急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是一种致死率高的严重呼吸系统疾病，常表现为肺水肿、肺泡通透性增加、炎性细胞聚集和弥漫性肺泡损伤，其最终可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)^[1-2]。过度的炎症反应是ALI进展的重要危险因素，浸润到肺组织的巨噬细胞和中性粒细胞释放大量细胞因子，诱导过度炎症反应，对肺泡上皮和内皮细胞的产生快速和严重损伤^[3]。迄今为止，尽管对ALI/ARDS进行了广泛的研究，然而并没有开发出有效的药物治疗这一疾病，目前针对ALI/ARDS的最佳治疗仍然是保护性通气，其病死率在大约40%左右^[4]。因此急需开发创新的ALI/ARDS治疗策略来降低其病死率。基因治疗因其精确化、个体化优势已成为目前非常有前景的潜在疾病治疗手段，通过沉默ALI发病机制中关键基因靶标，阻止甚至逆转疾病发展，为ALI/ARDS开辟了潜在的有效治疗策略。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种古老的生物机制，用于防御外源基因入侵。从理论上讲，它可以以序列特异性方式沉默任何与疾病相关的基因，其中小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是目前被认为最有临床应用前景的RNAi ^[5]。然而，单纯的siRNA经气道肺部给药面临着许多障碍，无法有效的传递到靶细胞，因此需要设计有效的递送系统以克服siRNA递送的缺点，从而推动siRNA疗法用于治疗ALI的临床可行性。

1 小干扰RNA

siRNA是21-23个核苷酸组成的双链RNA，包含反义链和有义链^[6]。由Dicer酶分解双链RNA和短发夹状RNA而来的小片段siRNA或直接人工合成转染的siRNA可结合到RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。随后，RISC的核酸内切酶argonaute 2 (Ago-2) 将双链RNA展开成两条单链RNA，释放有义链，而反义链引导RISC复合体与靶mRNA序列碱基互补结合，最后由复合体Ago-2介导靶mRNA降解，最终导致mRNA翻译终止从而达到靶基因敲低的目的^[5]。基于这种机制，siRNA作为基因沉默工具被广泛应用于基础研究和基因疗法。与其他基因疗法相比，siRNA更适合用于治疗用途，其设计合成相对简单，基因沉默过程中不需要基因组整合，从而避免基因治疗相关的突变和致畸性风险，且其相对于其他RNAi方式特异性更高，因此具有更为广泛的临床应用前景^[7]。然而，未经修饰的siRNA由于有限的疗效、潜在的脱靶效应及不良反应限制了其应用，如未经修饰的siRNA可显著激活Toll样受体3并对血液和淋巴系统产生不利影响^[8]。近年来，膦酸修饰、核糖修饰和碱基修饰已经被研究用于化学修饰siRNA，以提高了siRNA功效、特异性和稳定性并降低其毒性和免疫原性^[5]。

目前，基于siRNA的基因疗法已经在不同疾病的临床前及临床研究广泛开展。迄今为止，FDA已批准三种基于siRNA疗法的药物进入市场，分别是用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）的ONPATTRO®（patisiran）、治疗急性肝卟啉症的GIVLAARI^TM（givosiran）、治疗1型原发性高草酸尿症的Oxlumo^TM (lumasiran)，另有7种siRNA药物处于3期临床试验中^[4]。此外，经气道siRNA药物递送的临床研究已有两项开展，ALS-RSV01和Excellair TM分别用于治疗呼吸道合胞病毒感染和哮喘^[9]。

2 经气道siRNA递送的障碍

肺作为一个直接与体外沟通的器官，虽然其面临着更多损伤及感染的危险，但同时也具有特殊的局部给药的优势。经气道siRNA肺部给药可降低全身不良反应、缩短药物起效时间，同时由于局部高生物利用度和较低的肺核酸酶活性，siRNA药物具有更高的稳定性和功效^[10]。然而，目前将siRNA经气道递送至肺部仍面临诸多障碍，单纯的siRNA递送由于细胞外屏障和细胞内屏障阻碍了其正常功能的发挥，此外，ALI的病理状态及通气治疗也阻碍了经气道siRNA疗法的效果。

2.1 细胞外屏障

首先需要考虑传导气道的沉积，药物经鼻咽到肺泡的递送需要经历23级气道的传导，在传导过程中，药物将会被沉积消耗，最终不能有效抵达肺泡发挥作用。而药物的沉积部位取决于其颗粒的大小，Ding等^[10]认为有效肺沉积的最佳空气动力学直径通常在1~5 μm之间，粒径过大将会沉积到上呼吸道，而粒径过小将由于布朗运动而被呼出。然而，多项研究支持粒径为100~200 nm是肺部递送颗粒的最佳大小，并证明其可以成功沉降到肺泡区域，同时大于100 nm的颗粒全身吸收可忽略不计^{[4, 11, 12]}。沉积到肺部的siRNA需要穿透气道黏液层达到靶细胞，但黏液易黏附siRNA药物颗粒使其聚集并随后被纤毛运动清除^[13]。此外，肺泡表面活性剂（pulmonary surfactant，PS）曾被认为是siRNA递送的障碍^[11]，但Koen团队近年来的多项研究揭示了PS促进气道siRNA递送及其机制，首先他们证明PS涂层的纳米凝胶递送系统可促进经气道siRNA递送的效率，在随后的研究中证实了表面活性剂蛋白B (SP-B) 是主要的增强剂，进一步的研究表明SP-B介导的与阴离子内体膜的融合是其重要的作用机制^[14-16]。

2.2 细胞内屏障

siRNA需要被细胞摄取才能进入细胞发挥作用，由于siRNA带负电荷和高相对分子质量，其不易穿透细胞膜，因此需要有效的递送系统促进靶细胞的摄取^[17]。细胞内吞被认为是siRNA细胞摄取的主要途径^[18]。siRNA经内吞后经内体转运至含有核酸酶和其他可以降解RNA酶的溶酶体内，因此siRNA必须在内体早期阶段逃逸至胞质中，才能有效发挥其基因沉默作用^[19]。虽然目前关于siRNA发生内体逃逸的机制尚不完全清楚，但通过构建有效的siRNA递送系统可以增强其内体逃逸效率^[11]。值得注意的是，即使是靶细胞胞质中0.1% 的内体逃逸也可能足以实现有效的RNA干扰性能，这归功于siRNA可以在细胞内扩增^[19]。

2.3 ALI疾病状态和通气治疗

ALI期间增加的肺泡液、塌陷的肺泡、肺通气功能受损等均会阻碍药物分子到达靶细胞，同时，伴随的咳嗽等症状会增加siRNA从气道的清除^[20]。然而ALI期间气道纤毛清除功能受损，这将减少siRNA药物的呼吸道清除。此外，ALI治疗期间的机械通气很大程度上可能会影响经气道递送的siRNA的效率，其包括呼吸机回路中的热量和湿度等。据报道经雾化器产生的气溶胶在机械通气治疗患者中大部分沉积在上呼吸道^[21]。

3 基于气道siRNA递送系统治疗急性肺损伤研究进展

近年来对ALI的发病机制已有广泛的研究，一些基因已经被选择作为ALI治疗的潜在干预靶点，其涉及上皮-内皮功能障碍、免疫细胞募集和活化、细胞因子合成以及成纤维细胞活化等。鉴于传统基因干预手段的缺陷，siRNA疗法在ALI治疗领域越来越受到关注^{[4, 22]}。但正如上文所述，裸siRNA递送在气道中递送面临诸多障碍，最终大部分siRNA沉积于支气管或者直接被呼出，不能有效到达肺泡发挥作用。为克服这种困境，近年来多项临床前研究通过设计合适的递送系统以增强siRNA肺部递送效率，使siRNA发挥了有效的ALI保护作用（表 1）。

Zoulikha等^[4]提出最佳的基于气道siRNA递送系统的特征：(1)将siRNA捕获到稳定的颗粒中；(2) 有效保护siRNA免于酶促反应降解；(3) 穿透肺细胞外屏障；(4)高细胞转染效率；(5) 具有良好的细胞内运输特性，可促进siRNA的内体逃逸和胞质释放；(6)可生物降解的、生物相容的、可忽略不计的毒性和免疫原性；(7)易制备，可大规模生产。目前已有研究的经气道ALI治疗性siRNA递送系统可大致分为5类，包括外泌体、脂质体、聚阳离子、无机纳米颗粒、肽。

外泌体是来源于内体系统的内源性细胞外纳米囊泡，粒径范围为30~150 nm。外泌体被各种类型的细胞释放到细胞外环境中，作为脂质、蛋白质和核酸的天然纳米递送系统，在细胞间通讯中发挥着重要作用^[32]。以外泌体为递送系统具有低免疫原性和毒性、高天然生物相容性，可以逃避内体途径和溶酶体降解。在Zhang等^[25]的研究中，血清来源的外泌体做为载体可以成功将siRNA递送到肺部发挥ALI保护作用。研究者通过荧光共定位发现只有肺泡巨噬细胞中存在递送的siRNA，他们认为可能是外泌体的表面蛋白可以促进特定细胞类型的摄取，这为靶向特定细胞递送提供了有效工具。但目前外泌体的纯化技术相对复杂和昂贵，限制了其临床应用。

脂质体在目前siRNA递送载体中研究最为广泛，且已具备一定规模的商业化，同时也是FDA批准用于吸入治疗的唯一纳米药物载体，其具有较高的转染效率、易于制备等特点^[13]。Dong等^[6]使用Lipofectamine做为载体递送siRip2成功抑制了香烟烟雾诱导的ALI，但该研究并未对siRNA肺部递送效率进行验证。而在另一项研究中，Oh等^[29]人对比了三种siRNA递送载体，其中以Lipofectamine做为载体的递送系统无论是在肺巨噬细胞还是上皮细胞中的递送效率是最低的。此外，脂质体由于其对免疫系统的激活和毒性作用可能会限制了其在ALI治疗性siRNA递送系统中的应用。

聚阳离子为载体经气道siRNA递送目前受到越来越多的关注，包括合成聚阳离子，例如聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺胺(PAMAM) 树枝状大分子等，以及天然聚阳离子，例如壳聚糖等^[33]。由于siRNA带负电荷，带有正电荷的聚阳离子可以通过静电作用有效负载siRNA。Fu等^[26]使用JetPEI复合物作为递送载体，siPxillin显著减轻了LPS诱导的肺内皮屏障损伤。此外，聚阳离子树状大分子以其独特的三维结构为特征，可将siRNA凝聚成树状复合体，具有较强的的siRNA负载能力，PAMAM和磷树枝状大分子因其高度的表面功能、出色的缓冲能力和高转染效率而被广泛测试用于siRNA递送，但这种树枝状大分子对细胞也具有一定的毒性^[27-28]。相比于PAMAM，含有吡咯烷基团的磷树枝状大分子似乎具有更好的效果，这可能源自磷树枝状大分子本身就具有一定的抗炎特性^[34]。此外，氟化可以提高聚阳离子的稳定性，降低毒性，并通过增强细胞摄取和内体逃逸来改善细胞siRNA的传递^[23]。

近年来以无机纳米粒子为基础构建的混合纳米载体被用于经气道ALI治疗性siRNA药物递送。以磷酸钙为核心，负载针对促炎介质的siRNA，并封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，最后添加PEI外层的脂质-磷酸钙纳米颗粒被开发用于siRNA的肺部递送以减轻肺部炎症^[31]。此外，介孔二氧化硅纳米粒子由于多孔表面积大，且具有缓释药物的能力，非常适合小分子药物和siRNA的共同递送。García-Fernández等^[35]使用与肿瘤坏死因子受体1结合序列的肽加帽的门控介孔二氧化硅纳米粒子负载地塞米松靶向肺巨噬细胞给药发挥了ALI保护作用，虽然该研究中使用了静脉注射给药，但这种创新性使用靶向巨噬细胞的肽修饰递送系统以达到局部靶向给药的方式值得在今后的研究中借鉴。

由于较好的稳定性、低细胞毒性和免疫原性、生物相容性和可生物降解性，肽是经气道siRNA递送的潜在载体，其可以单独使用或作为其他系统的辅助成分使用^[36]。细胞穿透肽（cell-penetrating peptides，CCPs）由短氨基酸链组成，可以与质膜相互作用，从而提高细胞摄取。Oh等^[29]构建了一种三元复合物，其以R3V6肽为载体同时负载siS1PLyase和高迁移率族蛋白B1-A盒肽，这种三元复合物被证明对ALI治疗具有协同作用，体外研究显示，这种递送系统在肺上皮细胞的递送效率显著高于巨噬细胞，且这种三元复合物的递送效率比PEI和Lipofectamine更高。Ge等^[30]开发了一种氟化α-螺旋多肽做为递送系统显著增强了siRNA黏液渗透和细胞摄取能力，同时增强了内体逃逸，值得注意的是，这种氟化的多肽在该研究中被证实增强了约240倍的黏液渗透能力。作者认为疏水性和亲油性碳氟化合物具有较低的表面能，这可以大大降低复合物表面与疏水性黏蛋白之间的相互作用。此外，细胞特异性靶向肽对于提高经气道siRNA递送系统的细胞靶向性值得深入研究^[35]。

4 总结和展望

ALI/ARDS是致死率高的严重呼吸系统疾病，其发病机制尚不完全清楚，缺乏有效的早期诊断方法和治疗手段。目前的临床治疗措施侧重于积极对症支持治疗，阻止进一步的组织损伤，而无法从发病机制角度解决根本性问题。随着对ALI/ARDS发病机制的不断深入研究，一些基因被确定为关键的异常激活基因，通过干扰其表达可发挥ALI保护作用。siRNA疗法因其具有高特异性、安全性、短效性、可逆性等特点具有广泛的临床应用前景，经气道递送siRNA沉默ALI发病机制中关键异常激活基因靶点为ALI/ARDS治疗提供了潜在的有效治疗手段。虽然经气道siRNA疗法具有很多优点，但仍需要克服细胞外屏障、细胞内屏障、ALI疾病状态和通气治疗等诸多障碍，因此需要构建一种高稳定性、高载荷、高靶向性、良好的细胞内运输特性、可生物降解、生物相容、无细胞毒性、非免疫原性、易制备的经气道siRNA递送系统。虽然目前开展了许多积极研究去开发这种递送系统，但没有一种已制备递送系统是理想的。外泌体显示更好的生物相容性，脂质体显示出良好的转染效率，基于聚合物的纳米载体显示出缓释特性和更好的负载能力，而肽载体则具有靶向性、增强的细胞摄取和内体逃逸的特性。新近研究显示结合不同载体的优点组合而成的混合纳米载体具有良好的递送效率和安全性，这为设计最佳的经气道siRNA递送系统提供了方向^[5]。然而这种混合纳米载体的制备难度也随之增加，可能会阻碍未来的临床转化。目前ALI发病机制仍然在不断被探索，未来负载靶向关键异常激活基因siRNA的最佳经气道siRNA递送系统有望成为ALI的有效治疗措施。

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