间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是起源于人体各种组织，如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘、牙髓的一类多能干细胞^[1]。MSCs的分泌组包括MSCs条件培养基、各种旁分泌/自分泌因子等以及称为细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的小泡分泌物^[2]。与MSCs一样，MSCs-EVs作为一种重要的信号传导介质，可以有效转运各种miRNAs、LncRNAs和蛋白质等至靶细胞内^[3-4]，发挥着炎症-免疫调节、抗凋亡、调控靶细胞的组织再生修复等作用，在脓毒症、创伤等急危重症中得到一定应用^[5-6]。

有报道显示，诱导血栓形成可能是MSCs治疗时少数并发症之一^[7-9]。临床试验证明在人体内毒素血症期间静脉输注同种异体脂肪来源的MSCs会表现出促炎、抗炎和促凝的混合作用^[10]。MSCs和MSCs-EVs均能表现出促凝效应，这类促凝特性和组织因子（tissue factors, TF）及磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）等促凝因子相关，通过这些凝血因子可以诱导凝血级联激活进而促进凝血^[11]。目前关于MSCs和MSCs-EVs的促凝机制、效应及其意义的文献和报道有限。本文综述MSCs和MSCs-EVs与凝血相关因子如TF、PS、血栓调节蛋白（thrombomodulin, TM）、白细胞介素（interleukin, IL）-1和IL-6等相互作用机制，分析两者在脓毒症、创伤等急危重症临床应用中凝血效应的区别和转化，旨在助力其更多疾病在诊疗中得到更好地应用。

1 MSCs和MSCs-EVs促凝效应及其可能机制 1.1 MSCs和MSCs-EVs的促凝机制

研究认为，MSCs主要通过旁分泌、归巢和线粒体转移等机制发挥其治疗作用^[12-14]，MSCs-EVs也是重要机制之一^[15]。MSCs-EVs可以直接携带miRNA、蛋白质等内容物从MSCs胞膜上“萌发”，发挥免疫调节、抗炎和抗凋亡等作用平衡机体的内环境稳态。另一方面，MSCs-EVs中也存在远端转移机制，通过将miRNA转移至靶细胞调节受体靶细胞中mRNA的翻译，在组织修复、促进肌肉再生中发挥重要作用^[16-17]。

Tatsumi等^[8]研究发现，体外培养的MSCs能表达促凝因子，如组织因子、胶原1a和纤维连接蛋白1。当MSCs注入血液时，这些促凝因子可启动凝血级联反应。此外，他们还设计了相关实验来探求TF的作用，发现TF作为凝血级联中的触发因子定位于体外培养的脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs）表面并在mRNA水平上高度表达；使用抗TF抗体预处理ADMSCs或缺乏FVⅡa因子的血浆成功抑制了这一促凝特性。与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）相比，ADMSCs表达更多的TF，表现出较高的促凝活性^[18]。这些结果间接佐证了目前提出的MSCs与肿瘤细胞相似的促凝活性机制^[19-20]，即TF招募FVⅡa形成外源性酶复合体以启动凝血级联反应，TF缺陷型MSCs在体内不会引发血栓栓塞进一步证实了这一效应^[21]。

除TF外，还有另一种促凝因子值得注意，即磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）。研究显示，根据脂膜成分进行不同亚型MSCs-EVs区分，其中一类亚型EVs脂膜上暴露PS对膜联蛋白V具有较高亲和力^[22]，这种暴露的PS能显著增强TF活性，并为凝血级联和凝血酶原复合物提供催化表面，这有利于TF-FVⅡa复合物、肌腱酶和凝血酶原复合物的形成^[23]。除此之外还发现了许多如凝血因子V、凝血酶原、肌球蛋白-9、组蛋白和CD9等与促凝活性相关的蛋白质^[11]，这些蛋白质可以通过血小板依赖机制调节凝血^[24]。据最近报道称，在MSCs表面表达的凝血酶依赖性血小板蛋白酶激活受体激活也有助于血液凝固^[25]。

研究者们在寻找潜在凝血因子时，发现作用于靶点IL-1和IL-6的相关途径可以减弱重症COVID-19患者入院时机体的凝血激活^[26-27]。已知凝血和免疫系统直接相关联，炎症会导致凝血激活^[28]，IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子均可触发急性内皮细胞激活从而诱发凝血级联，因此在MSCs和MSCs-EVs治疗中通过调节抑制这些细胞因子的表达也可能改善凝血紊乱患者的预后。

1.2 凝血效应的影响因素 1.2.1 给药途径

MSCs静脉输注后在目标组织的脉管系统里被捕获，大多数细胞在最初几分钟内会重新分布到肺部。动物实验已证实在静脉注入充足数量的BMSCs会在肺循环中形成可能致命的栓子^[29]，这与高浓度强粘附性的BMSCs进入直径较小的肺毛细血管有关^[30]，在较低浓度下注入BMSCs或通过抗整合素抗体预处理后，这种粘附性显著降低^[31]，这可能有助于预防肺内微血管栓塞和细胞清除。因此，静脉输注全身给药时肺中BMSCs数量可能远超过其他器官，从而增加血栓栓塞的风险，而采用分子直径更小的BMSCs-EVs，或是直接将细胞注入血管外空间例如肌内时凝血风险将明显降低^[32]。这提示研究者也许可以在治疗中局部或者血管外使用BMSCs，抑或是使用BMSCs-EVs替代，在一定程度上避免肺内血栓形成风险。

1.2.2 给药浓度

早期对BMSCs生物分布的研究表明其在人体循环中会被很快清除^[33]，胰岛和肝细胞暴露于血液后会引发先天性免疫攻击^[34]，从而激活补体/凝血级联，这种炎症反应最终会导致输注的BMSCs细胞遭到破坏短时间内大量丧失^[35]，因此使用较低剂量的BMSCs将很难达到理想的治疗效果。提示使用高浓度的BMSCs体内治疗时是否容易诱发血栓形成，Liao等^[36]的实验将不同浓度的BMSCs悬浮液通过尾静脉注射入小鼠体内，证实了诱导小鼠肺微血管和小动脉内微血栓形成的是细胞总数而非浓度。然而在使用BMSCs治疗的过程中一直面临着临床治疗效率低下的问题，因此，为了保证BMSCs能够发挥足够的治疗效应并尽量减少血栓形成风险，应当寻找其合适的剂量进行临床治疗。

1.2.3 体外培养的制备过程

研究发现MSCs表面的TF可在体外与血液接触从而触发以补体/凝血级联激活为特征的即时血液介导的炎症反应（instant blood-mediated inflammatory reaction, IBMIR），影响MSCs定植、存活时间和治疗功效，并可以激活所有三种经典途径、替代途径和凝集素途径的补体。IBMIR活化MSCs与血小板结合，促进中性粒细胞和单核细胞的凝块浸润，导致细胞破坏。IBMIR的诱导依赖于MSCs类型和给药剂量，并且在MSC体外扩增次数较高时增加^[37]，这说明MSCs直接与血液接触，并且传代次数较高时将表现较高的促凝特性。另一项实验也证明在小鼠体内输注初代培养的ADMSCs时未观察到TF触发的促凝活性，并且所有输注这些初代培养ADMSCs的小鼠在24 h后存活^[8]。这些现象意味着MSCs体外制备扩增次数和体内外给药方式的不同选择在调节其促凝活性方面起着关键作用，避免长时间的传代次数培养可以最大限度地提高患者使用MSCs治疗的安全性。

1.2.4 MSCs来源

Christy等^[18]的研究还证明，不同组织来源的MSCs所表现的促凝效应强弱不一，ADMSCs的促凝效应显著强于BMSCs。为最大限度地减少MSCs应用潜在的安全问题并提高患者受益的机会，选择促凝活性较低的一类MSCs是降低其促凝风险的策略之一。

2 MSCs和MSCs-EVs临床应用中凝血效应的影响与转化

MSCs和MSCs-EVs在多种疾病中治疗效应得到验证，作用于包括炎症和免疫细胞在内的多种生物过程，在治疗中表现出极大的希望和潜力。然而在各类疾病中患者机体凝血状态不同，因此需要在实际运用中综合考虑MSCs和MSCs-EVs的凝血效应。

2.1 脓毒症

脓毒症的发生目前在临床依旧是一个严重的问题，其中有超过半数的脓毒症患者会出现凝血异常^[38]。脓毒症相关凝血病与以下因素有关：促凝血因子上调，TF表达增加，通过TM、内皮细胞蛋白C受体（endothelial cell protein C receptor, EPCR）、蛋白S和组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）等下调抗凝作用等^[39]。此外，炎症与凝血功能障碍相互作用会促进脓毒症的发生和发展，由于内皮提供了炎症和凝血之间的界面，内皮功能障碍也会导致器官衰竭和败血症的高病死率^[40-41]，MSCs作为一种多功能的自我更新细胞，可以促进缺血组织的新生血管形成^[42]，并增强上皮细胞的增殖^[43]，目前成为一种新的脓毒症细胞治疗方法^[44-45]，MSCs-EVs在缓解脓毒症方面发挥与MSCs相似的治疗特性^[46]，可以作为MSCs全细胞治疗的一种替代方案。

目前MSCs对脓毒症凝血功能的影响尚不明确。Tan等^[47]假设BMSCs能够通过调节血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombincomplex, TAT）、TM和EPCR等凝血相关因子水平来减轻败血症相关的凝血病。为了证明这一观点，研究者将受到LPS刺激后的内皮细胞与BMSCs体外共培养6 h，同时对盲肠结扎穿刺诱发脓毒症的小鼠6 h后输注BMSCs，结果显示：(1)体外LPS促进BMSCs共培养的内皮细胞TM和EPCR表达；(2)vWF、TAT和TF循环水平少量增加，减轻由败血症诱导的凝血病；(3)小鼠肠系膜灌注区微循环障碍得到改善，肺损伤减少。这些结果说明BMSCs在体外能促进内皮细胞TM、EPCR释放，体内可以维持vWF、TAT和TF循环水平稳定，并且改善系膜微循环灌注，减少肺损伤。

败血症中，内皮细胞TM和EPCR表达的显著下调将导致PC系统激活受损^[48]。因此上述实验结果中BMSCs促进TM和EPCR两者的释放，一方面可以保护PC系统激活，另一方面可以改善机体凝血紊乱及炎症。TF与活化VⅡ（FVⅡa）形成的复合物通过外源途径激活凝血系统，是脓毒症凝血酶生成的重要因素^[49]，脓毒症患者内皮细胞过度凝血酶生成和纤维蛋白沉积会引起DIC的发展^[50]。BMSCs可以通过其抗炎免疫作用稳定vWF、TF和TAT等因子水平，这一定程度缓解并改善脓毒症相关凝血病。

综上，BMSCs在体内外均能促进内皮细胞中TM的上调，并稳定血浆vWF、TF和TAT水平，这减少了凝血酶生成，发挥保护内皮细胞、减轻炎症反应、改善肺损伤和微循环障碍的作用，这些效应共同减轻脓毒症相关凝血影响。值得注意的是，前文的分析表明体外培养的BMSCs会表达促凝相关的TF，因此其在脓毒症的临床运用中也可能表现出促凝效应。其EVs主要通过暴露PS与MSCs发挥相似的促凝功效且基本不表达TF。因此将BMSCs-EVs运用于脓毒症的治疗中，可以一定程度减弱机体高TF影响下加重脓毒症的DIC和血栓形成风险，并能够体现出其在脓毒症中治疗的优越特性和发展潜力。

2.2 创伤

严重的创伤引起的失血性休克是世界范围内年轻人死亡的一大主要原因^[51-52]，创伤失血性休克（traumatic hemorrhagic shock, THS）与组织损伤相关联。为阻止出血，损伤内皮会同时释放TF和暴露胶原分别结合因子VⅡ和vWF以激活凝血级联^[53]。早期组织灌注不足、内皮障碍及缺氧等因素也将导致机体炎症和高凝状态^[54]。这些严重感染和炎症效应可能导致创伤性凝血病、血管损害和免疫功能障碍的发生^[55-56]。MSCs和MSCs-EVs作为一种新治疗方法具有潜能调节创伤失血性休克后免疫-炎症反应。

目前对于MSCs在创伤中的研究较少，George等^[57]试图使用临床细胞疗法如MSC和单核细胞（monocytes, MNC）等探索在创伤治疗中的应用。结果表明临床细胞疗法的促凝血作用与其TF的表达相关。人MSC和MNC中的TF表达在创伤患者和健康受试者的血液中均具有促凝作用，且创伤患者的促凝血作用较低。MSC、MNC中TF表达引起的促凝作用可能对出血性创伤患者有用。然而，创伤机体存在血栓形成风险，研究表明24 h内收住EICU的严重创伤患者有较高急性创伤性凝血病（acute traumatic coagulopathy, ATC）发病概率^[58]，因此需要制定相应的安全标准；Wu等^[59]构建了急性创伤性失血大鼠模型，通过尾静脉梯度注射BMSCs研究其促凝可能性。其体外实验对大鼠来源的BMSCs和ADMSCs的促凝活性进行了表征，显示经MSCs处理的全血CT缩短。然而与其体外特征相反，体内实验结果显示无论输注任何剂量BMSCs，大鼠均未出现高凝状态，甚至在高剂量BMSCs下有增强其ATC的风险。体内循环和免疫组化结果显示，BMSCs在静脉注射后不久在肺部隔离且与血小板结合形成聚合物，给药后3 h隔离在肺中的BMSCs没有普遍表达TF，但体外与全血孵育的BMSCs中TF却稳定表达。这些现象了揭示静脉注射MSCs的潜在促凝活性可能不是由TF表达直接引起的，且由于肺中血小板和纤维蛋白原的额外消耗，静脉注射BMSCs可能对治疗ATC无效，甚至可能在高剂量下，至少在大鼠中有增强ATC的风险。

综合以上结果分析，MSCs在创伤失血性休克患者的治疗中可能存在一定局限性，但具体根据创伤患者机体的凝血功能状态以及MSCs对TF的表达程度、使用剂量和不同来源的MSCs促凝特性强弱可能效果不同，有待进一步深入研究。

Valade等^[60]综述了MSC-EVs同样也可以调节局部和全身有害的免疫反应，用于预防THS。这些新兴的无细胞治疗产品可以在临床实践中用作免疫调节和组织修复的治疗剂，调节局部和全身有害的免疫反应，且易于储存和立即获得，在创伤的紧急情况下代表着巨大的使用潜力。然而目前外源性BMSCs及其EVs的总体临床有效性证据仍然有限，仅在动物实验中有所体现^[61]。

3 总结与展望

MSCs和MSCs-EVs一方面表现为对抗炎修复、免疫调节有益的止血效果，同时也可能通过TF、PS等促凝因子促进凝血级联表现出一定促凝效应，虽然MSCs和MSCs-EVs的促凝效应具有“双刃剑”效应，但迄今为止，在全身给予MSCs治疗过程中已有血栓形成报告事件。合适的细胞数量、尽可能避免肺部栓子形成的给药方式和途径、减少体外扩增次数以及改善其联用药物的方案等都可以一定程度上减轻其促凝效应。因此未来还需对MSCs和MSCs-EVs的凝血特性和效应进行更加完整的研究和评估，挖掘其凝血效应的具体机制，为MSCs和MSCs-EVs在更多疾病治疗中提供理论基础和更精准的临床指导。

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