近年来，脑卒中的发病率和致死率逐年升高，已成为危害人类健康、影响生存质量的主要原因。目前治疗手段以溶栓和取栓为主，其目的是尽快恢复缺血区域血流供应，防止神经元、血管内皮细胞的坏死。然而早期缺血区恢复血流后会释放炎症因子和大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS），导致线粒体功能障碍、细胞内“钙超载”等现象，继而诱发细胞凋亡、细胞焦亡、铁死亡、程序性坏死等。铁死亡作为一种新的细胞死亡方式参与了脑缺血-再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）的发生发展，抑制铁死亡对神经细胞具有保护作用，改善患者预后，已成为CIRI治疗的潜在靶点^[1-3]。姜黄素（curcumin, Cur）是从姜黄根茎中提取的一种脂溶性多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗肿瘤等功效，它还可以透过血脑屏障，改善神经系统功能^[4-5]。本研究探讨Cur减轻大鼠脑CIRI的炎症反应和GPX4介导铁死亡的机制。

选取SPF级SD雄性大鼠24只，体重360~380 g，购买于大连医科大学动物中心。实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2018-0007。大鼠随机分为3组：假手术（Sham）组、CIRI组、Cur组，每组各8只；采用改良式线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artey occlusion, MCAO）模型。采用1%戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉后剃除颈部毛发，碘伏棉球消毒，在偏右侧处纵行切开约1.5 cm，分离出右侧颈外动脉并予以结扎，用动脉夹夹闭颈总动脉近心端，在靠近颈外动脉分叉处切一针口，将尼龙线栓从颈外动脉插入颈内动脉，并沿颈内动脉推至大脑中动脉，进线长度约为2.0 cm，固定后缝合。2 h后拔出线栓，恢复血流再灌注24 h。Sham组与CIRI组操作相同，但不剪口、不插入线栓。在Cur组，缺血模型制备完成后立即腹腔注射Cur（二甲亚砜作为溶剂）100 mg/kg。Sham、CIRI和Cur组大鼠补液量为5.0 mL/kg。所有动物操作均按照动物伦理学标准实施（审批号AEE22098）。

姜黄素购于美国Sigma公司；二甲基亚砜购于中国上海Macklin公司；丙二醛（malonydialdehyde, MDA）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione, GSH）试剂盒、Fe²⁺试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）试剂盒、白介素（interleukin, IL）-1β试剂盒、IL-6试剂盒均购于武汉华美有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）抗体、GAPDH抗体均购于英国Abcam公司；原位缺口末端标记法（TUNEL）凋亡检测试剂盒购于瑞士Roche公司；山羊抗兔IgG二抗购于美国Sigma公司。

缺血-再灌注24 h后采用Longa评分^[6]；大鼠行为正常，无神经功能缺失为0分；提尾时左侧前爪不能正常舒张为1分；爬行时持续向左侧转圈为2分；爬行时身体向左侧倾倒为3分；不能行走、意识丧失为4分。评分≥1分视为建模成功。

建模成功后24 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉满意后处死大鼠，取大鼠右侧脑额叶皮层组织放入液氮中快速冷却，然后在研磨钵中研磨成粉末状，取其称重，按照重量和体积1∶9加入预冷的生理盐水充分搅匀。待匀浆后，以4 000 r/min离心10 min，取上清液备检。按照试剂盒说明书配置工作液，按顺序加入工作液和待测样品，混匀后离心上样检测各自吸光度值。根据公式计算MDA、GSH、Fe²⁺含量，绘制标准曲线。

取大鼠右侧脑皮层组织进行匀浆，以4 800 r/min离心6 min，取上清液后按照试剂盒说明书进行操作，计算脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，绘制标准曲线。

切取脑缺血区额叶皮层组织，4 ℃生理盐水冲洗，一部分保存-80 ℃冰箱中备用；一部分放置4%多聚甲醛中固定24 h，经过乙醇逐级脱水，二甲苯透明、侵蜡，石蜡包埋，切片备用。将其切成5 μm薄片、脱蜡、水化、蒸馏水冲洗等，经过苏木精-伊红（hematoxylin eosin, HE）染色，在显微镜下观察脑组织水肿、出血、坏死、炎性细胞浸润等组织形态学变化。

取脑额叶皮层组织蜡块，每组切片6张，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法进行TUNEL染色和DAB显色，经苏木精复染，二甲苯、梯度乙醇分化，中性树胶封片后在显微镜下观察凋亡细胞（胞核呈棕色或棕黄染色为代表），每张切片观察8个视野（×200），以凋亡细胞数占总细胞数的百分比为凋亡指数。

取冻存的脑额叶皮层组织经裂解液RIPA进行裂解，12 000 r/min离心12 min后提取50 μg总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离，上样后在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，以电转膜方式将蛋白质转移至醋酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入山羊抗大鼠一抗GPX4（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育2 h。ECL化学发光液显影，Image J分析条带吸光度。

将缺血区大脑额叶皮层组织放置于预冷的3%戊二醛溶液中固定，4 ℃保存至少24 h后取出，PBS冲洗3次，然后置于1%四氧化锇酸溶液中固定2 h，再次漂洗，脑组织经过逐级乙醇脱水后树脂包埋、切片（厚度8 nm）、载网，用4%醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅固定，在透射电子显微镜（Hitachi，日本东京）下观察细胞超微结构、照相记录。

采用SPSS 27.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示。数据进行方差齐性检验后，用单因素方差分析进行多组间比较，方差齐者采用LSD-t检验进一步两两比较，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

Sham组大鼠无神经功能障碍，行为学评分为0分；与Sham组比较，CIRI组大鼠评分显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与CIRI组比较，Cur组大鼠评分显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

与Sham组比较，CIRI组大脑皮层中MDA、Fe²⁺含量显著升高，GSH含量显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与CIRI组比较，Cur组大脑皮层中GSH含量显著升高，MDA与Fe²⁺含量降低，差异有统计学意义（均P < 0.05）。见表 2。

与Sham组比较，CIRI组缺血区脑皮层组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与CIRI组比较，Cur组缺血侧区脑皮层组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。

光镜下检查可见，Sham组神经细胞呈圆形，可见完整的胞核，形态结构正常，排列有序；CIRI组可见脑组织水肿，神经细胞收缩、变形，胞核略微深染，部分细胞严重水肿、变性坏死较多；Cur组细胞轻微肿胀，胞核染色变浅，细胞有轻度水肿现象，可见少部分坏死细胞。见图 1。

图 1 大鼠脑组织病理结果分析（HE × 200） Fig 1 Pathological changes of brain tissue in rats after modeling (HE, original magnification × 200)

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TUNEL检测发现，CIRI组可见散在棕染色的凋亡神经细胞，其凋亡指数为（36.8±4.2）%，而Cur组凋亡细胞相对CIRI组明显减少，其凋亡指数为（23.6±3.5）%，低于CIRI组，高于Sham组（4.6±1.2）%，差异有统计学意义（均P < 0.05）。Sham组胞核呈淡蓝色，形态清晰、完整。见图 2。

Sham为对照组；CIRI为缺血-再灌注损伤组；Cur为姜黄素干预组；与Sham组比较，aP < 0.05；与CIRI组比较，bP < 0.05 图 2 大鼠脑皮层神经细胞凋亡与凋亡指数分析（× 200） Fig 2 Analysis of apoptosis and apoptosis index of neurons in rat cerebral cortex (original magnification × 200)

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通过Western blot法检测发现，Sham组大脑皮层中GPX4蛋白表达水平（64.5±4.6）%，Cur组中GPX4蛋白表达水平（42.7±4.2）%较Sham组显著降低，但高于CIRI组（23.6±3.2）%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。

A为免疫印迹检测Sham组、CIRI组、Cur组中GPX4表达情况；B代表各组蛋白OD相对值比较；与Sham组比较，aP < 0.05；与CIRI组比较，bP < 0.05 图 3 各组大脑皮层中GPX4蛋白表达情况 Fig 3 Expression of GPX4 protein in the cerebral cortex in each group

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透射电镜下观察可见，Sham组神经细胞核膜完整、光滑，核染色质分布均匀，线粒体嵴清晰、正常，轮廓完整。CIRI组细胞核染色质边集、皱缩、线粒体双层膜结构增厚、内膜形成的嵴断裂；Cur组细胞核染色质部分边集，分布尚均匀，线粒体轻度水肿扩张，形态基本完整。见图 4。

Sham为对照组；CIRI为缺血-再灌注损伤组；Cur为姜黄素干预组；白色箭头指向线粒体双层膜结构，嵴断裂、空化现象 图 4 透射电镜下大脑皮层神经细胞超微结构（× 20 000） Fig 4 Ultrastructure of neurons in cerebral cortex under transmission electron microscope (original magnification × 20 000)

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缺血性脑卒中是由于缺血和再灌注导致大量氧自由基生成以及局部组织的急性炎性反应引起的神经元坏死和组织损伤，其病理生理过程极其复杂。铁死亡是一种铁依赖性的脂质过氧化产物与ROS过度积累引起的细胞损伤或坏死，线粒体功能障碍被认为是铁死亡的早期预警信号。细胞中过量的Fe²⁺可以被线粒体吸收，发生芬顿反应促进ROS产生并诱导线粒体损伤。既往研究表明，铁死亡参与了脑缺血-再灌注^[7-10]。在本研究中发现，铁死亡主要表现为细胞内铁超载，GPX4和GSH抗氧化物降低以及脂质过氧化产物MDA含量增加，诱导了脑神经细胞损伤，同时铁离子还攻击细胞膜、线粒体等细胞有效成分加快了细胞死亡。Cur作为一种抗氧化剂，通过激活SOD、GSH和CTA等抗氧化物酶清除体内氧自由基，同时下调炎症组织中的中性粒细胞浸润，抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生，减轻缺血组织损伤、血脑屏障破坏及血管源性水肿等发挥重要作用^[11]。

GPX4是抑制铁死亡发生的关键蛋白，也是一种重要的抗氧化酶，参与炎症调节、细胞死亡等多种信号通路，主要分布于细胞质、细胞核、线粒体等部位。GPX4的主要功能是抑制ROS产生减轻DNA损伤，抑制GPX4依赖的GSH脂质过氧化物生成。当GPX4降低时，脂质过氧物蓄积并产生致死量的ROS诱导细胞发生铁死亡^[12-13]。MDA是机体内氧自由基代谢产生的脂质过氧化产物，为多不饱和脂肪酸，其水平变化可间接反映组织中ROS水平。本研究中发现，CIRI组MDA和Fe²⁺含量升高，GSH含量降低，说明铁超载诱导脂质过氧化，参与脑缺血、缺氧及再灌注后脑组织损伤。可见，铁死亡是一种受GPX4调控的细胞死亡方式，与GSH代谢和脂质过氧化的过度累积密切相关。此外，研究结果还表明，Cur干预后下调了脑组织中MDA和Fe²⁺含量，上调GSH含量和GPX4水平。通过TUNEL检测发现，Cur干预后神经细胞凋亡明显减少，电镜下CIRI组细胞膜皱缩、线粒体双层膜结构增厚、嵴减少或断裂，而Cur组细胞膜完整，线粒体嵴破坏减少、结构大致正常，以上结果提示Cur通过抑制脂质过氧化、减少铁超载发挥CIRI保护作用。

炎症反应是CIRI机制的重要环节，脑缺血-再灌注后炎症细胞活化了TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的分泌，进一步加重炎症反应、破坏了血脑屏障，诱导神经细胞损伤^[14-16]。炎症反应也是脑组织损伤最重要的病理变化之一，其可能反过来驱动线粒体ROS的产生和铁死亡的加重。本研究显示，CIRI后大脑皮质中的TNF-α、IL-6、IL-1β显著升高，而Cur干预后大脑皮层炎性因子显著降低，说明Cur能够抑制缺血组织炎症因子的活化、降低炎症反应，病理学检查也可见组织及细胞水肿明显减轻，说明Cur通过下调组织中炎症因子减轻CIRI，推测与抑制细胞凋亡相关，其机制需进一步研究。

综上所述，本研究通过建立缺血性脑卒中动物模型探究铁死亡与CIRI和Cur调控铁死亡在CIRI中的机制，揭示了Cur减轻CIRI与GPX4介导的铁死亡和抑制炎症反应有关，为临床脑卒中治疗提供了新靶点和新思路。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  蒯鑫、王立峰：参与实验操作、设计、文章撰写；李青松：负责数据采集、统计分析、图表与图片制作；李永宁：文章内容修改、审阅以及后期文章处理，获取经费与技术支持