Tubastatin A抑制内质网应激凋亡途径减轻猪心肺复苏后脑损伤的作用及机制研究

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陈闯, 马霜霜, 骆立新, 赵峻峰. Tubastatin A抑制内质网应激凋亡途径减轻猪心肺复苏后脑损伤的作用及机制研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2023, 32(6): 796-801. 复制到剪切板

Chen Chuang, Ma Shuangshuang, Luo Lixin, Zhao Junfeng. Role and mechanism of tubastatin A in alleviating brain injury after cardiopulmonary resuscitation by inhibiting endoplasmic reticulum stress-mediated cell apoptosis in swine[J]. Chin J Emerg Med, 2023, 32(6): 796-801. 复制到剪切板

Tubastatin A抑制内质网应激凋亡途径减轻猪心肺复苏后脑损伤的作用及机制研究

陈闯 , 马霜霜 , 骆立新 , 赵峻峰

浙江医院急诊科，杭州 310030

收稿日期: 2023-01-23

基金项目: 浙江省医药卫生科技计划项目(2019KY258、2020KY005)

通信作者: 陈闯，Email: chenchuang0522@163.com.

摘要: 目的探讨tubastatin A(TubA)通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡而减轻猪心脏骤停-心肺复苏(cardiac arrest-cardiopulmonary resuscitation, CA-CPR)后脑损伤的作用及机制。方法普通级雄性白猪23头，体重33~40 kg，月龄4~6月，采用随机数字表法分为3组：假手术(sham, S)组(n=6)、CA-CPR组(n=9)和TubA组(n=8)。CA-CPR组经右心室电极放电诱发CA 9 min，然后CPR 6 min的方法制备猪CA-CPR模型。TubA组同上述方法制备猪CA-CPR模型，并于复苏后5 min时经静脉泵入TubA 4.5 mg/kg。造模前及复苏后1 h、2 h、4 h和24 h时，经静脉采集血标本，应用ELISA法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)和S100β蛋白(S100β protein, S100β)血清浓度。复苏后24 h进行神经功能缺损评分(neurological deficit score, NDS)，随即安乐死动物，取大脑皮层组织，应用免疫组织化学染色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12)和caspase-3表达，TUNEL法检测细胞凋亡指数。应用SPSS软件对3组数据进行单因素方差分析和Bonferroni事后检验。结果复苏后24 h，与S组比较，CA-CPR组和TubA组NSE和S100β血清浓度均显著增加，同时NDS评分显著升高(均P < 0.05)；与CA-CPR组比较，TubA组复苏2 h后NSE与复苏1 h后S100β血清浓度均显著减少[NSE(ng/mL)：2 h为(23.1±2.0)vs.(20.2±2.0)，4 h为(28.4±2.3)vs.(23.7±1.9)，24 h为(32.1±2.7)vs.(26.6±2.0)；S100β(pg/mL)：1 h为(2239±193)vs.(1923±101)，2 h为(2817±157)vs.(2360±141)，4 h为(3384±250)vs.(2691±210)，24 h为(3965±303)vs.(3119±260)，均P < 0.05]，同时NDS评分显著降低[(240±30)和(63±44)，P < 0.05]。复苏后24 h时大脑皮层组织检测显示，与S组比较，CA-CPR组和TubA组caspase-12和caspase-3蛋白表达显著增加，细胞凋亡指数显著升高(均P < 0.05)；与CA-CPR组比较，caspase-12和caspase-3蛋白表达显著减少[caspase-12：(7.1±0.7)vs.(4.2±0.4)；caspase-3：(13.3±1.6)vs.(7.7±0.8)，均P < 0.05]，细胞凋亡指数显著降低[(31.1±8.6)vs.(17.3±2.2)，P < 0.05]。结论 TubA减轻猪CA-CPR后脑损伤与神经功能障碍，可能与抑制内质网应激介导的细胞凋亡有关。

关键词: 心脏骤停心肺复苏脑损伤神经功能障碍 Tubastatin A 内质网应激细胞凋亡猪

Role and mechanism of tubastatin A in alleviating brain injury after cardiopulmonary resuscitation by inhibiting endoplasmic reticulum stress-mediated cell apoptosis in swine

Chen Chuang , Ma Shuangshuang , Luo Lixin , Zhao Junfeng

Department of Emergency Medicine, Zhenjiang Hospital, Hangzhou 310030, China

Fund program: Zhejiang Provincial Medical Science Foundation (2019KY258, 2020KY005)

Corresponding author: Chen Chuang, Email: chenchuang0522@163.com.

Abstract: Objective To explore the role and mechanism of tubastatin A (TubA) in alleviating brain injury after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation (CA-CPR) by inhibiting endoplasmic reticulum stress-mediated cell apoptosis in swine. Methods Twenty-three conventional male white swine, weighing 33-40 kg, aged 4 to 6 months, were divided into 3 groups by random number table method: sham group (n=6), CA-CPR group (n=9), and TubA group (n=8). The CA-CPR swine model was established by 9 min of electrically induced CA through pacing catheter in the right ventricle and then 6 min of CPR in the CA-CPR group. The CA-CPR swine model was established by the same method, and then a dose of 4.5 mg/kg of TubA at 5 min after resuscitation was intravenously infused in the TubA group. The serum concentrations of neuron specific enolase (NSE) and S100β protein (S100β) were measured using ELISA before modeling and at 1, 2, 4 and 24 h after resuscitation. Neurological deficit score (NDS) was evaluated at 24 h after resuscitation. Thereafter, the animals were euthanized, and brain cortex tissues were harvested, and the expression levels of caspase-12 and caspase-3 were measured using immunohistochemistry. Cell apoptosis index was detected by TUNEL assay. The variables among the three groups were compared with one-way analysis of variance and the Bonferroni hoc test using SPSS software. Twenty-four h after resuscitation, the serum concentrations of NSE and S100β were significantly increased, and NDS was markedly elevated in the CA-CPR and TubA groups compared with the sham group (all P < 0.05). Compared with the CA-CPR group, serum concentration of NSE starting 2 h after resuscitation and serum concentration of S100β starting 1 h after resuscitation were significantly decreased in the TubA group [NSE (ng/mL): (23.1±2.0) vs. (20.2±2.0) at 2 h, (28.4±2.3) vs. (23.7±1.9) at 4 h, (32.1±2.7) vs. (26.6±2.0) at 24 h; S100β (pg/mL): (2239±193) vs. (1923±101) at 1 h, (2817±157) vs. (2360±141) at 2 h, (3384±250) vs. (2691±210) at 4 h, (3965±303) vs. (3119±260) at 24 h, all P < 0.05], and NDS was markedly reduced (240±30 vs. 63±44, P < 0.05). At 24 h after resuscitation, brain cortex tissue detection showed that the expression levels of caspase-12 and caspase-3 were significantly increased, and cell apoptosis index was markedly elevated in the CA-CPR and TubA groups compared with the sham group (all P < 0.05). However, the expression levels of caspase-12 and caspase-3 were significantly decreased [caspase-12:(7.1±0.7) vs. (4.2±0.4); caspase-3: (13.3±1.6) vs. (7.7±0.8), all P < 0.05], and cell apoptosis index was markedly reduced in the TubA group compared to the CA-CPR group [(31.1±8.6) vs. (17.3±2.2), P < 0.05]. Conclusions TubA alleviates brain injury and neurological dysfunction after CA-CPR in swine, which may be related to the inhibition of cell apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress.

Key words: Cardiac arrest Cardiopulmonary resuscitation Brain injury Neurological dysfunction Tubastatin A Endoplasmic reticulum stress Cell apoptosis Swine

经历心脏骤停-心肺复苏(cardiac arrest-cardiopulmonary resuscitation, CA-CPR)后，大部分患者将继发复苏后脑损伤，可造成近70%患者死亡且使许多存活患者遗留严重的神经功能障碍，已被认为是CA-CPR后患者生存预后结局不良的首要原因^[1-2]。tubastatin A(TubA)是一种新型的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂，具有特异性地抑制HDAC6活性而影响组蛋白与非组蛋白功能的生物学作用，研究显示其能减轻局部缺血-再灌注后心脑器官损伤^[3-4]，以及改善CA-CPR后心功能状态^[5]，但对复苏后脑损伤的作用及机制尚不清楚。另外，内质网应激作为死亡受体途径与线粒体途径以外的细胞凋亡诱发途径，已被证实是局灶性脑缺血-再灌注或CA-CPR后神经元凋亡发生的重要因素^[6-7]。本研究拟评价TubA减轻猪CA-CPR后脑损伤的作用效果，并进一步确认其作用机制是否与内质网应激凋亡途径的变化有关。

1 材料与方法 1.1 实验动物来源、分组及干预

普通级雄性白猪23头，体重33~40 kg，月龄4~6月，由上海甲干生物科技有限公司提供，动物合格证号为SCXK(沪)2020-0006。本研究在外单位进行，获得浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会审批(批号2021-103)。实验猪在室温20~25℃、湿度60%~80%、12 h/12 h昼夜交替、常规进食饮水等标准条件下饲养。采用随机数字表法，将实验动物分为3组：假手术(sham, S)组(n=6)、CA-CPR组(n=9)和TubA组(n=8)。实验期间，S组进行药物麻醉、心电监护、气管插管、机械通气、股动静脉置管等准备工作，但不制备CA-CPR模型；CA-CPR组和TubA组在进行上述准备工作的基础上，通过电刺激诱发CA 9 min与CPR 6 min的方法制备CA-CPR模型。复苏成功后5 min时，TubA组在1 h内经股静脉泵入4.5 mg/kg TubA(购自美国APExBIO公司)，另两组同法泵入等量溶媒。

1.2 主要实验仪器与试剂

主要仪器：Monnal T75呼吸机(法国Air Liquide公司)；BeneVision N22监护仪(深圳迈瑞公司)；PalmCPR胸腔按压反馈仪(苏州尚领公司)；M Series除颤监护仪(美国ZOLL公司)；Swan-Ganz导管(美国Edwards公司)；心室电刺激装置(美国Weil研究所)；iMARK型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；RM2235型石蜡切片机(德国Leica公司)；CX31型光学显微镜(日本Olympus公司)。

主要试剂：噻拉嗪(吉林华牧保健公司)；替来他明/唑拉西泮(法国Virbac公司)；丙泊酚(西安力邦制药)；神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)与S100β蛋白(S100β protein, S100β)ELISA检测试剂盒(上海美轩生物)；caspase-12一抗工作液(英国Abcam公司)；caspase-3一抗工作液(美国Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物)；细胞凋亡TUNEL检测试剂盒(武汉博士德生物)。

1.3 动物准备

实验动物常规称重，替来他明/唑拉西泮5 mg/kg与赛拉嗪1 mg/kg臀部肌注诱导麻醉，仰卧于手术三角板上，固定四肢，备皮消毒，连接心电监护仪。丙泊酚2 mg/kg静注全身麻醉，继以4 mg/(kg·h)维持麻醉状态。经口气管插管，连接呼气末二氧化碳分压监测装置与呼吸机，进行机械通气，后者参数设置为潮气量10 mL/kg、峰流速40 L/min、FiO₂ 21%，并通过调节呼吸频率维持呼气末二氧化碳分压在35~40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。手术暴露右侧股动静脉，直视下切开后置入Swan-Ganz导管，头端分别插至胸主动脉与右心房，用于连续监测胸主动脉血压、右心房压，以及采集血液标本。手术暴露右侧颈外静脉，直视下切开后置入室颤诱导电极，头端插至右心室。

1.4 实验模型

待准备完成后，动物稳定观察10 min，然后参照文献^[5]制备猪CA-CPR模型。经心室电刺激装置，连接右心室电极释放1 mA交流电诱发CA，可见心电图呈室颤波形、动脉血压迅速下降为直线，即刻停止机械通气，退出电极，安静观察9 min。然后人工胸外按压与球囊辅助通气30∶2，应用PalmCPR胸外按压反馈仪，实时监测CPR的实施。CPR 2 min时，肾上腺素20 μg/kg首剂静注，此后每3 min重复使用1次。CPR 6 min双向波150 J电除颤1次，迅速判断是否恢复自主循环，其标准为心电图呈室上性自主节律且平均动脉压≥50 mmHg持续5 min以上。若自主循环未恢复，立即重启CPR 2 min，再以150 J电除颤1次。重复该流程≤5次，直至自主循环恢复，或宣告复苏失败。复苏成功后，继续麻醉监护4 h，再送回猪圈观察20 h。

1.5 观察指标

实验期间，动态监测心率、血压、呼气末二氧化碳分压等。CPR期间，记录复苏时间、复苏成功率、肾上腺素用量、除颤次数等。造模前及复苏后1 h、2 h、4 h和24 h时，经静脉采集血标本2 mL，离心取上清液，置入-80℃冰箱冻存，择期应用ELISA法检测NSE和S100β血清浓度。复苏后24 h时，应用神经功能缺损评分(neurological deficit score, NDS)评估神经功能状态，包括意识、呼吸、运动、肌张力、站立、爬行、束缚等，0分表示正常，400分表示死亡或脑死亡^[8]。

复苏后24 h时，动物实施安乐死，获取大脑皮层前额组织，应用4%多聚甲醛固定24 h，进行常规包埋、切片等病理标本制作，加入caspase-12一抗(1∶200)和caspase-3一抗(1∶200)，于4℃下孵育过夜，再加入山羊抗兔二抗(1∶10000)，于37℃下孵育2 h，最后进行DAB显色、苏木精复染、脱水、透明及封片等流程，应用光学显微镜在200倍镜下拍照，每张切片随机拍照5个视野，照片应用Image-Pro Plus 6.0图像软件进行分析，重点分析胞浆内棕黄色颗粒样的阳性染色情况，以定量caspase-12和caspase-3阳性表达的累积吸光度值，取5个视野的平均值作为检测值。另外，同上获取病理组织标本，应用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，每张切片于200倍镜下拍照取5个视野，以棕黄色细胞为阳性细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，以5个视野的平均值作为细胞凋亡指数。

1.6 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件分析。正态分布的计量资料，以均数±标准差(x±s)表示，三组间比较应用单因素方差分析和Bonferroni事后检验。计数资料比较采用Fish精确检验法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组动物的基线状态、CPR结局和24 h存活情况

造模前，各组动物的体重、心率、平均动脉压、呼气末二氧化碳分压组间差异均无统计学意义(均P > 0.05)。CA-CPR组和TubA组动物分别复苏成功8头、6头，两组复苏成功率、复苏时间、除颤次数、肾上腺素用量组间差异均无统计学意义(均P > 0.05)。复苏后，CA-CPR组和TubA组动物在24 h时均存活6头，两组24 h存活率差异无统计学意义(P > 0.05，见表 1)。

表 1 各组动物基线状态、复苏结局与存活情况 Table 1 Baseline characteristics, resuscitation outcomes and survival of swine in each group

组别	体重(kg, x±s)	心率(次/min, x±s)	平均动脉压(mmHg, x±s)	PETCO₂ (mmHg, x±s)	复苏成功比	复苏时间(min, x±s)	除颤次数	肾上腺素用量(mg, x±s)	24 h存活比
S组	37±3	93±9	100±11	38±3	-	-	-	-	-
CA-CPR组	37±3	89±10	100±6	38±2	8/9	7.3±3.3	1.7±1.7	1.8±0.8	6/9
TubA组	36±2	88±6	102±8	39±1	6/8	8.5±4.6	2.3±2.3	2.0±1.1	6/8
F或t值	0.198	0.581	0.122	0.083	—	0.603	0.443	0.603	—
P值	0.822	0.568	0.886	0.921	0.576	0.556	0.664	0.556	1.000
注：PETCO₂为呼气末二氧化碳分压

表选项

2.2 各组动物脑损伤标志物与神经功能状态的变化

复苏后24 h，与S组比较，CA-CPR组和TubA组NSE和S100β血清浓度均显著增加，NDS评分显著升高(均P < 0.05)。与CA-CPR组比较，TubA组复苏2 h后NSE与复苏1 h后S100β血清浓度均显著减少，NDS评分显著降低(均P < 0.05，见表 2)。

表 2 各组动物脑损伤标志物与神经功能状态的变化(x±s) Table 2 The changes of cerebral injury biomarkers and neurological function in each group (x±s)

组别	NSE(ng/mL)					S100β(pg/mL)					NDS
组别	基线	复苏后1 h	复苏后2 h	复苏后4 h	复苏后24 h	基线	复苏后1 h	复苏后2 h	复苏后4 h	复苏后24 h	复苏后24 h
S组	9.8±1.2	9.5±1.0	9.9±1.2	9.7±1.3	9.6±1.5	1297±119	1384±153	1370±103	1300±154	1426±130	13±9
CA-CPR组	9.2±1.3	15.0±2.5^a	23.1±2.0^a	28.4±2.3^a	32.1±2.7^a	1386±130	2239±193^a	2817±157^a	3384±250^a	3965±303^a	240±30^a
TubA组	10.3±1.9	14.9±2.9^a	20.2±2.0^ab	23.7±1.9^ab	26.6±2.0^ab	1338±91	1923±101^ab	2360±141^ab	2691±210^ab	3119±260^ab	63±44^ab
F值	1.204	11.935	99.121	163.290	186.288	1.139	50.020	190.149	165.244	170.681	86.879
P值	0.321	0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	0.240	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
注：NSE为神经元特异性烯醇化酶；S100β为S100β蛋白；NDS为神经功能缺损评分；与S组比较，^aP < 0.05；与CA-CPR组比较，^bP < 0.05

表选项

2.3 各组动物大脑皮层内质网应激凋亡相关指标的变化

复苏后24 h时，与S组比较，CA-CPR组和TubA组caspase-12和caspase-3蛋白表达显著增加，细胞凋亡指数显著升高(均P < 0.05)。与CA-CPR组比较，caspase-12和caspase-3蛋白表达显著减少，细胞凋亡指数显著降低(均P < 0.05，见表 3和图 1)。

表 3 各组动物大脑皮层组织caspase-12和caspase-3蛋白表达和细胞凋亡水平(x±s) Table 3 The expression levels of caspase-12 and caspase-3 and cell apoptosis in cerebral cortex of swine in each group(x±s)

组别	caspase-12	caspase-3	细胞凋亡指数(%)
S组	1.7±0.2	1.8±0.3	1.7±0.4
CA-CPR组	7.1±0.7^a	13.3±1.6^a	31.1±8.6^a
TubA组	4.2±0.4^ab	7.7±0.8^ab	17.3±2.2^ab
F值	187.672	181.545	49.486
P值	< 0.001	< 0.001	< 0.001
注：caspase-12为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12；与S组比较，^aP < 0.05；与CA-CPR组比较，^bP < 0.05

表选项

图 1 各组动物大脑皮层组织caspase-12、caspase-3与细胞凋亡的染色结果(×200) Fig 1 The staining of caspase-12, caspase-3, and cell apoptosis in cerebral cortex of swine in each group (original magnification×200)

图选项

3 讨论

本研究采用右心室电刺激诱导室颤型CA 9 min，然后实施基础生命支持6 min，以模拟临床场景的CA-CPR过程^[5]，从而建立接近于临床实际的心脏骤停后综合征疾病模型。结果显示，17头猪经历一致的CA-CPR造模流程后，复苏成功14头、复苏失败3头，总体复苏成功率达到82.4%。另外，与S组比较，CA-CPR组和TubA组动物经历CA-CPR过程后，动态监测脑损伤标志物NSE和S100β血清浓度呈持续上升趋势，神经功能评估显示NDS评分显著升高，表明CA-CPR猪脑损伤模型制备成功。

HDAC6是通过去乙酰化或泛素化方式而调控组蛋白与非组蛋白功能的重要酶，能影响靶基因表达及细胞生长、凋亡、分化等重要生命过程^[9]。研究发现，TubA能通过靶向抑制HDAC6活性而加强局部缺血-再灌注后心脑器官止损能力，其心肌保护作用可能归因于促进Prdx1乙酰化过程而增强细胞抗氧化能力，以及脑保护机制可能源于上调α-tubulin乙酰化水平及FGF-21表达量而促进神经元存活^[3-4]。在CA-CPR猪心功能障碍模型中，研究还显示TubA能通过促进转录因子-EB乙酰化水平及核转位程度而抑制NOD样受体蛋白3炎性小体介导的细胞焦亡过程，从而减轻复苏后心肌损伤及功能障碍程度，发挥心肌保护作用^[5]。

本研究参照文献^[5]的药物使用剂量及方法，结合临床最早的可行治疗时机，选择在复苏后5 min时经静脉泵入TubA 4.5 mg/kg，整个药物输注时长1 h。结果显示，与CA-CPR组比较，TubA组动物在复苏后24 h期间脑损伤标志物NSE和S100β血清浓度明显降低，在复苏后24 h时NDS评分显著下降，表明TubA能减轻CA-CPR猪脑损伤及神经功能障碍，从而发挥复苏后脑保护作用。

内质网应激是细胞对内质网蛋白集聚的一种适应性应答，其在适度应激时将增强内质网的蛋白处理能力，恢复细胞稳态及减轻组织损伤，但在严重应激时能激活下游凋亡信号分子，诱导组织细胞发生凋亡^[10]。研究表明，caspase-12是位于内质网外膜上、启动内质网应激相关细胞凋亡过程的重要分子，caspase-3是细胞凋亡信号转导过程中细胞凋亡任务执行的重要蛋白^[11-12]。研究证实，内质网严重应激时，活化的caspase-12将由内质网膜转移到细胞质，逐级切割活化caspase家族成员，最终促使caspase-3介导的细胞凋亡发生^[13]。在CA-CPR大鼠脑损伤模型中，研究显示内质网应激凋亡途径是复苏后神经元损伤的重要原因，应用药物靶向减轻内质网应激水平后能通过抑制神经元凋亡而改善神经系统预后结局^{[7, 14]}。

目前，尚不清楚各种缺血-再灌注损伤条件下TubA对内质网应激凋亡途径的调控作用。但在慢性肾病大鼠模型中，研究发现TubA能通过减少错误折叠蛋白堆积而减轻内质网应激反应，进而抑制caspase-3活化水平，从而降低肾小管上皮细胞凋亡^[15]。本研究结果显示，与S组比较，CA-CPR组和TubA组动物在复苏后24 h时大脑皮层组织caspase-12和caspase-3表达上调，同时细胞凋亡指数升高，表明CA-CPR猪脑组织出现内质网应激介导的细胞凋亡现象；与CA-CPR组比较，TubA组动物在复苏后24 h时大脑皮层组织caspase-12和caspase-3表达下调，同时细胞凋亡指数降低，提示TubA可能通过抑制内质网应激而减轻复苏后脑组织细胞凋亡，从而发挥复苏后脑保护作用。

综上所述，TubA能减轻猪CA-CPR后脑损伤与神经功能障碍，其机制可能与抑制内质网应激介导的细胞凋亡有关。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 陈闯: 实验酝酿和设计、研究实施、文章撰写；陈闯、马霜霜和骆立新: 研究实施、数据采集、整理和统计学分析；赵峻峰: 行政支持和指导

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