2022, Vol. 31
2. 余姚市人民医院急诊科，余姚 315400
2. Department of Emergency Medicine, Yuyao People's Hospital, Yuyao 315400, China
我国每年有50多万人经历心脏骤停事件，且病死率高达99%，对人民生命健康造成严重的影响[1]。研究证实，心脏骤停患者复苏成功后，机体将继发复苏后脑损伤，会导致近70%患者死亡及大部分存活患者遗留神经功能障碍，这一直是影响患者预后不良的重要原因[2-3]。近年来，消退素D1（resolvin D1, RvD1）作为一种兼具抗炎和促炎症消退作用的新型脂质介质，已被发现具有减轻复苏后脑损伤的潜在保护能力[4]，但其发挥脑保护的作用机制尚不清楚。另外，细胞自噬已被表明是复苏后脑损伤发生过程中的重要机制之一[5-6]，以及磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）分别是激活与抑制自噬过程的关键信号蛋白[7]。本研究拟探讨RvD1减轻猪心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）后脑损伤的保护作用与AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬的关系。
1 材料与方法 1.1 实验动物来源、分组及干预从上海甲干生物科技有限公司购买雄性大白猪[SCXK（沪）2015-0005]19头，体重为30~41 kg。以标准饲料喂养、自由饮水，待稳定1周后用于实验。该研究获得浙江省杭州市急救中心动物伦理委员会批准（审批号为HEEMC-01）。应用随机数字表法，将实验动物分为3组：假手术（sham, S）组（n=5）、CPR组（n=7）与RvD1组(n=7）。S组仅进行气管插管、血管置管等操作准备，CPR组和RvD1组建立CPR模型。于复苏后5 min时，RvD1组经股静脉注射0.6 μg/kg RvD1（美国Cayman公司），S组和CPR组给予等量溶媒。
1.2 主要实验仪器与试剂主要仪器：BeneView T6监护仪与SynoVent E5呼吸机（深圳迈瑞公司）; PMSH-300型PETCO2/SPO2监测仪（上海Sunlife公司）; E Series除颤监护仪（美国ZOLL公司）; Swan-Ganz导管（美国Edwards公司）; 长直喉镜（美国Welch Allyn公司）; 诱颤装置（美国Weil危重病研究所）; 血气检测分析仪（美国Instrumentation Laboratory公司）; 酶标检测仪与蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）。
主要试剂：氯胺酮（江苏恒瑞医药公司）; 戊巴比妥钠（美国Merck公司）; 神经元特异度烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）与S100B蛋白（S100B protein, S100B）ELISA检测试剂盒（上海美轩生物公司）; p-AMPK与p62一抗工作液（英国Abcam公司）; p-mTOR与微管相关轻链蛋白3 Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ, LC3 Ⅱ）一抗工作液（美国Cell Signaling Technology公司）。
1.3 动物准备首先经肌肉注射20 mg/kg氯胺酮诱导麻醉，然后经静脉注射30 mg/kg戊巴比妥钠全身麻醉、继以8 mg/（kg·h）静脉泵入维持麻醉状态。利用长直喉镜辅助气管插管，导管端口先后连接呼气末二氧化碳分压（pressure of end-tidal CO2, PETCO2）/SPO2监测仪与呼吸机，后者基本设置为潮气量12 mL/kg、峰流速40 L/min与氧体积分数21%，另外调节呼吸机的通气频率以维持PETCO2在35~40 mmHg的生理范围（1 mmHg=0.133 kPa）。Ⅱ导联持续监测心电图。经右股动脉置入Swan-Ganz导管监测胸主动脉压与采集动脉血标本，经右股静脉置入Swan-Ganz导管监测右心房压与采集静脉血标本，经右颈外静脉置入诱颤电极至右心室。
1.4 实验模型实验准备完成后，动物稳定15 min，然后经右心室电极放电诱发心脏骤停，其成功诱导的表现为室颤，同时大动脉血压迅速下降及搏动消失。待确认为心脏骤停后，撤出诱颤电极，断开呼吸机，无干预观察8 min。然后，通过人工胸外按压与球囊辅助通气实施CPR，比例为30∶2。CPR 2.5 min时，经静脉注射20 μg/kg肾上腺素，然后每3 min重复使用1次。于CPR 5 min时，调整除颤仪能量为150 J双向波，进行非同步电除颤1次，并判断自主循环是否恢复。自主循环恢复的表现为室上性心电节律，同时可见平均动脉压≥50 mmHg并能持续5 min以上[8-9]。若未恢复自主循环，立即恢复CPR 2 min，再次电除颤1次。在经历≤5个循环后，动物恢复自主循环或宣告复苏失败。复苏成功者将继续监护6 h，然后待苏醒后送回猪圈观察18 h。
1.5 观察指标实验期间，动态监测心率、血压、PETCO2等。于造模前，采集动脉血标本，应用血气检测分析仪评估动脉血气指标的基线情况。CPR期间，观察冠脉灌注压的变化，以及记录分析复苏时间、复苏成功率、肾上腺素用量、除颤次数等。于造模前及复苏后1、3、6和24 h时，采集静脉血标本，常温离心后吸取血浆，置于-80℃冰箱暂时冻存，在实验结束后集中应用ELISA法检测血清NSE和S100β。于复苏后24 h时，进行神经功能缺损评分（neurological deficit score, NDS）评估，包括意识状态、呼吸频率、运动能力、肌张力、能否站立与爬行、对抗等方面内容，分值范围为0~400，其中0分为正常、400分为死亡[10]。然后，应用戊巴比妥钠150 mg/kg静脉注射实施安乐死，获取大脑皮层组织，放入-80℃深低温冰箱冻存，择期应用Western blot法检测p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ与p62表达水平，即取组织样本加入裂解液，4℃下10000×g低温离心10 min，吸取上层液体，应用BCA法测蛋白浓度。再者，开始SDS-PAGE蛋白电泳，PVDF转膜，以及5%脱脂牛奶于室温下封闭2 h。其后，分别加入p-AMPK一抗（1∶1000）、p-mTOR一抗（1∶1000）、LC3Ⅱ一抗（1∶1000）、p62一抗（1∶1000），4℃下孵育过夜。最后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10000），室温下孵育1 h，ECL下显影，应用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与GAPDH内参比值表示蛋白表达水平。
1.6 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，其中正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，三组间比较应用单因素方差分析和Bonferroni事后检验，组间两两比较应用LSD-t检验。计数资料的比较，采用Fish精确检验法。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组动物的一般情况各组动物的基线特征，如体质量、心率、平均动脉压、PETCO2、pH值、乳酸及PaO2组间差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 1）。
| 组别 | 体重 (kg) |
心率 (次/min) |
平均动脉压 (mmHg) |
PETCO2 (mmHg) |
pH | 乳酸 (mmol/L) |
PaO2 (mmHg) |
| S组 | 34.4±1.1 | 88±6 | 105±6 | 39.4±1.5 | 1.6±0.3 | 7.46±0.01 | 93±8 |
| CPR组 | 34.9±3.8 | 85±4 | 100±6 | 39.1±1.6 | 1.7±0.3 | 7.47±0.03 | 92±7 |
| RvD1组 | 33.4±1.4 | 89±7 | 105±9 | 39.0±1.4 | 1.8±0.2 | 7.47±0.02 | 97±5 |
| F值 | 0.581 | 0.941 | 0.852 | 0.104 | 0.870 | 0.966 | 1.384 |
| P值 | 0.571 | 0.411 | 0.445 | 0.902 | 0.438 | 0.402 | 0.279 |
| 注：PETCO2，呼气末二氧化碳分压; PaO2，动脉氧分压; S，假手术; CPR，心肺复苏; RvD1，消退素D1 | |||||||
复苏期间，CPR组与RvD1组动物冠脉灌注压保持一致的变化趋势，且各时间点的组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。另外，两组动物的复苏成功率、复苏时间、除颤次数及肾上腺素用量的组间差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 2）。
| 组别 | 冠脉灌注压(mm Hg) | 复苏成功率 | 复苏时间(min) | 除颤次数 | 肾上腺素用量(mg) | ||||
| 1 min | 2 min | 3 min | 4 min | 5 min | |||||
| CPR组 | 20.7±2.1 | 26.6±3.0 | 30.6±4.0 | 35.1±5.4 | 28.4±6.7 | 6/7 | 6.4±3.8 | 1.6±1.5 | 1.2±1.3 |
| RvD1组 | 19.9±1.2 | 26.0±1.7 | 30.1±2.0 | 34.6±3.6 | 26.9±4.5 | 6/7 | 6.4±3.8 | 1.6±1.5 | 1.0±1.0 |
| t值 | -0.922 | -0.431 | -0.255 | -0.233 | -0.517 | — | 0.000 | 0.000 | -0.216 |
| P值 | 0.375 | 0.674 | 0.803 | 0.820 | 0.615 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.833 |
| 注：CPR，心肺复苏; RvD1，消退素D1 | |||||||||
与S组相比，CPR组和RvD1组动物在复苏后均出现神经功能障碍与脑损伤，表现为复苏后24 h的NDS评分显著升高，血清NSE和S100β浓度显著增加（均P < 0.05）。然而，与CPR组相比，RvD1组动物在复苏后24 h的NDS评分降低，在复苏后3 h的血清NSE和S100β浓度显著减少（均P < 0.05，表 3）。
| 组别 | NDS | NSE（ng/mL） | S100B（pg/mL） | |||||||||
| BL | PR 1 h | PR 3 h | PR 6 h | PR 24 h | BL | PR 1 h | PR 3 h | PR 6 h | PR 24 h | |||
| S组 | 6±5 | 11.6±0.8 | 11.6±0.6 | 11.7±0.7 | 12.1±0.5 | 12.2±0.8 | 1028±72 | 1008±75 | 1007±43 | 1024±45 | 1014±30 | |
| CPR组 | 182±34a | 11.2±2.3 | 19.2±2.4a | 23.1±3.8a | 27.3±2.9a | 28.1±1.3a | 1048±68 | 1367±130a | 1611±208a | 1825±197a | 1613±138a | |
| RvD1组 | 124±18ab | 10.4±1.8 | 17.2±3.7a | 18.0±2.2ab | 19.8±1.4ab | 15.1±2.1ab | 1007±72 | 1250±218a | 1322±100ab | 1410±102ab | 1183±139ab | |
| F值 | 81.731 | 0.685 | 11.947 | 24.687 | 81.095 | 172.026 | 0.578 | 7.303 | 25.477 | 48.240 | 38.575 | |
| P值 | < 0.01 | 0.518 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | 0.572 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | |
| 注：NDS，神经功能缺损评分; NSE，神经元特异度烯醇化酶; S100B，S100B蛋白; BL，基线值; PR，复苏后; S，假手术; CPR，心肺复苏; RvD1，消退素D1。与S组比较，aP < 0.05;与CPR组比较，bP < 0.05 | ||||||||||||
与S组相比，CPR组和RvD1组动物在复苏后24h脑皮层组织中p-AMPK与LC3II的蛋白表达显著增加，p-mTOR与p62的蛋白表达显著减少（均P < 0.05）。与CPR组相比，RvD1组动物在复苏后24 h的脑皮层组织中p-AMPK与LC3II的蛋白表达显著减少，p-mTOR与p62的蛋白表达显著增加（均P < 0.05，图 1）。
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| A：蛋白印记法检测假手术组（S组）、心肺复苏组（CPR组）及消退素D1组（RvD1组）猪脑皮层组织中p-AMPK、p-mTOR、LC3II和p62的蛋白表达情况; B-E：各组蛋白灰度相对值比较; 与S组比较，aP < 0.05;与CPR组比较，bP < 0.05 图 1 各组动物脑皮层组织p-AMPK、p-mTOR、LC3II和p62的表达水平变化 Fig 1 The expression changes of p-AMPK, p-mTOR, LC3II and p62 in cerebral cortex in each group |
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RvD1是来源于长链多不饱和脂肪酸衍生物的新型脂质介质，主要通过抑制中性粒细胞浸润，减少炎症因子聚集，增强巨噬细胞吞噬等途径产生抗炎和促炎症消退的生物学功能[11]。近来研究显示，RvD1能通过调控炎症、氧化应激、细胞凋亡等多种病理损伤途径，从而减轻局部缺血-再灌注后多种器官的损伤程度[12-15]。另外，Chen等[4]在猪CPR模型中，研究发现RvD1能剂量依赖性地改善复苏后心脑器官的功能障碍、并减轻损伤程度，其心脑保护作用主要与减轻炎性及氧化损伤有关。本研究拟利用猪CPR模型进一步确认RvD1产生复苏后脑保护效应的作用及机制。结果显示，与CPR组相比，应用RvD1明显降低复苏3 h后血清NSE与S100β浓度，显著降低复苏24 h时的NDS评分，因而提示复苏后应用RvD1能改善机体神经功能障碍以及降低脑损害程度，因此具备复苏后脑保护作用。
自噬是清除细胞内异常蛋白质与维持自身稳态的重要方式，其水平适度时将利于保持细胞稳定，但在水平过度时能造成细胞死亡[16]。其中，LC3Ⅱ和p62是细胞自噬的标志性蛋白，前者在自噬激活时由LC3Ⅰ转化形成，后者在自噬过程中被自噬溶酶体降解，二者是反映细胞自噬水平的重要指标[17-18]。目前，研究发现细胞自噬是复苏后脑损伤发生的重要病理途径之一，其可成为复苏后脑保护治疗的潜在干预靶标。Cui等[5]建立大鼠CPR模型，研究发现复苏后神经元出现自噬过度现象，应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或巴佛洛霉素A1能通过抑制自噬而减轻复苏后海马神经元损伤。另外，Zheng等[6]同样在大鼠CPR模型中，应用PD98059能通过抑制细胞自噬水平与线粒体凋亡途径，进而减轻复苏后脑损伤。本研究结果显示，与S组比较，可见CPR组和RvD1组动物复苏后受损脑皮层组织中LC3Ⅱ表达增加、p62表达减少，提示复苏后受损脑组织存在自噬过度。然而，与CPR组相比，应用RvD1能降低复苏后受损脑皮层组织中LC3Ⅱ表达水平并升高p62表达水平，由此提示RvD1减轻复苏后脑损伤的保护作用可能与抑制细胞自噬有关。
AMPK与mTOR是调控自噬的多条通路中两条经典通路的关键信号分子，能分别通过激活、抑制自噬过程而影响其生物学功能[7]。研究显示，多种药物能通过调控AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬过程而发挥减轻脑缺血-再灌注损伤的保护作用。Wang等[19]建立大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，研究发现葛根素能通过减少p-AMPK及增加p-mTOR的表达水平而抑制细胞自噬水平，从而减轻缺血-再灌注后脑梗死面积，以及改善神经功能障碍程度。Sun等[20]在大鼠一过性全脑缺血模型中，研究发现碱性成纤维细胞生长因子能通过抑制mTOR介导的细胞自噬与p53介导的细胞凋亡而发挥神经保护作用。本研究结果显示，与S组比较，可见CPR组和RvD1组动物复苏后受损脑皮层组织中p-AMPK表达增加、p-mTOR表达减少，同时伴有细胞自噬过度的现象。然而，与CPR组相比，应用RvD1能降低复苏后受损脑皮层组织中p-AMPK表达水平并升高p-mTOR表达水平，同时减轻自噬程度，因而提示RvD1可能通过抑制AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬而发挥复苏后脑保护作用。
综上所述，RvD1能改善猪CPR后神经功能障碍，减轻脑损伤程度，保护机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬有关。本研究结果将为复苏领域围绕AMPK/mTOR自噬途径开展复苏后脑损伤的靶点治疗及RvD1在复苏领域的转化应用提供依据。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 叶森、汪正权：实验操作、论文撰写; 叶森、公方晓、张润：数据收集及整理、统计学分析; 叶森、洪军：研究设计、论文修改
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