2. 江苏大学医学院,镇江 212013
2. School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)以及其严重形式急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是重症监护病房常见的一种疾病,ARDS的病死率可高达30%~45%[1]。ARDS发病早期会有大量炎症因子涌入肺组织,而中性粒细胞是早期炎症的核心因素[2]。细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)均属于免疫球蛋白超家族的成员,越来越多的证据表明,两者在ALI的中性粒细胞跨内皮细胞迁移起关键作用[3-4]。因此抑制这两者在内皮细胞上的表达成为控制炎症的关键,而腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作为炎症过程中的调控因子,可以降低粘附分子的表达进而抑制炎症反应[5]。
AMPK是生物能量代谢调节的关键分子,近年研究发现其是炎症过程中的关键调控因子[6-7]。有研究证明乌司他汀可以通过调节AMPK/NF-κB通路来抑制炎症因子减轻脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的ALI[8]。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是具有自我更新能力的多能干细胞[9],可以调节免疫和炎症反应并减轻感染[10],而人脐带间充质干细胞上清液(human umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium, HucMSC-cm)在LPS诱导ALI中的作用机制仍不明确。本研究旨在阐明HucMSC-cm逆转LPS导致的ALI的机制,并为临床治疗ALI提供新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 动物实验模型构建动物:6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠购自江苏大学实验动物中心,许可证号为SYXK(苏)2018-0053,合格证号为202112223,所有动物实验均经江苏大学动物实验中心批准,并按照《实验动物护理使用指南》进行。
动物模型构建及分组:40只C57BL/6小鼠随机分成4组(每组10只):sham组、LPS组、LPS+HucMSC-cm组、LPS+HucMSC-cm+Compound C组。根据既往文献报道构建ALI模型[11],气管内缓慢滴注LPS,剂量5 mg/kg,50 μL/只;HucMSC-cm于LPS注射4 h后气管内注射,剂量50 μL/只;Compound C溶于生理盐水,剂量为15 mg/kg,下一药物给药前30 min腹腔注射。
1.2 人肺微血管内皮细胞分组及处理人肺微血管内皮细胞株(HuLEC-5a)购自上海宾穗生物科技有限公司,用含10%胎牛血清(BI,以色列)的DMEM(BI,以色列)培养细胞,置于37 ℃,5% CO2培养箱中孵育。将1×105个细胞种于六孔板,细胞分组:对照组(control组)、LPS组、LPS+HucMSC-cm组,细胞融合度达约70%时加LPS(10 μg/mL)及HucMSC-cm,24 h后提取蛋白或RNA。
1.3 脐带间充质干细胞培养及上清液收集本研究中,脐带标本来源于江苏大学附属医院,通过江苏大学附属人民医院伦理委员会批准,(批件编号:SQK-20210108-W),所有受试者均提供知情同意。根据以前发表的研究[12],从健康新生儿脐带中分离培养HucMSCs。细胞扩增至第3~5代进行实验。
当细胞培养达到70%的融合度,换用6 mL人间充质干细胞无血清培养基(灏洋生物,天津)培养72 h,然后收集上清液。上清液在1 000 r/min下离心5 min去除细胞碎片,然后将其转移到分子截量为3 000 Da的高速离心管(Millipore,美国)中离心,浓缩50倍。最后,上清液通过0.22 μm过滤器(Corning,美国)过滤,保存在-80 ℃冰箱,用于每次实验。
1.4 Western Blot分析用RIPA裂解液(Vazyme公司,中国)裂解细胞及肺组织。蛋白质样品用SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜(Millipore,美国)。封闭1 h后,与一抗在4 ℃孵育过夜。使用抗体包括抗IL-6(1∶1 000,武汉三鹰,中国)、抗p-AMPK(1∶1 000,CST,美国)、抗AMPK(1∶1 000,CST,美国)、抗VCAM-1(1∶3 000,abcam,英国)、抗ICAM-1(1∶1 000,abcam,英国)、抗GAPDH(1∶3 000,CWBIO,中国)、抗β-actin(1∶2 000,CST,美国)。第2天,用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或鼠抗体(1∶3 000,ABM,加拿大)在37 ℃下孵育1 h。
1.5 肺组织切片及免疫组织化学法肺组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切成5 μm切片。经过一系列脱蜡脱水后,用3%H2O2封闭内源过氧化物酶活性,然后用新鲜制备的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液进行抗原修复。在用PBS洗涤3次后,用5%牛血清白蛋白封闭切片30 min,然后与下列一抗共同孵育4 ℃过夜:抗p-AMPK(1:800,CST,美国)、VCAM-1(1:800,abcam,英国)、IL-6(1:200,武汉三鹰,中国)。次日将切片与生物素标记的山羊抗鼠/兔二抗在37 ℃孵育30 min。DAB显色液用于显色,苏木精用于复染。免疫组织化学图像用全景扫描仪MIDI(3DHISTECH,匈牙利)捕获。
1.6 苏木精-伊红(HE)染色法观察肺损伤程度将肺组织置于4%多聚甲醛中固定,按浓度梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,行5 μm切片,置于载玻片上,贴片后进行HE染色,在光镜下观察肺损伤程度。
1.7 肺湿重(W)/干重(D)比值检测肺水肿肺组织置于滤纸上吸干组织表面液体后称重,记为W,之后将肺组织置于70 ℃烘箱72 h至恒重,称重记为D,计算肺组织W/D。
1.8 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)用TRIzol试剂(Invitrogen,美国)裂解细胞及肺组织,提取RNA。利用反转录试剂盒(CWBIO,中国)获得cDNA。采用UltraSYBR mix(CWBIO,中国)进行RT-PCR。细胞以GAPDH为内参基因,动物组织以ACTB为内参基因。PCR引物如表 1和表 2所示。
基因 | 引物序列(5’-3’) |
IL-6 | forward: 5’-GAGGAGACTTGCCTGGTGAA-3’ |
reverse: 5’-GCGCAGAATGAGATGAGTTG-3’ | |
IL-8 | forward: 5’-ACCGGAAGGAACCATCTCAC-3’ |
reverse: 5’-GTGGATCCTGGCTAGCAGAC-3’ | |
GAPDH | forward: 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’ |
reverse: 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’ |
基因 | 引物序列(5’-3’) |
ICAM-1 | forward: 5’-CTGAAAGATGAGCTCGAGAGTG-3’ |
reverse: 5’-AAACGAATACACGGTGATGGTA-3’ | |
VCAM-1 | forward: 5’-GACATTTACCCAGTTTACAGGC-3’ |
reverse: 5’-TGACGGGAGTAAAGGTTACTTC-3’ | |
ACTB | forward: 5-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG- 3’ |
reverse: 5- ATGCCACAGGATTCCATACC- 3’ |
采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析,服从正态分布的计量资料以均值±标准差(x±s)表示;多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Tukey法检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HucMSC-cm减轻LPS诱导的ALI为明确脐带间充质干细胞上清液对ALI的作用。首先用LPS及HucMSC-cm构建ALI及治疗组模型(图 1A),发现LPS模型组小鼠肺组织充血水肿明显,而治疗组较LPS组减轻(图 1B);通过HE染色发现,相较于sham组,LPS组肺泡结构破坏,肺泡间隔明显增厚,充血、水肿明显,并伴大量炎性细胞浸润;当给予HucMSC-cm处理后,肺组织损伤得到明显改善(图 1C)。此外,通过比较外周血中性粒细胞比例,发现HucMSC-cm能有效抑制LPS诱导升高的中性粒细胞比例(P < 0.001,图 1D)。综上说明脐带间充质干细胞上清液可以改善LPS诱导的小鼠ALI。
2.2 HucMSC-cm减少LPS诱导的ALI中炎症因子在体内试验中,通过Western Blot检测小鼠肺组织中IL-6蛋白水平,发现LPS气管内注射72 h后能引起肺组织中IL-6蛋白水平明显升高(P=0.003),而LPS+HucMSC-cm能抑制IL-6的升高(P=0.003)(图 2A)。同样地,通过免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织中IL-6的表达,得到了与上述一致的结果(图 2B)。在体外试验中,当给予LPS刺激肺微血管内皮细胞24 h后,IL-6(P < 0.001)及IL-8(P=0.027)的mRNA水平均明显升高,而给予HucMSC-cm预处理,则可抑制IL-6(P=0.003)及IL-8(P=0.002)的mRNA水平(图 2C,D)。
2.3 HucMSC-cm抑制LPS诱导的肺血管内皮细胞表面粘附分子的表达进一步探究HucMSC-cm在体内对肺微血管内皮细胞粘附分子的影响。结果发现LPS组ICAM-1(P < 0.001)及VCAM-1(P=0.001)蛋白水平较sham组高,而在HucMSC-cm预处理组,ICAM-1(P=0.001)及VCAM-1(P=0.006)蛋白水平明显下降(图 3A);mRNA水平上结果相同(P < 0.001)(图 3B)。此外,免疫组织化学也证明LPS组VCAM-1的阳性表达较sham组高,并且主要聚集于肺血管周围,而LPS+HucMSC-cm组能有效抑制VCAM-1的表达(图 3C)。
2.4 HucMSC-cm通过激活AMPK减轻LPS诱导的ALI既往研究发现AMPK的活化可以改善ALI[13],本研究检测ALI模型中p-AMPK及AMPK蛋白水平,发现LPS组中p-AMPK蛋白水平较sham组降低(P=0.013),而AMPK蛋白水平未见明显改变;在治疗组中,HucMSC-cm可以改善p-AMPK的表达(P=0.002),而并未改变AMPK蛋白水平(图 4A)。此外,通过免疫组化方法亦得到与前述相似的结果,并且p-AMPK的表达主要分布于血管周围(图 4B)。在体外实验中,用HucMSC-cm及LPS处理肺微血管内皮细胞,得到了与体内一致的结果,即LPS组中p-AMPK蛋白水平降低(P=0.005),而HucMSC-cm可以改善p-AMPK的表达(P=0.003)(图 4C)。因此,HucMSC-cm可以通过激活肺微血管内皮细胞AMPK磷酸化水平缓解LPS诱导的ALI。
2.5 AMPK抑制剂逆转HucMSC-cm对LPS诱导的ALI的保护作用为明确HucMSC-cm对于ALI的保护作用是否通过AMPK途径,本实验通过给予Compound C预处理,发现小鼠肺组织LPS+cm+cc组较LPS+cm组充血水肿更加明显(图 5A);HE染色发现LPS+cm+cc组中肺组织病理学变化更加严重(图 5B)。同时Compound C能抑制体内HucMSC-cm诱导的p-AMPK水平,而不影响AMPK总蛋白水平(图 5C、D)。进一步分析肺组织中炎症因子及粘附分子的变化,发现Compound C处理后能进一步增加IL-6及VCAM-1在肺组织中的表达(图 5C、E)。检测该过程中对于肺血管通透性的影响发现LPS组肺W/D比值小鼠较sham组高(P=0.006),LPS+cm组下降(P=0.004),而AMPK抑制剂组干预后再次上升(P=0.040)(图 5F)。
3 讨论ALI和ARDS是重症监护病房常见的疾病,目前对该疾病认识尚不充分,以至于治疗仍存在缺陷,导致该疾病始终保持较高的发病率和病死率[14]。在临床上,ALI常继发于脓毒血症患者,其中革兰阴性杆菌所致感染较常见[15]。而作为革兰阴性细菌壁的组成成分,LPS由脂质和多糖构成,完全能够模拟构建脓毒症和ALI模型,并且已在大量研究中得到证实[16-17]。在本研究中通过给予气管内注射LPS,足以引起肺部炎症反应,这也与已有的研究相一致[18]。本研究发现,在LPS处理72 h后的小鼠肺组织充血水肿,HE染色可见正常的肺结构破坏,肺泡塌陷,肺泡及肺间质中大量炎性细胞浸润,Western Blot及免疫组化法检测发现肺组织中炎症因子IL-6明显上升。
在近几年的研究中,间充质干细胞已成为在炎症疾病中候选的治疗方法[19], 并且此前已有研究证明间充质干细胞可以减轻LPS诱导的炎症因子[20];而与细胞相比,细胞培养基更容易保存及运输,且没有细胞给药造成的不良反应,如排斥反应、致瘤性、致血栓性等[21-22]。在不同来源的间充质干细胞中,脐带间充质干细胞来源丰富,收集方便,生长较快,能分泌更多类型的因子来构建免疫抑制环境[23-24]。同时脐带间充质干细胞及其条件培养基也都被证明具有抗炎作用[25-26]。然而,脐带间充质干细胞上清液在LPS诱导的ALI中的作用机制尚未明确,本研究使用HucMSC-cm处理LPS构建的ALI的小鼠,发现小鼠肺组织充血水肿有所改善,病理学检查同样发现小鼠肺组织结构有所恢复,肺泡及肺间质中炎性细胞减少,Western Blot及免疫组化检测发现肺组织中的IL-6表达下降。从而有效证明了脐带间充质干细胞上清液能保护由LPS诱导的ALI,进一步验证发挥作用的机制。
ALI和ARDS发病早期大量炎症因子浸润在肺组织,这与本研究动物模型病理结果一致,并且中性粒细胞是早期炎症的核心因素[2]。在发生ALI后,中性粒细胞会迅速向肺损伤部位迁移,而这一过程主要是由于肺血管内皮细胞被激活,内皮细胞上粘附分子ICAM-1和VCAM-1表达增加,与血管中的中性粒细胞表面的选择素结合,中性粒细胞牢固地粘附在炎症部位的毛细血管内皮上,随后中性粒细胞在粘附处发生扁平化和极化,在内皮管腔表面爬行并从血管渗出,沿着趋化因子的浓度梯度移动到炎症部位。因此,造成ALI炎症聚集的前提是肺血管内皮细胞激活,粘附分子表达增高。既往研究发现在ARDS患者死亡后的肺组织样本中,ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的表达明显升高[27]。同样在本实验中,当气管内注射LPS后,小鼠肺组织中粘附分子ICAM-1及VCAM-1表达较sham组升高,但是HucMSC-cm对于LPS诱导的ALI中的粘附分子的影响并不清楚,因此在本研究中发现使用脐带间充质干细胞上清液治疗后,无论在蛋白水平还是mRNA水平,这两种粘附分子都能被明显抑制。另外,本研究通过免疫组化法更直观地观察到,HucMSC-cm对于LPS诱导的VCAM-1的抑制主要体现在肺微血管内细胞上,从而证明了HucMSC-cm主要是通过下调肺组织中的粘附分子、减少中性粒细胞与内皮细胞粘附减少炎症反应。
AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,近期对其的研究逐渐扩展到炎症反应及氧化应激。既往研究发现,通过5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷激活动脉内皮细胞AMPK时,可以抑制ICAM-1及VCAM-1表达,从而减少白细胞粘附在内皮细胞抑制炎症[28];亦有研究证实,二甲双胍通过激活巨噬细胞AMPK表达从而抑制LPS诱导的炎症因子及趋化因子表达,达到抑制炎症的作用[29]。基于AMPK活化可抑制粘附分子及炎症因子的表达,笔者猜测HucMSC-cm是否通过激活AMPK活性达到抑制粘附分子的表达。因此本研究首先检测各组小鼠肺组织中p-AMPK及AMPK的表达,发现在LPS刺激后,p-AMPK表达明显受到抑制,而在给予脐带间充质干细胞上清液处理后,p-AMPK表达重新上调,这一过程并未对AMPK总蛋白水平产生影响,在体外实验中得到一致的结果。接下来为进一步证明AMPK的活化在ALI中的作用,给予AMPK抑制剂Compound C预处理,发现HucMSC-cm所诱导的AMPK活性被逆转;并且肺组织中粘附分子ICAM-1、VCAM-1及炎症因子IL-6水平再次上调,说明AMPK活化在脐带间充质干细胞上清液治疗LPS诱导的ALI中起关键作用。
本研究利用LPS诱导的小鼠ALI模型证明HucMSC-cm在ALI中的保护作用,发现HucMSC-cm可以减少LPS诱导的肺组织中ICAM-1、VCAM-1及IL-6的表达,并且证实AMPK在该过程中的重要作用。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈海洋、杨宏锋、虞志新:酝酿和设计实验;陈海洋、沈嘉琪:实施研究;陈海洋:采集数据;陈海洋、沈嘉琪、朱伟:分析/解释数据;陈海洋:起草文章;杨宏锋、朱伟、虞志新:对文章的知识性内容作批评性审阅,支持性贡献
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