枢神经系统感染2例、蜂窝织炎1例。纳入标准:(1)年龄18 ~ 65岁;(2)获得知情同意。排除标准:(1)血培养提示合并其他细菌感染;(2)合并慢性病毒感染;(3)合并恶性肿瘤。同时入组年龄和性别相匹配的健康志愿者11例作为对照(normal control, NC),男性8例,女性3例,年龄范围27 ~ 50岁。本研究方案通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会审核通过,所有研究对象及其法定委托人签署知情同意书。

1.2 主要仪器、试剂和细胞

FACS Aria Ⅱ流式细胞(美国BD公司);实时定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)。淋巴细胞分离液(自美国Sigma公司);NK细胞分选试剂盒(德国美天旎公司);抗人CD3-APCCy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7、抗人CD69-FITC、抗人CD107aPE-Cy5(美国BD公司);抗人CD16-PE Texas Red(美国Invitrogen公司);P815抗体(P815-Ab)(美国Accurate公司);RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(美国Thermo公司);MMP抑制剂GM6001(美国Gallardin公司)。人EB病毒转染的B淋巴细胞系721.221细胞、人高度低分化红白血病细胞系K562细胞、小鼠淋巴母细胞样肥大细胞瘤细胞系P815细胞由新乡医学院第一附属医院中心实验室保存,使用RPMI 1640培养液+10 %胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)于37℃、5%CO2孵箱中无菌培养。

1.3 研究方法 1.3.1 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分离

清晨、空腹抽取患者和健康志愿者10 mL EDTA抗凝外周血。立即使用淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMC,冻存于液氮中备用。

1.3.2 NK细胞亚群分析

复苏PBMC,于37℃、5%CO2孵箱中培养2 h,转入FACS管中,PBS洗涤后加入抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7和抗人CD16- PE Texas Red各5 μL,于4℃避光孵育20 min,PBS洗涤后加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定,FACS Aria Ⅱ流式细胞仪分析,CellQuest Pro软件获取细胞,FlowJo 8.6.2软件分析结果。

1.3.3 NK细胞功能测定

721.221细胞表达MHC-Ⅱ类分子,不表达MHC-Ⅰ类A、B、C分子,NK细胞可结合表面细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptor, NCR;即:NKp30、NKp44、NKp46)识别721.221细胞,评估NK细胞NCR识别的限制杀伤作用;K562细胞MHC-Ⅰ类分子表达降低,NK细胞可结合其表面NKG2D受体识别K652细胞,评估NK细胞NKG2D识别的限制杀伤作用;P815细胞不表达NK细胞受体的配体,无法被NK细胞识别和杀伤,但结合其特异性兔抗鼠多克隆抗体P815-Ab,则可被NK细胞表面CD16(FcγⅢ A)所识别,评估NK细胞的ADCC功能。取含有106个P815的细胞悬液1 mL,加入P815-Ab 10 μL,于37℃、5%CO2孵箱中培养1 h,洗涤2次后调整细胞浓度至106个/mL,另取含有106个721.221细胞、K562细胞和P815细胞各1 mL备用。向每管无菌FACS管中加入含有106个PBMC 1 mL,加入抗人CD107a-PE-Cy5各20 μL和终浓度为10 μg/mL的布雷非德菌素A,并分别加入准备好的靶细胞悬液100 μL(效应细胞/靶细胞=10: 1),充分混匀后于37℃、5% CO2孵箱中培养4 h。洗涤后加入抗人CD3-APC-Cy7、抗人CD14-APC-Cy7、抗人CD19-APC-Cy7、抗人CD56 -PE-Cy7、抗人CD16- PE Texas Red和抗人CD69-FITC各5 μL,于4℃避光孵育20 min,使用PBS洗涤后,加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定,FACS Aria Ⅱ流式细胞仪分析,CellQuest Pro软件获取细胞,FlowJo 8.6.2软件分析结果。

1.3.4 NK细胞分选

选择9例MRSA脓毒症患者和7例NC,取2×107个复苏的PBMC,离心后加入80 μL NK细胞分离缓冲液重悬细胞,混匀后加入20 μL NK细胞生物素抗体混合物,混匀后于4℃孵育5 min,然后加入60 μL缓冲液和40 μL NK细胞磁珠混合物,混匀后于4℃孵育10 min,加入缓冲液,调整总体积至500 μL。将吸附柱置于MACS磁力分离架上,加入500 μL分离缓冲液预混,将上述细胞悬液加入预混的吸附柱中,收集吸附柱中流出的未标记细胞,即为富集的NK细胞。

1.3.5 实时定量PCR检测NK细胞中MMP mRNA

取105个分选的NK细胞,提取总RNA,取1 μg总RNA,建立如下反转录反应体系:总RNA 1 μg、Oligo(dT)引物1 μL、5×First Strand缓冲液4 μL、DDT(0.1 mol/L)1 μL、RNase抑制剂1 μL、dNTP 1 μL、RevertAid M-MulV反转录酶1 μL,加入DEPC处理ddH2O调整总体积至20 μL,反应条件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,产物cDNA立即进行PCR。实时定量PCR反应体系:cDNA 1 μL、上游引物(10 μmol/L)0.25 μL、下游引物(10 μmol/l)0.25 μL、2×qPCR Mix 12.5 μL、ddH2O 11 μL,反应条件:95℃预变性10 min,然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,共40个循环。引物序列如前所述[7],采用2-ΔΔCT法、以GAPDH为内参照,检测NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9 mRNA相对表达量。

1.3.6 抑制MMP对NK细胞功能影响的检测

取纯化的NK细胞,加入含IL-2(终浓度为50 U/ mL)的RPMI1640+10%FBS培养,设立2个复孔,其中一个复孔加入MMP抑制剂GM6001(终浓度为10 μmol/L),另一复孔加入等量培养液,刺激培养12 h后与721.221细胞、K562细胞、P815细胞、P815-Ab细胞共培养,检测CD107a水平,评估NK细胞的功能。

1.4 统计学方法

使用SPSS 21.0软件进行数据分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对标本的正态性进行分析,所有样本均符合正态分布,计量资料使用均数±标准差(Mean±SD)表示,采用成组t检验对两组数据进行分析,采用配对t检验对GM6001刺激前后的数据进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 NK细胞亚群在MRSA脓毒症中的变化

根据FCS和SSC对PBMC进行圈门,然后阴性选择CD3/CD14/CD19-APC-Cy7标记的细胞,排除T细胞、单核细胞和B细胞,然后根据CD16和CD56的表达水平,将NK细胞分为CD56brightCD16-、CD56-CD16+和CD56 -CD16+三个亚群,NC和MRSA脓毒症患者中NK细胞亚群典型流式散点图见图 1。总NK细胞占PBMC的比例在NC和MRSA脓毒症患者中的差异无统计学意义,见表 1。CD56brightCD16-NK细胞比例在MRSA脓毒症患者中较NC升高(表 1),CD56-CD16+NK细胞比例在MRSA脓毒症患者中较NC降低(表 1),CD56 -CD16+NK细胞比例在MRSA脓毒症中较NC亦升高,见表 1

图 1 健康对照者和MRSA脓毒症患者中NK细胞亚群分析的典型流式散点图 Fig 1 Representative fl ow dots analysis for NK cell subsets in healthy control (NC) and MRSA sepsis patients

表 1 健康对照者和MRSA脓毒症患者外周血NK细胞亚群比例的比较 Table 1 Comparison of peripheral NK cell subsets percentage between healthy control (NC) and MRSA sepsis patients
指标 NC (n=11) MRSA脓毒症(n=21) t P
总NK细胞占PBMC (%) 13.38±3.03 11.72±2.23 1.771 0.087
CD56brightCD16- NK细胞(%) 5.36±1.02 4.30±0.89 2.903 0.0069
CD56dimCD16+ NK细胞(%) 71.22±13.03 87.64±7.05 3.872 0.0005
CD56-CD16+ NK细胞(%) 24.04±2.92 9.70±1.54 15.15 < 0.0001
2.2 MRSA脓毒症患者NK细胞功能的变化

分别以721.221细胞、K562细胞和P815-Ab细胞为靶细胞,检测NK细胞通过NCR、NKG2D和CD16(即ADCC)介导的细胞毒性作用。NK细胞受刺激活化后,细胞表面CD107a(脱颗粒释放穿孔素、颗粒酶的标志)和CD69(活化标志)均显著升高,但CD16表达水平下调(图 2)。MRSA脓毒症患者的NK细胞通过NCR、NKG2D及CD16介导的识别和杀伤相应靶细胞系后,CD107a比例较NC降低(表 2)。进一步对NK细胞ADCC功能相关标志物进行检测发现,P815-Ab细胞刺激后,NK细胞表面CD69比例在MRSA脓毒症患者较NC降低(表 2),而CD16平均荧光强度(mean fl uorescence intensity, MFI)在MRSA脓毒症中较NC升高,见表 2

图 2 健康对照者和MRSA脓毒症患者NK细胞活化后CD107a、CD69和CD16的典型流式分析图 Fig 2 Representative fl ow analysis of CD107a, CD69, and CD16 expression in activated NK cells in healthy control (NC) and MRSA sepsis patients

表 2 健康对照者和MRSA脓毒症患者NK细胞活化后CD107a、CD69和CD16的比较 Table 2 Comparison of CD107a, CD69, and CD16 in activated NK cells between healthy control (NC) and MRSA sepsis patients
指标 NC (n=11) MRSA脓毒症(n=21) t P
CD107a (与721.221细胞共培养) (%) 18.64±1.64 14.85±1.24 7.371 < 0.0001
CD107a (与K562细胞共培养) (%) 19.49±1.58 14.46±0.79 12.12 < 0.0001
CD107a (与P815-Ab细胞共培养) (%) 33.44±3.84 25.34±6.20 3.995 0.0004
CD69 (与P815-Ab细胞共培养) (%) 18.80±1.49 14.96±1.47 7.010 < 0.0001
CD16 MFI (与P815-Ab细胞共培养) 189.4±57.54 247.1±50.31 2.933 0.0064
2.3 MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP mRNA相对表达量的变化

分选9例MRSA脓毒症患者和7例健康志愿者的NK细胞,检测NK细胞中MMP mRNA的相对表达量。MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA相对表达量均较NC升高(表 3),而NK细胞中MMP-7 mRNA相对表达量在NC和MRSA脓毒症患者中的差异无统计学意义,见表 3

表 3 健康对照者和MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP mRNA相对表达量的比较 Table 3 Comparison of MMP mRNA relative level in NK cells between healthy control (NC) and MRSA sepsis patients
指标 NC (n=7) MRSA脓毒症(n=9) t P
MMP-1 mRNA 1.04±0.22 4.26±1.12 7.405 < 0.0001
MMP-2 mRNA 1.04±0.12 4.93±1.34 7.610 < 0.0001
MMP-3 mRNA 0.89±0.19 9.89±2.35 10.02 < 0.0001
MMP-7 mRNA 1.01±0.12 0.98±0.12 0.404 0.693
CMMP-9 mRNA 1.04±0.17 23.56±3.88 15.23 < 0.0001
2.4 抑制MMP对MRSA脓毒症患者NK细胞功能的影响

取9例MRSA脓毒症患者分选的NK细胞,加入MMP抑制剂GM6001刺激培养后分别与721.221细胞、K562细胞和P815-Ab细胞为靶细胞共培养。抑制MMP后NK细胞对721.221细胞和K562细胞杀伤功能无明显变化,CD107a比例差异无统计学意义(表 4),而抑制MMP后NK细胞对P815-Ab细胞的杀伤作用增强,CD107a比例升高(表 4)。

表 4 抑制MMP对MRSA脓毒症患者NK细胞CD107a表达的影响 Table 4 Influence of MMP inhibition to CD107a expression on NK cells in MRSA sepsis patients
指标 无GM6001刺激 经GM6001刺激 t p
CD107a (与721.221细胞共培养) (%) 14.55±1.64 14.61±2.71 0.081 0.937
CD107a (与K562细胞共培养) (%) 14.34±0.91 14.59±2.63 0.280 0.786
CD107a (与P815-Ab细胞共培养) (%) 25.87±6.23 33.67±8.03 2.962 0.018
3 讨论

NK细胞根据CD16和CD56表达水平可分为CD56brightCD16-、CD56dimCD16+和CD56 -CD16+三个亚群。CD56brightCD16-NK细胞主要分泌干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等多种细胞因子,参与机体免疫调控[8];CD56dimCD16+NK细胞是成熟的、具有细胞毒性的亚群,通过CD16发挥ADCC作用,杀伤靶细胞[9];CD56 -CD16+NK细胞是失能NK细胞,增殖能力低下,分泌细胞因子和细胞毒性作用均显著降低[10]。本研究发现,MRSA脓毒症患者中总NK细胞比例无明显变化,细胞毒性CD56dimCD16+NK细胞显著减少,而失能的CD56 -CD16+NK细胞和分泌细胞因子的CD56brightCD16-NK细胞均显著增多,这与既往研究发现的脓毒症患者NK细胞比例升高的结果并不完全一致[11-12]。而在新生儿脓毒症和动物模型中,CD56dimCD16+NK细胞的比例在急性期显著降低[13-14],这与本研究结果相似。更为重要的是,失能的CD56 -CD16+NK细胞在MRSA脓毒症中显著升高,与在慢性病毒感染中的研究结果一致[7, 15]。本研究结果提示MRSA感染可能通过改变NK细胞亚群分布,使CD56表达进一步降低,实现CD56dim亚群向CD56 -亚群的转化[16],导致NK细胞亚群失衡,降低细胞毒性,促进MRSA脓毒症的发生发展。但分泌细胞因子的CD56brightCD16- NK细胞升高,其在MRSA脓毒症中的作用尚有待进一步研究。

NK细胞接受MHC-Ⅰ类分子缺陷的721.221细胞、K562细胞及抗体包被的P815细胞刺激后,可分别通过NCR、NKG2D及CD16途径发挥细胞毒性作用[17]。NK细胞活化后,细胞表面脱颗粒标志物CD107a和活化标志CD69表达上调,而介导ADCC作用的CD16在发挥细胞毒性作用时表达下调,与细胞活化和脱颗粒同步[7]。本研究发现,MRSA脓毒症患者的NK细胞在活化后CD107a和CD69的表达均较NC降低,但CD16表达上调,这提示MRSA脓毒症患者NK细胞通过NCR、NKG2D及CD16途径发挥细胞毒性的功能存在明显异常,进一步提示MRSA脓毒症患者中存在NK细胞功能衰竭,难于清除细菌感染,促进疾病进展。

MMP是一种锌依赖性的内肽酶家族成员,其水解底物为细胞外基质成分,在多种病毒、细菌感染及肿瘤中的表达上调,参与疾病发生发展。在结肠癌患者中,MMP-9在促血管生成的蜕膜NK样细胞中的表达上调。在胃癌患者中,抑制MMP活性可重建NKG2D表达,提高NK细胞的杀伤敏感性。人类免疫缺陷病毒感染者NK细胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高,抑制MMP活性增加NK细胞CD16的表达,促进NK细胞介导的ADCC功能[7]。本研究亦发现,MRSA脓毒症患者NK细胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA表达上调,抑制MMP后可增强NK细胞的ADCC作用,介导P815-Ab细胞杀伤,但对NCR和NKG2D介导的细胞杀伤无显著影响,提示MMP可能主要通过影响NK细胞的ADCC作用发挥免疫调控功能。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突

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