2023, Vol. 32
2. 广西医科大学第一附属医院 重症医学科，南宁 530021
2. Department of Intensive Care Unit, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是一种引起胰腺自身消化的炎症性疾病。重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是AP的一种严重形式，具有较高的发病率和病死率[1]。需要一种能够在AP患者到达急诊室时，就能迅速逆转有害损伤的方法，低温疗法就是这样一种简单快速的治疗方法。Wang等[2]证实5’-AMP诱导的亚低温可以抑制大鼠AP早期核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）的活化。Inoue等[3]研究表明到达27~29 ℃体表低温时，可以通过抑制淀粉酶和炎性细胞因子水平对胰腺炎大鼠起到保护作用。由于胃位于胰腺前方，胰腺的大部分被胃所覆盖，de Oliveira等[4]设计了一种胃内降温球囊，意识到经胃的胰腺局部低温最大限度地减少了全身低温，减轻了胰腺坏死、凋亡和炎症，其中在25 ℃时炎症因子的释放降低程度最大。
近年来的研究表明，抑制TLR4/NF-κB信号通路与胆碱能抗炎通路密切相关，平衡能量代谢和氨基酸代谢[5]。Xiao等[6]基于气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）发现SAP和轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis, MAP）中，发现3-羟基丁酸和柠檬酸是两种代谢物潜在的生物标志物。Skouras等[7]利用基于液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MC）的靶向代谢组学方法定量AP患者的色氨酸代谢物，发现3-羟基犬尿氨酸（3-hydroxykynurenine, 3-HK）在SAP和MAP之间存在差异。因此，代谢组学可以为AP探索潜在的机制提供新的思路。
基于以上胰腺炎的低温研究结果，本研究旨在利用GC-MS和LC-MS双代谢组学平台评估胃内局部胰腺低温（25~27 ℃）对AP大鼠调控作用，探索低温保护AP的新的生物标志物和主要代谢通路。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器所有化学品均为分析级，包括甲醇、乙腈、甲酸、吡啶、正己烷、甲氧胺盐酸盐、l -2-氯苯丙氨酸、N, O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺[N, 0-bis(trimethylsilicyl)trifluoroacetamide, BSTFA]和1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane, TMCS）购自Sigma（美国）。抗IL-6 [EPR23819-103] (ab290735)、抗NF-κB P50 [E381] (ab220803)、抗TNF-α [52B83] (ab1793)和抗IκBα [E130] (ab32518)抗体购自Abcam（英国）。淀粉酶ELISA试剂盒和牛磺胆酸钠购自Sigma。小动物温度维护记录仪（YZA-09A）购自合肥思培仪器科技有限公司（中国）。
1.2 胃内冷却球囊设计将2根儿童用8-Fr硅胶导尿管（广州威立德医疗有限公司）捆绑并连接在1个医用橡胶指套（山东蓝帆医疗有限公司）内，作为20 mm柔性橡胶球囊，用于经胃内胰腺降温。
1.3 动物实验所有动物实验均按照湖南省人民医院动物伦理委员会的指南(批号：2022-182）进行。雄性SD大鼠，体重360~400 g，购自湖南师范大学医学院实验动物中心。所有大鼠饲养在环境控制的房间[（23±1）℃，60%湿度]，12/12 h的昼夜循环，自由获得食物和水。
18只大鼠随机分为3组：假手术（sham operation, SO，n=6）组、AP（n=6）组和AP低温（acute pancreatitis hypothermia, APH，25~27 ℃，n=6）组。所有大鼠术前禁食12 h以上。腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠。SO组大鼠多次翻动胰腺，随后关闭腹腔。AP组和APH组采用胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠溶液以0.1 mL/100 g的方法制备AP模型，观察5 min后，见胰腺局部或弥漫性充血水肿，视为胰腺炎模型建立成功。大鼠AP模型建立成功后，AP组关闭腹部手术切口。APH组大鼠在近贲门处行胃切开术，切口0.5 cm，置入直径20 mm带有流入和流出硅胶导管的橡胶球囊，手术缝线关闭切口。在胃胰间隙和直肠放置温度测量电极，以持续监测胰腺表面和直肠温度，然后关闭腹腔。APH组放置在加热垫上持续辅助加温，灌注导管连接蠕动泵装置。通过控制蠕动泵注冰水速度和加热垫输出功率，使胰腺表面温度维持在25~27℃，直肠温度维持在36~39℃，避免全身低体温。SO组和AP组不进行温度的监测。对所有动物皮下给予乳酸林格液共20 mL，分4次补充。分别于手术后0、1、3 h眶静脉取血，室温（20 ℃）下3 000 r/min离心10 min获得血清。术后5 h时，腹主动脉取血，室温（20 ℃）下3 000 r/min离心10 min获取血清。将胃组织和一部分胰腺固定在10%中性甲醛缓冲液中，将血清和剩余部分胰腺组织快速保存在-80 ℃冰箱中直至使用。
1.4 血清淀粉酶检测根据说明书，使用淀粉酶ELISA试剂盒测定术后0、1、3、5 h血清淀粉酶。
1.5 组织学检查大鼠颈椎脱位处死后立即将胰腺组织和胃组织包埋于10%中性甲醛缓冲液中。使用切片机（KD3368，上海，中国）将组织切片成4 μm厚，苏木精-伊红染色，采用双盲原则，由两位副主任以上的病理科医师根据急性出血坏死性胰腺炎的组织学评分[8]进行阅片并对胰腺组织进行病理学评分。
1.6 蛋白质印迹分析（Western blot, WB）胰腺组织匀浆，提取总蛋白。采用二喹啉甲酸法测定胰腺组织蛋白浓度和含量。每孔装入20 μg样品，在室温（20 ℃）下用膜转运和5%脱脂乳封闭样品1 h。在4℃下用抗IL-6、抗TNF-α、抗NF-κB和抗Iκbα抗体孵育过夜（12 h）。以β-actin为内参，加入二抗孵育1 h，加入显色液显色。采用Quantity One Analysis（美国）软件分析各蛋白条带的亮度。胰腺组织中IL-6、TNF-α、NF-κB P50、IκBα蛋白表达水平以IL-6、TNF-α、NF-κB P50、IκBα蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。
1.7 GC-MS实验条件使用Agilent 7890 B气相色谱系统（Agilent Technologies Inc.，美国）分析血清衍生样品。采用DB-5MS融合硅胶毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；安捷伦，美国）。以99.99%氦气作为载气，以1 mL/min的稳定流速通过色谱柱。预先将注入器温度维持在260 ℃。最初将烘箱温度设置为70 ℃。随后以8 ℃/min至125 ℃、5 ℃/min至210 ℃、10 ℃/min至270 ℃、20 ℃/min至305 ℃的速率逐渐升温，最终维持305 ℃ 5 min。设置碰撞能量为70 eV。质谱数据采集采用全扫描模式（m/z 50~500）。
1.8 LC-MS实验条件使用ACQUITY UHPLC系统（Waters公司，美国）与AB SCIEX Triple TOF 5600系统（AB SCIEX，美国）耦合，分析了正离子和负离子模式下的代谢谱。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（1.7µm，2.1 mm×100 mm）。二元梯度洗脱体系为（A）水（含0.1%甲酸，v/v）和（B）乙腈（含0.1%甲酸，v/v）。梯度洗脱: 0 min，5% B；2 min，20% B；4 min，60% B；11 min，100% B级；13 min，100% b，柱温45℃，流速0.4 mL/min。所有样本于4℃保存。采用全扫描模式（m/z 70~1 000）结合信息依赖模式进行数据采集。质谱参数：离子源温度为550℃（+）和550℃（-）；离子喷雾电压: 5 500 V（+）和4 500 V（-）；幕气: 35 psi。聚类电位为100 V（+）和-100 V（-）。碰撞能量分别为10 eV（+）和-10 eV（-）。接口加热器温度：550℃（+）和600℃（-）。IDA分析在m/z为25~1 000的范围内进行，碰撞能量为30 eV。
1.9 多平台代谢组学的鉴定和定量分析对分析仪器获得的原始数据进行峰检测和校准处理。利用生物化学数据库，人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）对这些代谢物进行全扫描质谱分析。
1.10 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析，符合正态分布的血清淀粉酶水平及胰腺组织中IL-6、TNF-α、NF-κB、IκBα蛋白水平以均数±标准差（x±s）表示，三组间比较采用方差分析，进一步两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
采用MetaboAnalyst 4.0软件对仪器检测的代谢信息数据进行t检验和Fold Change分析，获得P值和Fold Change（FC）值。将设备检测到的代谢信息数据经相关预处理后导入SIMCA-P14.1软件，进行偏最小二乘-判别分析分析，获得变量重要投影（variable important in projection, VIP）值。在FC值< 0.8或 > 1.2，VIP值> 1和P < 0.05条件下筛选SO、AP和APH组之间的差异代谢物，进行热图聚类分析，采用MetaboAnalyst 4.0软件分析差异代谢物。
2 结果 2.1 各组的血清淀粉酶检测结果术后0、1 h血清淀粉酶浓度三组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。术后3 h和5 h，与SO组比较，AP组和APH组血清淀粉酶水平升高（P < 0.001）；与AP组比较，APH组淀粉酶水平降低（P < 0.001）。见图 1。
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| a为两组间比较P < 0.001 图 1 各组血清淀粉酶结果 Fig 1 Results of serum amylase in each group |
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SO组未见水肿及炎性细胞浸润征象。与SO组比较，AP组胰腺组织水肿，炎性细胞浸润，大量细胞坏死；与AP组比较，APH组胰腺病理损伤减轻，可见斑片状、局灶性坏死；三组胃组织病理结果均未见明显损伤。见图 2。AP组和APH组大鼠的病理评分明显高于SO组（P < 0.05），同时APH组大鼠胰腺组织病理损害程度较AP组明显减轻（P < 0.05）。5 h内生存时间各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
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| A：SO组胰腺组织未见水肿及炎性细胞浸润迹象；B：AP组胰腺组织可见胰腺组织水肿（如图蓝色箭头所示），炎性细胞浸润，大量细胞坏死（如图红色箭头所示）；C：APH组胰腺组织，可见胰腺组织轻度水肿（如图蓝色箭头所示），表现为斑片状和局灶性坏死（如图红色箭头所示）；D：SO组胃组织；E：AP组胃组织；F：APH组胃组织；图D、E、F所示3组胃组织均未见细胞水肿、细胞坏死出血及炎性细胞浸润改变 图 2 各组胰腺组织学和胃组织检查结果（HE，× 100） Fig 2 The results of pancreatic histology and gastric tissue examination in each group (HE, × 100) |
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| 指标 | SO组 | AP组 | APH组 | F值 | P值 |
| 病理评分（分） | 1.42±0.94 | 13.00±1.58 | 6.82±2.06 | 39.64 | < 0.001 |
| 生存时间（h） | 5.0±0.1 | 4.8±0.2 | 4.9±0.3 | 0.64 | 0.558 |
WB分析显示，与SO组相比，AP组和APH组TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白（IL-6、TNF-α、NF-κB P50、IκBα）表达增加（均P < 0.001）。同时，APH组IL-6、TNF-α、NF-κB P50的表达较AP组降低，IκBα较AP组升高（均P < 0.001）。见图 3。
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| SO为假手术组，AP为急性胰腺炎组，APH为急性胰腺炎低温组，IL-6为白细胞介素6，NF-κ B为核因子κ B，TNF-α为肿瘤坏死因子α，Iκ Bα为核因子κ Bα的抑制剂；B图x轴是组别，y轴是OD值；a为两组间比较P < 0.001 图 3 各组蛋白质印迹分析结果 Fig 3 Western blot analysis results of each group |
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在APH组与AP组的血清样本中分别使用GC-MS和LC-MS鉴定出53个差异代谢物和236个差异代谢物（见图 4A、4B）。表 2和表 3分别表示了通过GC-MS和LC-MS鉴定出的前20位的差异代谢物。
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| A：GC-MS方法分析，APH组和AP组间差异代谢物共53种；与AP组相比较，在APH中呈下降趋势的代谢物有7种，以蓝色圆点表示；与AP组相比较，在APH中呈上升趋势的代谢物有46种，以红色圆点表示；均为圆点越大提示VIP值越大，在组间分组的贡献作用越大；灰色圆点表示在APH组和AP组间差异无统计学意义。B：LC-MS方法分析，APH组和AP组间差异代谢物共236种；与AP组相比较，在APH中呈下降趋势的代谢物有78种，以蓝色圆点表示；与AP组相比较，在APH中呈上升趋势的代谢物有158种，以红色圆点表示；灰色圆点表示在APH组和AP组间差异无统计学意义 图 4 GC-MS与LC-MS分析 Fig 4 GC-MS and LC-MS analyses |
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| 差异代谢物 | HMDB | KEGG | VIP | P值 | log2(FC) | FC | 代谢通路 | 趋势 |
| 松醇 | HMDB0034219 | C03844 | 3.099 | 0.009 | 4.631 | 24.788 | 丁酸甲酯代谢 | 上升 |
| 丁-2, 3-二醇 | HMDB0003156 | C03044 | 2.592 | 0.014 | 3.659 | 12.640 | 下降 | |
| 5 β -粪前列腺醇 | HMDB0000577 | 2.448 | 0.002 | -3.184 | 0.110 | 下降 | ||
| 糖苷酸 | HMDB0000663 | C00818 | 2.419 | 0.001 | 3.084 | 8.482 | 抗坏血酸和醛糖二酸代谢 | 上升 |
| 马尿酸 | HMDB0000714 | C01586 | 2.293 | < 0.001 | 2.775 | 6.847 | 苯丙氨酸代谢 | 上升 |
| 4-(乙酰氨基)苯基-α-D-葡萄糖吡喃糖醛酸 | 2.272 | 0.011 | 2.799 | 6.963 | 上升 | |||
| γ -生育酚 | HMDB0001492 | C02483 | 2.124 | < 0.001 | 2.370 | 5.171 | 泛醌和其他萜类-醌的生物合成 | 上升 |
| 槐糖 | C08250 | 2.111 | 0.008 | 2.402 | 5.287 | 上升 | ||
| 半乳糖酸 | HMDB0000639 | C00879 | 2.069 | 0.007 | 2.324 | 5.007 | 抗坏血酸和醛糖二酸代谢 | 上升 |
| 邻苯二甲酸 | HMDB0002107 | C01606 | 1.952 | 0.024 | -2.122 | 0.229 | ABC转运蛋白代谢 | 下降 |
| 7-羟基烟酸 | 1.944 | 0.011 | 2.074 | 4.211 | 上升 | |||
| 豆甾醇 | HMDB0000937 | C05442 | 1.930 | 0.037 | 1.810 | 3.507 | 类固醇生物合成 | 上升 |
| 吲哚-3-乙酸盐 | HMDB0000197 | C00954 | 1.871 | 0.010 | 1.938 | 3.834 | 色氨酸代谢 | 上升 |
| 松三塘 | HMDB0011730 | C08243 | 1.830 | < 0.001 | 1.779 | 3.431 | 上升 | |
| α-生育酚 | HMDB0001893 | C02477 | 1.812 | < 0.001 | 1.725 | 3.307 | 泛醌和其他萜类-醌的生物合成、细胞铁死亡、维生素的消化和吸收 | 上升 |
| 己糖醛酸 | C01041 | 1.781 | 0.032 | 1.836 | 3.571 | 抗坏血酸和醛糖二酸代谢 | 上升 | |
| 半乳糖醛酸 | HMDB0002545 | C08348 | 1.778 | 0.032 | 1.830 | 3.555 | 上升 | |
| 葡萄糖-1-磷酸 | HMDB0001586 | C00103 | 1.777 | 0.001 | 1.684 | 3.214 | 戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、胰高血糖素信号通路、甘油脂代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢 | 上升 |
| 尿囊素 | HMDB0000462 | C01551 | 1.769 | 0.007 | 1.729 | 3.316 | 上升 | |
| 四氧嘧啶酸 | 1.696 | 0.005 | 1.564 | 2.958 | 上升 | |||
| 注：FC为倍数差异，VIP为变量投影重要性，KEGG为京都基因和基因组百科全书，HMDB为人类代谢组数据库 | ||||||||
| 差异代谢物 | HMDB | KEGG | VIP | P值 | log2(FC) | FC | 代谢通路 | 趋势 |
| 磷脂酰胆碱[20:4(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)-OH(20)/16:0] | HMDB0285900 | 15.716 | 0.026 | -1.488 | 0.356 | 下降 | ||
| 3 α -羟基-5 β -胆碱-7, 9(11)-二烯-24-酸 | 15.560 | 0.008 | 1.883 | 3.690 | 上升 | |||
| 磷脂酰乙醇胺[20:2(11Z, 14Z)/17:0] | 13.431 | 0.0243 | -5.722 | 0.018 | 下降 | |||
| 溶血磷脂酰胆碱[18:2(9Z, 12Z)/0:0] | HMDB0010386 | 11.967 | < 0.001 | 0.579 | 1.494 | 上升 | ||
| 磷脂酰胆碱[P-18:1(11Z)/22:6(5Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-OH(4)] | HMDB0289709 | 11.274 | < 0.001 | 1.318 | 2.493 | 上升 | ||
| 溶血磷脂酰胆碱[18:1(11Z)/0:0] | HMDB0010385 | C04230 | 10.425 | 0.001 | 0.544 | 1.458 | 癌症中的胆碱代谢、甘油磷脂代谢 | 上升 |
| (2R)-2-{[(9Z)-十六-9-烯基]氧}-3-羟丙基2-(三甲基)磷酸乙酯 | HMDB0245288 | 9.776 | 0.004 | 0.611 | 1.528 | 上升 | ||
| 胆酸 | HMDB0000619 | C00695 | 8.945 | 0.011 | 1.655 | 3.149 | 初级胆汁酸生物合成、胆汁分泌 | 上升 |
| 12羟基花生四烯酸 | HMDB0060101 | 8.680 | < 0.001 | -3.418 | 0.093 | 下降 | ||
| 磷脂酰胆碱[22:5(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 19Z)-O (16, 17)/P-18:1(9Z)] | HMDB0289824 | 8.178 | 0.034 | 0.769 | 1.704 | 上升 | ||
| 鞘磷脂[d18:0/16:1(9Z)] | HMDB0013464 | C00550 | 7.962 | 0.046 | -0.429 | 0.742 | 坏死性凋亡、鞘脂信号通路、鞘脂代谢 | 下降 |
| 溶血磷脂酰胆碱[0:0/18:2(9Z, 12Z)] | HMDB0061700 | 7.551 | 0.003 | 0.838 | 1.788 | 上升 | ||
| 磷脂酰丝氨酸(20:0/ PGF2α) | HMDB0282075 | 6.932 | 0.002 | -6.617 | 0.010 | 下降 | ||
| 赤芝酸H | HMDB0035908 | 6.604 | 0.004 | 1.454 | 2.740 | 上升 | ||
| 苯酚硫酸盐 | HMDB0060015 | C02180 | 6.375 | 0.048 | 1.898 | 3.729 | 上升 | |
| 丹参酚 | HMDB0302947 | 6.230 | 0.004 | -2.899 | 0.133 | 下降 | ||
| 3-[4-甲氧基-3-(磺基)苯基]丙酸 | HMDB0131144 | 5.960 | 0.005 | 2.081 | 4.233 | 上升 | ||
| 天竺葵素3-槐糖苷 | HMDB0033679 | C16305 | 5.905 | 0.022 | -1.536 | 0.344 | 下降 | |
| 抑胃酶氨酸 | HMDB0258487 | 5.319 | 0.007 | -1.430 | 0.371 | 下降 | ||
| 溶血磷脂酰胆碱[20:3(5Z, 8Z, 11Z)/0:0] | HMDB0010393 | C04230 | 5.315 | 0.008 | 1.832 | 3.561 | 癌症中的胆碱代谢、甘油磷脂代谢 | 上升 |
| 注：FC为倍数差异，VIP为变量投影重要性，KEGG为京都基因和基因组百科全书，HMDB为人类代谢组数据库 | ||||||||
将上述血液样本中APH组与AP组比较得到的差异代谢物导入MetaboAnalyst 4.0软件进行分析，通过根数据-log（P-value） > 2，P < 0.05，得到3条主要代谢途径，即抗坏血酸和醛糖二酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及色氨酸代谢，结果如图 5所示。
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| Ascorbate and aldarate metabolism，抗坏血酸和醛糖二酸代谢；Pentose and glucuronate interconversion，戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化；Tryptophan metabolism，色氨酸代谢；ABC transporters，ABC转运蛋白；Choline metabolism in cancer，癌症中的胆碱代谢；beta-Alanine metabolism，β-丙氨酸代谢；Pyrimidine metabolism，嘧啶代谢；Neuroactive ligand-receptor interaction，神经活性配体-受体相互作用；Nicotinate and nicotinamide metabolism，烟酸盐和烟酰胺代谢；Taste transduction，味觉转导。通过根数据-log(P-value)>2，P < 0.05，得到前3条主要代谢途径，即抗坏血酸和醛糖二酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及色氨酸代谢 图 5 基于GC-MS和LC-MS得到的代谢通路 Fig 5 Metabolic pathways based on GC-MS and LC-MS |
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AP发病机制复杂，涉及胰酶激活、炎症反应、胰腺微循环障碍、细胞凋亡、肠道细菌移位等。胰蛋白酶原被激活，从而激活其他胰酶，导致胰腺自身消化。低温的保护机制已得到广泛深入的研究，研究发现低温可通过抑制炎症因子释放和中性粒细胞浸润，减轻组织水肿、毛细血管通透性和氧自由基损伤等多种机制，降低机体代谢和氧需求，发挥保护作用。
既往认为低温是AP的致病因素，部分冻伤患者可发展为AP[9]，但也有学者提出了不同的观点，治疗性低温可能对AP的治疗有益。Rakonczay等[10]发现低温（23 ℃）预处理诱导热休克蛋白的表达，减轻胰腺水肿和血清淀粉酶水平。Matsuoka等[11]在雨蛙素诱导的胰腺炎大鼠模型中发现，中度低温可降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，减轻胰腺组织病变。Wang等[12]在牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠模型中发现，亚低温减轻了胰腺组织损伤，延长了大鼠平均生存时间，但亚低温组的血清TNF-α和IL-1β水平高于常温组。亚低温时炎症反应更严重，可能与实验过程中麻醉浅有关。在充分镇痛镇静的情况下，控制性低温有利于降低炎性细胞因子水平，意外低温可引起循环休克引起的炎性细胞因子水平升高。Wang等[12]观察到体内亚低温对AP大鼠有保护作用，尽管炎症反应更严重。Inoue等[3]在研究体表低温致大鼠胰腺损伤的病理生理机制时发现，低温可导致胰腺空泡化的病理损伤；然而在重度低温组（27~29 ℃），血清淀粉酶、乳酸、IL-1β和IL-6水平受到抑制。de Oliveira等[4]设计了一种胃内降温球囊，通过结合大鼠胃内低温和全身加温来实现局部胰腺低温。胰周温度25 ℃可降低炎性因子的表达，延长胰腺炎大鼠的平均生存时间。
炎症反应在SAP发病机制中起着重要作用，IL-6和TNF-α是研究SAP的主要炎性细胞因子。IL-6由巨噬细胞、T淋巴细胞、T细胞等细胞产生，在机体抗免疫反应中发挥重要作用[13]。TNF-α作为炎症的始动因子，介导IL-6等炎症因子的释放，激活一氧化氮和氧自由基的生成，促进白细胞趋化和黏附[14]，从而损伤胰腺组织。TLR4/NF-κB信号通路在炎症反应中起重要作用TLR4广泛分布于胰腺细胞表面。本研究发现，胃内局部低温可有效降低血淀粉酶水平和胰腺病理损伤，降低胰腺组织中IL-6、TNF-α、NF-κB P50的蛋白水平，增加了AP大鼠胰腺组织IκB-α蛋白水平，推测胰腺局部低温可能通过TLR4/NF-κB信号通路对AP发挥保护作用。
抗坏血酸和醛糖二酸代谢与多种疾病，如肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等炎症相关性疾病的发生发展有关[15]。抗坏血酸和醛糖二酸代谢参与了细胞内几个重要的生化过程，包括自由基清除和减少炎症所必需的代谢途径。抗坏血酸是一种强水溶性抗氧化剂，在体内可作为氢受体和供体。能快速清除多种活性氧，参与疏水、谷胱甘肽、血红蛋白等多种物质的还原反应。此外，抗坏血酸还可以抑制白细胞髓过氧化物酶/H2O2/卤化物系统的激活，改善白细胞的运动[16]，从而减轻外源性物质引起的机体炎症反应，如肺氧化应激和纳米氧化锌引起的急性炎症还可减轻硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠的氧化应激和炎症反应[17]。抗坏血酸通过调节免疫和应激反应间接影响机体的炎症反应。在本研究中，大鼠低温胰腺炎组的糖醛酸、半乳糖酸和己糖醛酸水平显著升高，均参与了抗坏血酸和醛糖二酸代谢，炎症时抗坏血酸的产生增加。
戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转换包括d-核酮糖5-磷酸、木糖醇和葡萄糖-1-磷酸，葡糖醛酸可以通过糖醛酸途径转化为5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖参与磷酸戊糖途径，葡糖醛酸结合负责清除体内各种内源性和外源性化合物[18]。本研究发现，与AP组相比，APH组中参与戊糖和葡糖醛酸相互转化的差异代谢物高表达，且APH组血清葡糖醛酸含量增加，增强了具有清除功能的结合反应，从而对胰腺起到保护作用。
色氨酸是一种芳香族氨基酸代谢产物，在调节生长和摄食、情绪和行为以及免疫应答等方面具有广泛的生理功能，是人体必需的氨基酸。Sun等[19]在最近对阿尔茨海默病的研究中发现，吲哚（包括吲哚、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丙酸）通过色氨酸代谢抑制NF-κB信号通路的激活，形成NLRP3炎症小体，减少炎性细胞因子的释放，TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18减轻了APP/PS1小鼠的炎症反应。Zhao等[20]发现犬尿酸可通过抑制NF-κB，减轻炎性反应，增强血乳屏障的完整性，从而减轻LPS诱导的乳腺炎。此外，多项研究证实，抑制TLR4/NF-κB信号通路和逆转色氨酸代谢功能障碍可抑制抗抑郁治疗过程中脂多糖诱导的神经炎症反应[21-22]。本研究中，经胃内低温治疗的大鼠胰腺炎组中3-乙酸吲哚的表达明显高于大鼠胰腺炎组，炎症因子的释放明显减少。
本研究有一些不足之处。首先，通过胃壁置入降温球囊进行胃内低温干预与临床应用存在差异，插入球囊导管的侵入性操作可能对代谢组学分析结果产生了影响。本团队原本设想经口置入带有冷却球囊的导管是最接近临床的方法，但大鼠食管太小，无法经口置入冷却球囊。其次，本研究使用大鼠建立的急性胰腺模型，代谢组学差异代谢物可能表现出种属差异。de Oliveira等[4]在关于经胃局部胰腺低温的研究中，对照组置入带冷却球囊的导管，不进行温度控制，而实验组则进行温度控制，发现胃组织学检查显示对照组与实验组差异无统计学意义。本研究中3组胃组织的组织学检查也未见明显病理损伤，因此本研究没有设置仅胃切开术或胃切开术后仅置入冷却球囊的对照组。
综上所述，本研究认为胃内局部低温对AP大鼠具有降低炎症因子表达和减轻病理损伤的保护作用，可能与抗坏血酸和醛糖二酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换以及色氨酸代谢有关。本研究为早期胰腺炎胃内局部低温干预提供了理论参考。然而，仍有许多代谢物在低温干预胰腺炎中的作用机制有待进一步研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 韩小彤：研究设计；陈云：数据收集；刘鑫宇、谭正：实验操作；黄婕、周威：统计分析；余方：论文撰写；申盛乾、李想：论文修改
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