2023, Vol. 32
2. 武汉市第四医院神经内科，武汉 430030
2. Department of Neurology, the Fourth Hospital of Wuhan, Wuhan 430030, China
脓毒症是一种危及生命的综合征，其特征是炎症反应增强，伴有多种器官功能障碍或衰竭，是重症监护病房中最常见的死亡原因[1-2]。研究表明，肠道在脓毒症的病理生理学中起至关重要的作用，甚至被描述为全身炎症反应的“动力”[3-4]。脓毒症可导致肠道上皮结构和功能的紊乱，例如上皮细胞凋亡增加、屏障功能障碍和细胞因子产生[5]。肠道菌群的稳态是维持肠道正常生理功能的重要前提，菌群的改变在脓毒症的发生中起着重要作用[6]。临床观察发现，脓毒症患者常伴有不同程度的喘促、腹痛、腹胀以及大便热结等胃肠功能障碍症状[7-8]。根据中医“肺与大肠相表里”的脏腑相合理论，本研究选择宣白承气汤（Xuanbai Chengqi Decoction, XBCQT）这一经典的脏腑合治方剂，探究其对脓毒症小鼠肺部和肠道炎症损伤，尤其是对肠道功能及肠道菌群的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级雄性C57小鼠36只，6~8周龄，体重（20±2）g，购自湖北省实验动物研究中心，实验动物质量合格证号42000600038943。给予小鼠正常饮食、自由饮水，并保持自然昼夜节律。本实验动物伦理审查由湖北中医药大学实验动物中心审批通过。
1.2 药物制备与实验分组宣白承气汤全方购自湖北中医药大学黄家湖医院，组方如下：生石膏五钱（15 g）、生大黄三钱（9 g）、杏仁粉二钱（6 g）、瓜蒌皮一钱五分（5 g）。药材煎煮后制成生药浓度为1 g/mL的水煎液，−20 ℃保存备用。
将适应性喂养一周的小鼠随机分成3组（n= 12/组）：①空白对照组，生理盐水灌胃+腹腔注射生理盐水；②模型组，生理盐水灌胃+腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（5 mg/kg）；③治疗组，宣白承气汤（灌胃给药）+腹腔注射脂多糖（XBCQT+LPS）。宣白承气汤灌胃处理3次，每次生药量4.5 g/kg，分别为造模前24 h、造模后0.5 h及造模后12 h，并在最后造模24 h麻醉处死小鼠，收集组织样本。
1.3 实验试剂与设备脂多糖（LPS，L3880）购于美国Sigma Aldrich公司，采用过滤除菌的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）配制成0.5 mg/mL溶液。闭锁蛋白（Occludin）（sc-133256）、连接蛋白1（Claudin-1）（sc-166338）和β肌动蛋白（β-actin）（sc-81178）抗体购自美国Santa Cruz公司。其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂股份有限公司。实验设备主要包括荧光实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国）、SDS-PAGE电泳仪和电转仪（Bio-Rad，美国）、高速冷冻离心机（Beckman，德国）和高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司，中国）。
1.4 标本取材及预处理造模24 h后麻醉小鼠，采用眼球取血方法收集小鼠全血置于抗凝管中，然后低温离心收集血浆，速冻于液氮中。打开胸腔，分离肺脏组织，取右肺上叶小块肺组织固定于4%多聚甲醛中，其余肺组织速冻于液氮中。接着打开腹腔，分离肠道组织，取盲肠下端结肠至肛管段。取结肠近盲肠端固定，剩余部分速冻于液氮中，最后将所有样本转置于−80 ℃冰箱储存，以用于后续实验。
1.5 肺、肠形态学分析先将固定的肺和肠道组织块进行石蜡包埋，然后切片，再将组织切片分别使用苏木精和伊红（hematoxylin eosin stain, H&E）染色试剂盒（Beyotime，中国上海）染色；另外，肠道组织切片使用异硫氰酸荧光剂结合小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin binding fluorescent isothiocyanate, WGA-FITC）（Sigma Aldrich，美国）和Alcian blue染色试剂盒染色（Vectorlabs，中国北京），进行组织形态学检测。而后将肠道脏组织切片分别进行Occludin和Claudin-1的免疫组织化学染色。上述实验严格按照试剂操作说明进行，并使用连有DFC450C数码相机的Leica DMIL显微镜（Leica，德国），进行显微拍照。
1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析称取小鼠肺或结肠组织30 mg，加入总RNA抽提试剂TRIZOL 900 μL裂解匀浆，采用TRIZOL法提取组织RNA，调整RNA终浓度为500 ng/μL后进行逆转录，并以逆转录所得cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增分析。反应体系如下：SYBR Green核酸染料10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，另补加双蒸水至20 μL。扩增条件如下：95 ℃初始活化10 min；45个扩增循环（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s）。使用2-ΔΔCT方法分析靶基因的表达，并以β-actin作为内参。
1.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）分析使用RIPA裂解液对结肠组织进行匀浆裂解，并用BCA法进行蛋白定量，调整蛋白上样体积为20 μL，蛋白浓度为40 μg。配制12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），依次进行电泳、电转操作，实现蛋白分离并转载至PVDF膜，然后进行封闭、一抗孵育、洗膜和二抗孵育操作。最后采用增强型ECL试剂显影，保存图片。
1.8 粪便细菌DNA提取与测定造模12 h后收集小鼠粪便，累积收集每只小鼠2 h内的排出粪便，并拍照、称重。称取25 mg小鼠粪便，采用溶菌酶法提取粪便菌群DNA，并用灭菌水溶解。绘制各类细菌扩增的标准曲线，然后通过qRT-PCR分析，对粪便中的菌群进行定量检测。各类细菌的引物序列见表 1。
| 门 | 细菌属 | 引物序列5'-3' | F/R |
| _ | All bacteria | ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT | F |
| All bacteria | ATTACCGCGGCTGCTGGC | R | |
| 疣微菌门 | Akkermansia | CAGCACGTGAAGGTGGGGAC | F |
| Akkermansia | CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT | R | |
| 拟杆菌门 | Bacteroides | GGTTCTGAGAGGAGGTCCC | F |
| Bacteroides | GCTGCCTCCCGTAGGAGT | R | |
| 放线菌门 | Bifidobacterium | TCGCGTCCGGTGTGAAAG | F |
| Bifidobacterium | CCACATCCAGCGTCCAC | R | |
| 厚壁菌门 | Enterococcus | CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT | F |
| Enterococcus | ACTCGTTGTACTTCCCATTGT | R | |
| 变性菌门 | Escherichia | AGATGCCCTCGGTCTTTGT | F |
| Escherichia | GAGTAATTGATGAGCGTGCTG | R |
采用鲎试剂法（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）检测各组小鼠血浆中内毒素的含量，取小鼠血浆样本适量，严格按照试剂盒操作说明进行实验，绘制标准曲线并进行结果计算。
1.10 统计学方法使用GraphPad Prism 7.0版（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）进行统计分析，符合正态分布的计量资料釆用均数±标准差（x±s）表达。分析方法采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, one-way ANOVA）检验，以评估组间差异。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 宣白承气汤对脓毒血症小鼠急性肺部损伤的保护作用肺组织形态学检查发现，在LPS刺激模拟脓毒血症小鼠的肺组织表现出明显的炎症改变，镜下改变为：病变的肺部肺泡塌陷，周围肺泡代偿性扩张；肺泡间隔增宽，肺泡壁毛细血管扩张充血；肺泡内有炎症细胞浸润。给予宣白承气汤处理后，肺组织结构破坏减少，肺泡毛细血管充血改善，炎细胞渗出减轻，有效缓解肺部炎症损伤，见图 1A。同时检测肺组织炎症因子的表达，脓毒血症小鼠肺组织炎症因子白介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein, MCP-1）表达明显增加，而宣白承气汤治疗后明显降低，见图 1B~图 1E。
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| A：各组小鼠肺组织代表性的H&E染色图片（标尺为100 μm, ×200）；B：IL-6、C：IL-1β、D：TNF-α、E：MCP-1在mRNA水平的表达采用qRT-PCR检测，以β-actin作内参（n = 12每组），aP < 0.05，bP < 0.01 图 1 各组小鼠肺脏组织病理图和肺组织炎症因子水平 Fig 1 Lung tissue pathology and expression of inflammatory factors in each group |
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如图 2A所示，H&E染色显示，对照组小鼠结肠形态结构正常，黏膜清晰完整，黏蛋白合成较多，隐窝结构正常，未见炎症细胞浸润。相反，LPS模型组小鼠结肠组织中部分隐窝破坏，并轻度变形，伴有黏蛋白减少，固有层可见炎症细胞浸润。宣白承气汤干预后，小鼠肠道结构基本恢复正常，炎症细胞浸润程度减轻。
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| A：各组小鼠结肠组织H&E染色代表性的图片（标尺为200 μm, ×100）；B：各组小鼠代表性粪便拍照；C：称重单位时间内收集小鼠粪便；aP < 0.05，bP < 0.01 图 2 各组小鼠肠道组织形态和功能变化 Fig 2 The changes of intestinal morphology and function in each group |
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对收集的小鼠粪便进行对比，与正常组相比，模型组粪便颗粒较小，数量减少。宣白承气汤给药后，粪便形态有所恢复，数量明显增加。将相同时间段小鼠的排出粪便进行称重，结果如图 2B~图 2C所示，LPS模型组小鼠的排便重量显著减少，而进行宣白承气汤干预后得到较好恢复（P < 0.05）。
2.3 宣白承气汤缓解脓毒症小鼠肠道炎症反应各组小鼠肠道组织炎症因子的表达检测，结果如图 3所示，对照组中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1因子表达水平较低，而LPS组小鼠结肠组织中相关炎症因子的表达显著增加（P < 0.05）。经宣白承气汤干预后，四种炎症因子的表达水平均明显下调（P < 0.05）。
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| A：IL-1β、B：IL-6、C：TNF-α和D：MCP-1在mRNA水平的表达采用qRT-PCR检测，以β-actin作内参（n=12每组），aP < 0.05，bP < 0.01 图 3 各组小鼠肠道组织炎症因子变化 Fig 3 The changes of inflammatory factors in intestinal tissue in each group |
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将肠道黏膜黏蛋白进行特殊染色处理，对其表达进行定位和半定量检测。Alcian blue染色和WGA染色结果表明，正常组小鼠结肠组织中黏蛋白合成充沛，而LPS模型组小鼠则出现明显的黏蛋白减少。宣白承气汤治疗后能够增加脓毒症小鼠肠道黏蛋白的蛋白表达水平，见图 4。
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| A：各组小鼠结肠组织代表性Alcian blue染色（标尺为200 μm, ×100）；B：各组小鼠结肠组织代表性WGA染色（标尺为200 μm, ×100） 图 4 各组小鼠肠道黏蛋白表达 Fig 4 Intestinal mucin expression of mice in each group |
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为进一步评估肠道屏障功能损伤的改善情况，分别采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法检测肠道上皮细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1在蛋白水平的表达变化。如图 5A所示，LPS刺激后，肠道结构改变，黏膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达均有减少，在宣白承气汤治疗后表达明显增加。并通过蛋白免疫印迹实验证实，模型组结肠组织中的Occludin和Claudin-1蛋白水平较对照组明显减少（P < 0.05），Occludin在宣白承气汤干预后恢复正常（P < 0.05），差异有统计学意义，而Claudin-1的表达亦有所增加。因此，宣白承气汤能够有效缓解脓毒血症引起肠道黏膜屏障损伤。
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| A：各组小鼠结肠组织Occludin和Claudin-1免疫组织化学染色（标尺为100 μm, ×200）；B：Occludin和Claudin-1蛋白采用蛋白印迹法检测，其中蛋白表达变化用β-actin作内参；C：通过Image J软件对WB条带进行灰度定量，aP < 0.05 图 5 各组小鼠肠道上皮紧密连接蛋白水平 Fig 5 The level of intestinal epithelial tight junction protein in each group |
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采用鲎试剂法检测各组小鼠血浆的内毒素含量，预先使用标准品，绘制标准曲线，R2值在0.99以上，确定浓度与吸光度的线性方程，如图 6A所示。再对样品浓度进行测定，保证样品的浓度范围落在检测限内，最后依据线性方程计算各组每只小鼠血浆内毒素含量，与对照组相比，脓毒血症小鼠血浆内毒素含量明显增加，差异具有统计学意义，而在宣白承气汤治疗后，血浆内的内毒素含量有所下降，并与模型组相比差异统计学有意义，如图 6B所示。
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| A：以试剂盒标准品绘制标准曲线，确定本试剂盒检测的内毒素浓度与吸光度线性关系；B：各组小鼠血浆中内毒素的含量检测（n = 12每组），aP < 0.05，bP < 0.01 图 6 各组小鼠血浆内毒素含量 Fig 6 Plasma endotoxin content of mice in each group |
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图 7结果显示，在造模前后及药物干预前后，各组小鼠肠道菌群的总细菌量并没有明显变化。同时，肠道菌群中占相当比例的常驻菌群如拟杆菌属、双歧杆菌属和埃希菌属，其含量在各组之间差异无统计学意义。但是肠球菌属（Enterococcus）在模型组有明显增加，并在宣白承气汤干预后显著下调（P < 0.01）。此外，虽然阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）菌属在各组中的丰度均较低，但与对照组相比，模型组的阿克曼菌属丰度明显更低（P < 0.05），并在中药方剂治疗后有显著回升（P < 0.05）。
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| A：总细菌含量、B：双歧杆菌属、C：拟杆菌属、D：埃希菌属、E：肠球菌属和F：阿克曼菌属在各组小鼠肠道菌群中的变化（n = 12每组），aP < 0.05，bP < 0.01 图 7 各组小鼠肠道菌群变化 Fig 7 Changes of intestinal flora in each group |
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宣白承气汤是肺肠合治的有效方剂，在临床上治疗肺系疾病及和脓毒症相关的肺组织损伤具有良好效果[8-9]。本文采用腹腔注射LPS诱导小鼠脓毒症模型，可有效复制全身系统性的炎症反应[10]。脓毒症易导致肺部炎症无法消退并致急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的发展。在对肺部组织的病理学分析结果显示，宣白承气汤能有效改善肺部的炎症损伤并降低其炎症因子的表达，证实其“宣肺”的功能。
在重症监护医学领域，肠道被认为是全身炎症的起源和多器官窘迫综合征的引擎[11]。通过对肠道组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1表达水平的监测，笔者发现，脓毒症发生时小鼠的肠道环境可发生炎性改变，主要表现为结肠组织内炎症因子的表达显著上调，从而证明肠道组织在脓毒症发生中的重要作用。同时，宣白承气汤的治疗能有效缓解肠道组织的炎性反应。
炎症性刺激对肠道的结构和功能会产生相应影响，本研究进一步对肠道组织的形态学变化进行观察。结果表明，脓毒症发生时，肠道上皮出现炎症细胞浸润，并能对肠上皮中的隐窝结构产生破坏作用，导致黏蛋白的丢失，后者是构成肠黏膜屏障、捕获细菌及保护肠道免受病原体侵害的重要分子[12]。在肠道受到损伤后，极易出现黏蛋白减少和黏液成分的改变[13]。本研究通过Alcian blue染色和WGA染色发现，在脓毒症模型中，小鼠肠道黏蛋白合成明显减少，而在宣白承气汤治疗后，黏蛋白的产生显著恢复，证实其对肠道黏蛋白具有一定的保护作用。
有越来越多的研究表明，在脓毒症等危重症患者中可能出现一系列胃肠功能障碍和肠道损伤的表现[14]。本研究在实验过程中亦观察到，脓毒症模型小鼠出现明显的排便减少现象，且粪便颗粒偏小并出现硬结，与已有报道一致。LPS诱导的脓毒症模型小鼠结肠上皮组织中紧密连接蛋白Occludin和claudin-1表达下调而宣白承气汤治疗后其表达增加，小鼠的排便情况亦有相应改善。紧密连接蛋白是构成上皮细胞屏障完整的重要分子物质，同时还能够维持肠道免疫功能[15]。Zhu等[16]研究显示，在盲肠结扎穿刺诱导的脓毒症小鼠结肠表现出肠道上皮损伤和屏障障碍。本研究与其结论一致，进一步证实脓毒血症发生时肠道较易受累。
肠道菌群在维持肠道生理功能中发挥重要作用，肠道黏膜表面结构和成分与寄生在肠道内的共生菌群互生互利，共同促进肠道稳态的平衡。大量研究表明，肠道菌群在脓毒症发生的过程中起重要作用[6]。内毒素是革兰阴性菌细胞壁外层结构的脂多糖，大量入血后能引发机体发热以及各种免疫细胞的增殖和活化。此外，肠源性内毒素的产生与细菌的易位和肠道菌群的失衡有重要关系。本研究的结果显示，宣白承气汤能有效降低脓毒血症小鼠血浆中的内毒素含量，由此可见，宣白承气汤可能通过肠道菌群的调节进一步发挥其“通腑”的功能。
本研究选取肠道常驻菌群中的代表性菌属进行定量分析，结果表明，尽管造模前后小鼠肠道菌群的总量没有明显变化，拟杆菌属、肠杆菌属以及双歧杆菌属在各组同样差异无统计学意义，但肠球菌属在模型组增加明显，而阿克曼菌属则在模型组下调。肠球菌作为消化道内的常驻菌群，已被证实与机体的感染密切相关[17]。本实验结果显示，LPS刺激后小鼠肠道内肠球菌属的丰度增加，而在宣白承气汤治疗后下调，差异具有统计学意义。阿克曼菌被认为是一种新的有益菌，它可以利用黏蛋白作为能源，同时参与恢复肠道黏蛋白的储备过程[18]。Shang等[19]研究表明，肠道内阿克曼菌含量减少可能与某些炎症性肠道疾病的发生密切关联。本研究结果显示，脓毒症发生时，小鼠肠道内阿克曼菌的含量显著减少，而宣白承气汤可逆转该变化，并使其恢复到正常水平。
本研究的局限性在于只采用了qRT-PCR法，仅对肠道菌群中的少数细菌进行定量分析，对菌群的多样性和结构分析仍需要更深入的研究。盲肠结扎和穿刺法通过肠道菌群的严重失衡引发肠道相关性菌血症，进而复制脓毒症的发生。不同于盲肠结扎和穿刺法，本研究通过采用LPS腹腔注射诱导全身系统性炎症来模拟脓毒症，该方法并不会直接干扰肠道菌群，但小鼠粪便菌群的分析结果则表明，LPS诱导的脓毒症模型依然会出现肠道菌群结构的部分改变[20]。目前为止，肠道菌群与脓毒症之间可能并不限于因果关系，其复杂性依然是未来需要深入探讨的研究方向。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 程雪：实验设计、实验实施、论文撰写；夏慧、殷明珠：参与实验实施和数据分析；杨化冰、刘洪涛：作图与统计分析；王芳：实验设计及论文修改
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