2023, Vol. 32
2. 武汉市第四医院心胸外科，武汉 430033
肺缺血-再灌注损伤病理变化表现为肺泡-毛细血管网状结构通透性增高，间质水肿及炎性细胞浸润、肺泡上皮细胞损伤凋亡，最终导致肺水肿、通气/换气功能障碍，其发病机制可能与炎性介质释放增加等因素相关[1-2]。目前对肺缺血-再灌注损伤的药物防治研究多集中于“预防作用”即在缺血期前给药，然而临床上许多患者肺组织缺血状况难以预知，再灌注时间窗也难以把握，时常需面对休克、心肺复苏、肺栓塞等危重症救治过程中已经发生肺缺血-再灌注损伤的病理生理状态，因此药物缺血后处理在实践中更具操作性和临床价值，然而目前此类研究报道甚少。Nrf2是一种重要的氧化—还原反应敏感转录因子，通过调节下游抗氧化剂如HO-1等来维持细胞氧化—还原反应稳态。HO-1可调节氧化还原反应，防止过度氧化应激诱导的细胞损伤。AMPK是一种AMP依赖性蛋白激酶，AMPK的激活涉及众多信号通路，在生物能量代谢的调节中起着关键分子的作用。既往研究发AMPK/Nrf2/HO-1信号通路在肺部氧化应激性疾病发挥重要作用[3-4]，而本课题组研究亦表明Nrf2/HO-1信号通路在抑制肺组织过度氧化应激反应、减轻肺缺血-再灌注损伤方面发挥重要作用[5]。近期研究发现特异性阿片类药物拮抗剂纳曲酮（纳美芬的结构类似物）可通过增加Nrf-2蛋白水平和抗氧化酶来减轻肝组织损害 [6]，而本课题组相关研究亦发现在再灌注损伤早期阿纳美芬可通过抑制肺组织阿片肽类受体表达而减轻肺缺血-再灌注损伤[7]。纳美芬缺血后处理能否通过调节AMPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥减轻肺缺血-再灌注损伤作用，是否具有时间-效应性特点，是否存在有效给药时间窗口（即超过某一给药时间点无治疗效果），改变给药剂量能否改变有效给药时间窗，目前国内外尚无此类研究报道。因此本研究将纳美芬应用于大鼠肺缺血-再灌注损伤模型缺血后处理，探讨纳美芬通过AMPK/Nrf2/HO-1信号通路减轻肺缺血-再灌注损伤的作用和时间-效应性特点。
1 材料与方法 1.1 实验动物及主要药物、试剂清洁级雄性SD大鼠60只，动物许可证号：SCXK（鄂）2010-0009，体重（200±50）g，购自同济医学院动物实验中心，在洁净动物饲养室内自由摄食、饮水。饲养室温度保持在20~25℃，相对湿度保持在50%~70%。本研究中关于动物的饲养、处置和操作符合本院关于动物实验福利与伦理的要求。盐酸纳美芬注射液 (商品名：乐萌)，成都天台山制药有限公司产品，规格：1 mL: 0.1 mg。批准文号：国药准字H20080645。批号：11210502161。AMPK抑制剂（化合物C，Compound C）以及ML385（Nrf2特异性抑制剂），美国Selleck有限公司。Trizo试剂，美国Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒，大连Takara公司。兔抗大鼠AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1、LaminB1（Nrf2内参照）、GAPDH（AMPK、p-AMPK、HO-1内参照）单克隆抗体，美国Santa Cruz公司。MDA、SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所。BCA试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒, 武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 动物模型建立、分组与给药将90只大鼠随机（采用随机数字表法）均分为9组，每10只。实验一：重点探讨纳美芬减轻肺缺血-再灌注损伤的作用和时间-效应性特点。①假手术组：只开胸游离左肺门，不行缺血-再灌注处理。②模型组：参考项冰倩等[8]方法开胸游离左肺门后，夹闭左肺门45 min（肺组织由淡红色变成暗紫红色，表明缺血阻断成功）后解除阻断，肺循环再灌注，观察5 min后肺组织膨胀、颜色恢复（表明肺组织循环再灌注成功），继续再灌注至3 h末。③纳美芬A组：于肺循环再灌注前5 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg）[7]，余处理同模型组。④纳美芬B组：于肺循环再灌注后10 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。⑤纳美芬C组：于肺循环再灌注后30 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。⑥纳美芬D组：于肺循环再灌注后60 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。实验二：根据预实验结果发现纳美芬D组中肺缺血-再灌注损伤未见明显减轻，遂于同等实验条件下增加纳美芬E组（第⑦组）实验：于肺循环再灌注后60 min时尾静脉注射纳美芬（30 μg/kg），余处理同模型组。相关实验结果与模型组、纳美芬D组比较，进一步探讨增加纳美芬剂量对有效时间窗的影响。实验三：根据实验一预实验结果，发现纳美芬A组中肺缺血-再灌注损伤减轻程度最为显著，遂于同等实验条件下增加纳美芬F、G组（第⑧⑨组）：于造模前2 h腹腔注射化合物C（20 mg/kg）[9]、ML385（30 mg/kg）[10]，同时在肺循环再灌注前5 min时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。相关实验结果与模型组、纳美芬A组比较，以进一步验证纳美芬缺血后处理能否通过AMPK/Nrf2/HO-1信号通路减轻肺缺血-再灌注损伤。以上各组大鼠于再灌注3 h末处死大鼠，暴露胸腔，留取左肺上叶组织行相关检测。
1.3 大鼠肺组织湿/干重（W/D）测定取左肺上叶组织，以生理盐水冲洗后用滤纸吸干多余水份后称重，计量为湿重（W）；置80℃恒温箱，烘烤72 h至恒重后称重，计量为干重（D）；计算肺组织W/D。
1.4 大鼠肺组织病理学观察将左肺上叶组织置于4%多聚甲醛中固定24 h后切成5 µm的石蜡切片，HE染色后光镜下观察肺组织病理形态变化。肺组织损伤分级评分参考标准[11]：0级（1分），外观正常；1级（2分），轻度的间质充血和中性粒细胞浸润；2级（3分），血管周围水肿形成，肺结构部分破坏，中性粒细胞中度浸润；3级（4分），肺结构完全破坏，肺泡内明显渗出或出血，中性粒细胞致密浸润。每张切片随机选取10个视野评分，取平均值为该标本肺组织损伤评分。
1.5 大鼠肺组织SOD、MDA测定切取大鼠左肺上叶组织相应部位0.5 cm×0.5 cm称重，加入生理盐水，置入匀浆器中在冰水中匀浆制成含量为10%肺组织匀浆，4℃环境下离心后吸取上清液，按照MDA、SOD测定试剂盒提供的方法测定MDA含量和SOD活性。
1.6 大鼠肺组织TNF-α测定左肺上叶组织经生理盐水清洗后以滤纸吸干，剪取50 mg，匀浆器制成10%肺组织匀浆离心后采集上清液，采用ELISA法检测TNF-α水平。
1.7 RT-PCR检测Nrf2mRNA、HO-1mRNA表达用Trizol试剂提取总RNA。RNA浓度用紫外分光光度计检测，260~280 nm处适宜的OD值为1.8~2.0。逆转录反应的总体系为10 mL（1 mg RNA），根据产品说明合成cDNA。PCR引物由中国上海生工生物技术公司合成，序列如下：Nrf2（扩增产物150 bp），正向：5'-CTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC-3'，反5'-TCAGTGCTTCTGGTTGAAAG-3'。HO-1（扩增产物75 bp），正向：5'-TTTCCCCAGTTCTACCAGTGTAA-3'，反向5'-CTCCACCCACTTGTTGCTATTA-3'。GAPDH（内参照，扩增产物143 bp），正向：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，反向：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。反应条件: 95℃预变性10 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s（40个循环），应用2-ΔΔCt法计算各目的基因相对表达水平。
1.8 Western blot检测AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1表达将各组的肺组织均质化(100 mg/份)，按照BCA蛋白定量试剂盒操作提取组织蛋白质, 经蛋白电泳并转膜后室温封闭，再分别以兔抗大鼠AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1单克隆一抗及过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗孵育，用ECL试剂盒发光显影，同时检测LaminB1、GAPDH的表达作为内参对照。采用凝胶图像分析系统检测蛋白质迹条带灰度，测定并计算Nrf2/LaminB1以及AMPK、p-AMPK、HO-1与GAPDH表达灰度的比值。
1.9 统计学方法数据采用SPSS 19.0软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示。用单向方差分析比较组间差异后行LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 组织湿/干重比值在湿/干重比值方面，纳美芬D组检测值与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。纳美芬E组检测值低于模型组、纳美芬D组，差异有统计学意义(P＜0.01)。纳美芬F、G组检测值高于纳美芬A组但低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。小剂量纳美芬缺血后处理（15 μg/kg，下同）各组检测值呈现纳美芬D＞纳美芬C＞纳美芬B＞纳美芬A的特点，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 1、表 2、表 3。
| 组别 | 动物数（n） | 湿/干重比值 | 肺损伤评分 | MDA（nmol/mg） | SOD活性(U/mg) | TNF-α（pg/mL） |
| 假手术组 | 10 | 3.04±0.11a | 1.03±0.05a | 3.35±0.13a | 30.82±1.15a | 15.40±1.25a |
| 纳美芬A组 | 10 | 4.05±0.19acde | 1.78±0.13acde | 6.58±0.67acde | 26.79±1.20acde | 77.62±4.26ace |
| 纳美芬B组 | 10 | 5.27±0.20acd | 2.28±0.18acd | 8.96±1.05acd | 21.89±1.23acd | 118.46±8.35acd |
| 纳美芬C组 | 10 | 6.89±0.23ac | 3.01±0.15ac | 13.69±1.13ac | 17.62±1.26ac | 417.52±13.31ac |
| 纳美芬D组 | 10 | 8.75±0.26b | 3.90±0.12b | 15.28±1.25b | 11.18±1.27b | 760.83±22.25b |
| 模型组 | 10 | 8.98±0.25 | 3.98±0.04 | 15.37±1.17 | 10.82±1.22 | 775.82±11.30 |
| F值 | 1435.00 | 921.3 | 260.60 | 447.90 | 8011.00 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01，bP＞0.05；与纳美芬D组比较，cP＜0.01；与纳美芬C组比较，dP＜0.01；与纳美芬B组比较，e P＜0.01 | ||||||
| 组别 | 动物数（n） | 湿/干重比值 | 肺损伤评分 | MDA（nmol/mg） | SOD活性(U/mg) | TNF-α（pg/mL） |
| 纳美芬F组 | 10 | 6.95±0.16ac | 3.07±0.15ac | 13.73±1.27ac | 16.82±1.24ac | 425.57±15.32ac |
| 纳美芬G组 | 10 | 6.84±0.18ac | 3.02±0.17ac | 15.30±1.19bc | 10.86±1.18bc | 420.26±14.21ac |
| 纳美芬A组 | 10 | 4.05±0.19 | 1.78±0.13 | 6.58±0.67 | 26.79±1.20 | 77.62±4.26 |
| 模型组 | 10 | 8.98±0.25 | 3.98±0.04 | 15.37±1.17 | 10.82±1.22 | 775.82±11.30 |
| F值 | 1092 | 467.1 | 143.5 | 330.9 | 5583 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 |
| 组别 | 动物数（n） | 湿/干重比值 | 肺损伤评分 | MDA（nmol/mg） | SOD活性(U/mg) | TNF-α（pg/mL） |
| 纳美芬E组 | 10 | 6.86±0.21ab | 3.00±0.12ab | 13.59±1.15ab | 17.12±1.23ab | 416.86±13.82ab |
| 纳美芬D组 | 10 | 8.75±0.26 | 3.90±0.12 | 15.28±1.25 | 11.18±1.27 | 760.83±22.25 |
| 模型组 | 10 | 8.98±0.25 | 3.98±0.04 | 15.37±1.17 | 10.82±1.22 | 775.82±11.30 |
| F值 | 241.90 | 291.7 | 240.50 | 81.97 | 1646 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01；与纳美芬D组比较，bP＜0.01 | ||||||
假手术肺组织结构完整清晰，未见明显组织损伤。模型组、纳美芬A、B、C、D、E、F、G组均可见不同程度的肺泡间隔破坏，部分肺泡萎陷，肺间质水肿明显、见炎症细胞浸润和红细胞渗出。在肺组织损伤评分方面，模型组评分高于假手术组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。纳美芬D组评分与模型组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。纳美芬E组评分低于模型组、纳美芬D组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。纳美芬F、G组评分高于纳美芬A组但低于模型组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。小剂量纳美芬缺血后处理各组评分呈现纳美芬D＞纳美芬C＞纳美芬B＞纳美芬A的特点(P＜0.01)，差异有统计学意义(均P＜0.01)。见表 1、表 2、表 3、图 1。
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| 图 1 各组大鼠肺组织病理变化（HE×400) |
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与模型组比较，纳美芬D组TNF-α、MDA含量和SOD活性水平差异无统计学(均P＞0.05)；与模型组、纳美芬D组比较，纳美芬E组TNF-α、MDA含量下降，SOD活性水平增高，差异有统计学意义(均P＜0.01)。与纳美芬A组比较，纳美芬F、G组TNF-α、MDA含量增高，SOD活性降低，差异有统计学意义(均P＜0.01)；与模型组比较，纳美芬F组TNF-α、MDA含量降低，SOD活性增高，差异有统计学意义(均P＜0.01)。与模型组比较，纳美芬G组TNF-α含量降低，差异有统计学意义(均P＜0.01)，然而MDA含量、SOD活性差异均无统计学意义(均P＞0.05)。小剂量纳美芬缺血后处理各组MDA表达呈现纳美芬D＞纳美芬C＞纳美芬B＞纳美芬A特点，SOD活性水平呈现纳美芬A＞纳美芬B＞纳美芬C＞纳美芬D特点，差异有统计学意义(均P＜0.01)。见表 1、表 2、表 3。
2.4 Nrf2mRNA、HO-1mRNA表达水平纳美芬D组各检测值与模型组比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。纳美芬E组各检测值均高于模型组、纳美芬D组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。纳美芬F组各检测值低于纳美芬A组但高于模型组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。纳美芬G组各检测值低于纳美芬A组，差异有统计学意义(均P＜0.01)；与模型组比较时，各检测值差异均无统计学意义(均P＞0.05)。小剂量纳美芬缺血后处理各组相应检测值呈现纳美芬A＞纳美芬B＞纳美芬C＞纳美芬D的特点，差异有统计学意义(均P＜0.01)。见表 4、表 5、表 6。
| 组别 | 动物数（n） | Nrf2mRNA | HO-1mRNA |
| 假手术组 | 10 | 1.02±0.04a | 1.06±0.06a |
| 纳美芬A组 | 10 | 4.93±0.12acde | 5.92±0.13acde |
| 纳美芬B组 | 10 | 3.90±0.16acd | 4.88±0.12acd |
| 纳美芬C组 | 10 | 2.86±0.13ac | 3.69±0.13ac |
| 纳美芬D组 | 10 | 1.80±0.15b | 2.76±0.14b |
| 模型组 | 10 | 1.78±0.08 | 2.70±0.10 |
| F值 | 1481 | 2258 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01，bP＞0.05；与纳美芬D组比较，cP＜0.01；与纳美芬C组比较，dP＜0.01；与纳美芬B组比较，eP＜0.01 | |||
| 组别 | 动物数（n） | Nrf2mRNA | HO-1mRNA |
| 纳美芬F组 | 10 | 2.83±0.15ac | 3.65±0.14ac |
| 纳美芬G组 | 10 | 1.82±0.12bc | 2.75±0.12bc |
| 纳美芬A组 | 10 | 4.93±0.12 | 5.92±0.13 |
| 模型组 | 10 | 1.78±0.08 | 2.70±0.10 |
| F值 | 1591 | 1474 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 |
| 组别 | 动物数（n） | Nrf2mRNA | HO-1mRNA |
| 纳美芬E组 | 10 | 2.67±0.16ab | 3.50±0.15ab |
| 纳美芬D组 | 10 | 1.80±0.15 | 2.76±0.14 |
| 模型组 | 10 | 1.78±0.08 | 2.70±0.10 |
| F值 | 141.0 | 119.7 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01；与纳美芬D组比较，bP＜0.01 | |||
各组大鼠AMPK表达水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)。与模型组比较，纳美芬D组p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)。纳美芬E组p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平均高于模型组、纳美芬D组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。与模型组比较，纳美芬F组p-AMPK、p-AMPK/AMPK表达水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)；Nrf2、HO-1表达水平增高，差异有统计学意义(均P＜0.01)。纳美芬F组p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平低于纳美芬A组，差异有统计学意义(均P＜0.01)。与模型组比较，纳美芬G组p-AMPK、p-AMPK/AMPK表达水平增高，差异有统计学意义(均P＜0.01)。；Nrf2、HO-1表达水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)。与纳美芬A组比较，纳美芬G组p-AMPK、p-AMPK/AMPK水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)，Nrf2、HO-1表达水平降低，差异有统计学意义(均P＜0.01)。小剂量纳美芬缺血后处理各组p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平呈现纳美芬A＞纳美芬B＞纳美芬C＞纳美芬D的特点，差异有统计学意义(均P＜0.01)。见表 7、表 8、表 9。
| 组别 | 动物数（n） | p-AMPK | p-AMPK/AMPK | Nrf2 | HO-1 |
| 假手术组 | 10 | 0.30±0.02a | 0.12±0.03a | 0.36±0.03a | 0.39±0.06a |
| 纳美芬A组 | 10 | 2.98±0.15acde | 0.83±0.12acde | 3.09±0.12acde | 3.68±0.15acde |
| 纳美芬B组 | 10 | 2.27±0.14acd | 0.66±0.14acd | 2.18±0.13acd | 2.76±0.13acd |
| 纳美芬C组 | 10 | 1.58±0.12ac | 0.39±0.12ac | 1.37±0.11ac | 1.65±0.14ac |
| 纳美芬D组 | 10 | 0.79±0.11b | 0.27±0.13b | 0.72±0.10b | 0.81±0.11b |
| 模型组 | 10 | 0.78±0.06 | 0.25±0.11 | 0.70±0.04 | 0.79±0.05 |
| F值 | 867.5 | 58.16 | 1154 | 1253 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01，bP＞0.05；与纳美芬D组比较 cP＜0.01；与纳美芬C组比较，dP＜0.01；与纳美芬B组比较，e P＜0.01 | |||||
| 组别 | 动物数（n） | p-AMPK | p-AMPK/AMPK | Nrf2 | HO-1 |
| 纳美芬F组 | 10 | 0.82±0.10bc | 0.27±0.13bc | 1.32±0.12ac | 1.61±0.15ac |
| 纳美芬G组 | 10 | 2.95±0.16ac | 0.82±0.13ac | 0.73±0.05bc | 0.81±0.06bc |
| 纳美芬A组 | 10 | 2.98±0.15 | 0.83±0.12 | 3.09±0.12 | 3.68±0.15 |
| 模型组 | 10 | 0.78±0.06 | 0.25±0.11 | 0.70±0.04 | 0.79±0.05 |
| F值 | 1032 | 69.8 | 1578 | 1422 | |
| P值 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01, bP＞0.05；与纳美芬A组比较 cP＜0.01 | |||||
| 组别 | 动物数（n） | p-AMPK | p-AMPK/AMPK | Nrf2 | HO-1 |
| 纳美芬E组 | 10 | 1.63±0.14ab | 0.43±0.15ab | 1.29±0.12ab | 1.56±0.13ab |
| 纳美芬D组 | 10 | 0.79±0.11 | 0.27±0.13 | 0.72±0.10 | 0.81±0.11 |
| 模型组 | 10 | 0.78±0.06 | 0.25±0.11 | 0.70±0.04 | 0.79±0.05 |
| F值 | 210.5 | 5.3 | 129.3 | 185.3 | |
| P值 | ＜0.001 | 0.0115 | ＜0.001 | ＜0.001 | |
| 注：与模型组比较，aP＜0.01；与纳美芬D组比较，bP＜0.01 | |||||
氧化应激已被认为是缺血-再灌注损伤诱导的器官损伤发展的重要机制[12]。再灌注将激活有氧代谢的恢复，并导致活性氧超载。强烈的活性氧生成会产生过多的羟基自由基，此类自由基可破坏细胞膜上的酶或通道蛋白。高肺液含量是急性肺损伤的重要特征，因而本研究中通过湿/干重比和肺组织病理评分来评估肺组织损伤程度，结果显示肺组织缺血-再灌注后出现过度的氧化应激反应和严重肺组织损伤，表现为肺组织MDA含量显著增加，SOD活性显著降低、湿/干重比值显著增高。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗可显著减少肺组织MDA生成，增强SOD活性、显著降低湿/干重比、减轻肺组织病理损伤，提示纳美芬可能通过抑制过度氧化应激反应来减轻肺组织缺血-再灌注损伤。
生理状态下Nrf-2位于细胞浆内，与细胞质接头蛋白(Kelch-like ECH associatingprotein1，Keap-1) 结合形成复合物，处于相对抑制状态，当发生氧化应激反应时，Nrf2将与Keap1解除偶联转移进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant responseelement，ARE)结合，启动一系列抗氧化基因，如HO-1、NQO1等的表达。Nrf-2是重要的内源性抗氧化应激调节因子之一，是决定细胞内源性抗损伤能力的关键转录因子，而Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化应激的关键通路[13]。最新研究表明AMPK激活可以增强Nrf2的核转位，从而提高HO-1表达水平[14]。Nrf2/HO-1信号通路表达与肺组织中氧化应激及病理损伤程度密切相关。在Nrf2诱导的抗氧化酶中，HO-1在氧化应激刺激后最易诱导表达[15]。研究表明活化的HO-1通路可能对肢体缺血-再灌注后的肺损伤产生保护作用[16]。Nrf2/HO-1信号轴活化时可减少铁死亡并改善由肺缺血-再灌注损伤引起的细胞线粒体功能障碍[17]。
本研究结果发现模型组肺组织缺血-再灌注后出现明显病理损伤，肺组织中p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达显著升高，既往相关研究亦出现类似结果[18-19]，考虑为短时间内（如3h内）病理性氧化应激因素造成氧化-还原平衡因素失衡，促进AMPK磷酸化（p-AMPK表达增加），刺激部分保护性的Nrf2表达增加，进而促进HO-1表达增加。在再灌注前5 min、再灌注后10 min、30 min等不同时间点给药时，随着肺组织p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达增高，病理损伤及氧化应激程度随之相应减轻，其中以再灌注前5 min给予纳美芬治疗时p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达增高水平及肺组织病理损伤、氧化应激减轻程度最为显著，提示纳美芬缺血后处理对肺组织缺血-再灌注损伤的抗氧化保护作用与AMPK/Nrf2/HO-1信号通路的激活密切相关。为验证纳美芬缺血后处理对肺组织缺血-再灌注损伤的抗氧化保护作用是否依赖于AMPK信号通路的激活，在再灌注前5 min给药基础上加用化合物C（AMPK抑制剂）处理，结果显示纳美芬对Nrf2、HO-1和氧化应激标志物的保护性调节作用被化合物C部分阻断（纳美芬F组检测值与模型组、纳美芬A组比较差异显著），提示纳美芬对Nrf2/HO-1信号通路作用不完全依赖于AMPK信号的活化，可能存在通过其他信号分子来激活Nrf2/HO-1信号通路。进一步研究发现纳美芬减轻肺组织缺血-再灌注损伤程度的作用可被化合物C部分逆转，提示纳美芬缺血后处理对肺组织缺血-再灌注损伤的保护作用至少部分与AMPK信号的激活相关。
为进一步验证纳美芬缺血后处理对肺组织缺血-再灌注损伤的抗氧化保护作用是否依赖于Nrf2/HO-1信号通路的激活，本研究在再灌注前5 min给药基础上加用ML385（Nrf2特异性转录抑制剂）处理，结果显示纳美芬对Nrf2、HO-1和氧化应激标志物（MDA、SOD）的保护性调节作用被ML385完全阻断，提示纳美芬对肺组织缺血-再灌注损伤的抗氧化保护作用依赖于Nrf2信号的激活。进一步研究发现纳美芬减轻肺组织缺血-再灌注损伤程度的作用可被ML385部分逆转，提示纳美芬缺血后处理对肺组织缺血-再灌注损伤的保护作用至少部分与Nrf2的激活相关。至于纳美芬减轻肺组织缺血-再灌注损伤程度作用未被ML385完全逆转的原因，本研究发现在纳美芬A、B、C、E、F、G组治疗时，随着肺组织损伤程度的逐步降低，TNF-α水平亦逐步降低，而TNF-α作为关键的促炎因子，其表达水平可间接反映炎症反应严重程度[20]，提示纳美芬亦可通过其他途径抑制炎症反应减轻肺组织缺血-再灌注损伤程度，此结果与既往国内外相关研究结论相一致[21]，表明纳美芬减轻肺缺血-再灌注损伤的作用机制存在多样性，抗氧化保护作用可能只是其中机制之一。
临床上除在器官移植方面外，器官缺血的发生常不可预知，在心肺复苏的等病理生理过程再灌注的发生时间窗也很难把握，因而目前在防治器官缺血-再灌注损伤时缺血前处理在实践中应用受限，缺血后处理（如药物治疗）却具有简单方便、操作性好的特点。既往研究表明在不同的器官或动物，缺血后处理均能表现出对再灌注器官的保护效应，但缺血后处理有特定的时间窗和保护条件[22-23]，本研究也结果提示纳美芬减轻肺组织缺血-再灌注损伤可能存在时间-效应性特点。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min时给予纳美芬治疗均能显著升高p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平、减轻肺组织氧化应激水平及病理损伤程度，但肺组织氧化应激水平及病理损伤程度呈现为：再灌注前5 min＜再灌注后10 min＜再灌注后30 min，提示肺组织缺血-再灌注损伤时尽早给予纳美芬治疗可提高治疗效果，虽然再灌注前治疗效果强于再灌注后治疗，但再灌注后治疗在一定时间范围内依然有效。值得注意的是，在再灌注后60 min时给予同等剂量（15 μg/kg）纳美芬治疗，肺组织中p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平及肺组织氧化应激水平及病理损伤程度与模型组并无显著差别，提示纳美芬可能在有效给药时间上存在特定的时间窗口（即超过某一给药时间点无治疗效果）。推测此现象可能原因为随着再灌注后时间延长，肺组织炎症反应逐步加重，很可能在某一时间临界点触发“炎症因子风暴”等局部炎症过程，此时在某一剂量下的纳美芬治疗难以逆转过度氧化应激发展的进程。正如既往研究结论指出，肺缺血-再灌注损伤不仅发生在缺血的当时，更重要的是发生在血流恢复灌注后[24]，而只有抓住这个时间窗及时治疗才能更好地防治肺缺血-再灌注损伤。值得注意的是，进一步研究发现，在再灌注后60 min时给予加倍剂量（30 μg/kg）纳美芬治疗，肺组织中p-AMPK、p-AMPK/AMPK、Nrf2、HO-1表达水平显著高于模型组、纳美芬D组，肺组织病理损伤和氧化应激程度也明显减轻，提示不同的药物作用剂量可能会影响肺组织缺血-再灌注损伤时纳美芬治疗时间窗数值，增大药物使用剂量可能改变或延长有效时间窗。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 徐标：研究设计、实验操作、数据采集、统计学分析、论文撰写；李鸣：研究设计，实验操作、数据采集；王继武：研究设计、数据采集；李文华：论文修改、统计学分析
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