2022, Vol. 31
2. 宁夏颅脑疾病重点实验室，银川 750004;
3. 宁夏医科大学总医院重症医学科，银川 750004
2. Ningxia Key Laboratory of Craniocerebral Diseases, Yinchuan 750004, China;
3. Department of Intensive Care Unit, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
肠道被认为是休克患者并发肠源性感染及多脏器功能障碍的“发动机”[1]。肠道是人体最大的免疫器官，包括人体70%的免疫细胞，尤其是肠上皮和固有层内具有丰富淋巴细胞[2-3]。近年研究证实肠道缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）中不仅中性粒细胞等固有免疫细胞参与，淋巴细胞也发挥重要作用，尤其适应性免疫的主要细胞T细胞参与不同疾病模型下多种器官的IRI[4-5]。因此研究肠道IRI中淋巴细胞亚群变化及其调节，对于保护IRI肠屏障，减少全身炎症反应，保护远隔器官，改善休克预后具有重要意义。目前针对肠道IRI缺乏有效的保护手段。外源性一氧化碳释放分子-2（carbon monoxide-releasing molecule-2, CORM-2）是一种携带一氧化碳（carbon monoxide, CO）的新型金属羰基化合物，CO具有抗炎症、抗凋亡、免疫调节等多重效应[6]。本团队前期研究证实CORM-2可减轻休克大鼠肠黏膜机械屏障损伤[7]。本研究拟建立失血性休克大鼠模型，CORM-2预处理大鼠，观察大鼠肠黏膜上皮1型辅助性T（T helper 1, Th1）细胞与调节性T（regulatory T, Treg）细胞及相关炎症因子的表达，探讨CO对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验仪器与试剂本研究使用鼠恒温实验台（成都泰盟公司，中国）、生物机能实验系统（成都泰盟公司，中国）和高速冷冻离心机（Thermo，美国）。实验试剂包括CORM-2（Sigma，美国）、荧光素异硫氰酸酯（fliorescein isothiocyanate, FITC）-葡聚糖（Sigma，美国）、T-bet兔抗鼠多克隆抗体（Abcam，英国）、Foxp3兔抗鼠多克隆抗体（Abcam，英国）重组抗体、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）抗体（Abcam，英国）、白介素10（interleukin, IL-10）多克隆抗体（Thermo，美国）、重组抗转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）抗体（Abcam，英国）。
1.2 药物制备CORM-2溶液的制备：1 mg CORM-2粉剂溶于20 μL的DMSO，振荡均匀，加入980 μL的0.9%的生理盐水，振荡均匀，使得DMSO的终体积分数为2%，药物现用现配。iCORM-2溶液配制：将配制好的CORM-2溶液放置37 ℃恒温箱72 h，打开容器盖，避光保存48 h，待药物释放完全后使用。
1.3 失血性休克大鼠模型的建立SPF级雄性SD大鼠，9~10周龄，体重280~350 g，购自宁夏医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（宁）2020-000-1。大鼠实验前24 h禁食，自由饮水。实验严格遵循宁夏医科大学总医院动物伦理委员会的各项规定（伦理编号2020-841）。本实验采用Wiggers改良法制备失血性休克大鼠模型。1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。分别经右颈动脉放置23号PE-50聚乙烯管用于监测平均动脉血压（mean arterial pressure, MAP），经动脉导管三通处放血，经左颈静脉置管用于复苏补液准备。导管均充满肝素生理盐水，并通过压力传感器与数据采集卡连接实时记录数据电脑存盘，记录基础血流动力学数据。动静脉穿刺手术完成后，待大鼠生理参数稳定开始诱导休克。用无菌注射器从右颈动脉导管三通处以0.5 mL/min的速度开始放血, 在10 min内将MAP降到40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。通过动脉放血或静脉回输（当MAP > 40 mmHg时放血，MAP < 35 mmHg时回输）以维持实验大鼠MAP在35~40 mmHg间的休克状态2 h，休克模型即建立成功。休克维持2 h后行液体复苏，经静脉导管输注复苏液，复苏液为回输所失的血量并加上1.5倍失血量的林格液，30 min内将MAP升到血压稳定后停止复苏，观察血流动力学稳定30 min。实验结束后，拔除导管观察24 h，记录生存情况。
1.4 实验分组及预处理56只SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为7组，即假手术组、休克组、DMSO组、iCORM-2组、CORM-2 2 mg/kg组、CORM-2 4 mg/kg组和CORM-2 6 mg/kg组，每组8只。假手术组大鼠仅置入相关导管，不进行失血性休克相关建模操作。不同浓度CORM-2组于制作休克模型前即刻腹腔注射2 mg/kg、4 mg/kg及6 mg/kg CORM-2药物。iCORM-2组干预药物浓度为6 mg/kg，于制作休克模型前即刻腹腔注射；DMSO组于制作休克模型前即刻腹腔注射与iCORM-2组等量的2% DMSO溶液。休克组和假手术组不予其他预处理。
1.5 大鼠血流动力学监测假手术组分别于大鼠颈动脉置管后即刻（即0 h）、1.5 h、2.5 h和3 h记录MAP变化。其余6组大鼠于置管后即刻（或休克前）、置管后1.5 h（或休克后1 h）、置管后2.5 h（或休克后2 h）、置管后3 h（或复苏后）记录MAP的动态变化。
1.6 大鼠肠道通透性的测定各组术后23 h使用FITC-葡聚糖作为渗透性标记物测试大鼠同一部位肠壁通透性。1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠恒温实验台。寻找回盲部，分离结肠与回肠，结扎约4 cm末端回肠的两端，并将400 μL FITC-葡聚糖（25 mg/mL）注射到肠腔中。1 h后留取大鼠血液标本5 mL，离心（12 000 r/min，4 ℃，10 min），将血清（500 μL）与500 μL PBS混合，并通过荧光分光光度计检测大鼠血清内FITC-葡聚糖的荧光强度(激发光波长：488 nm，发射光波长：525 nm），根据标准曲线计算FITC-葡聚糖浓度，进行肠道通透性检测。
1.7 大鼠肠黏膜病理形态学观察各组术后24 h留取大鼠同一部位回肠组织，4%多聚甲醛溶液固定后，经乙醇脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察肠黏膜形态，并用Chiu 6级评分法对肠黏膜损伤程度进行评价[8]。
1.8 免疫组化检测大鼠回肠组织淋巴细胞T-bet和Foxp3转录因子的表达各组术后24 h留取大鼠同一部位回肠组织，4%多聚甲醛固定。将组织脱蜡并用dd-H2O冲洗。洗涤后，加入1 500~3 000 mL柠檬酸盐缓冲液，在封闭缓冲液中孵育30 min。样品用稀释的一抗缓冲液在4 ℃下孵育过夜，抗T-bet抗体、抗Foxp3抗体稀释比分别为1∶250和1∶150。在洗涤一抗后，加入适量的HRP标记兔抗山羊二级抗体（40 min，室温）。然后用DAB（ZSGB-BIO，中国北京）显色液显示背景。免疫组化结果判定以细胞核中出现棕黄色为阳性，每只大鼠选取3张切片，每张切片随机选取5个视野，显微镜下观察载玻片染色情况。利用ImageProPlus图像分析技术分析靶蛋白的平均吸光度值。
1.9 大鼠回肠组织IFN-γ、IL-10、TGF-β炎症因子水平的表达各组术后24 h留取大鼠同一部位回肠组织。Western blot检测回肠组织IFN-γ、IL-10、TGF-β蛋白水平。裂解回肠组织提取总蛋白，用BCA法定量后，进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。脱脂奶粉封闭1.5 h，分别加入IFN-γ、IL-10、TGF-β抗体（均1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记山羊抗兔（1∶3 000稀释），室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL显影，用ImageJ分析软件测定各蛋白条带灰度值；实验重复3次。
1.10 统计学方法应用SPSS 22.0软件进行统计分析和数据处理。对计量资料数据进行正态性检验及方差齐性检验，服从正态分布的以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析和Student-Newman-Keuls检验；非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M（Q1，Q3）]表示，采用Kruskal Wallis秩和检验。组内结果随时间变化采用重复测量的多因素方差分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠不同时相MAP的变化休克各组大鼠麻醉后MAP为（101±3）mmHg。大鼠失血（6.5±0.3）mL后MAP降低至（37.0±0.9）mmHg。休克持续2 h后复苏补液，补液后大鼠MAP维持（84±5）mmHg。诱导休克后，休克各组不同时间点血压均低于假手术组（均P < 0.05），且各组休克后不同时相MAP均低于休克前血压（均P < 0.05）。除假手术组之外，其余各组之间置管后3 h（或复苏后）血压差异无统计学意义（均P>0.05）。见图 1、表 1。
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| A：休克前；B：诱导休克后1 h；C：诱导休克后2 h；D：复苏后 图 1 休克大鼠不同时相MAP的变化 Fig 1 Changes of MAP at different time points in rats with shock |
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| 组别 | T0 | T1 | T2 | T3 | F值 | P值 |
| 假手术组 | 101±8 | 101±8 | 102±8 | 103±9 | 0.118 | 0.949 |
| 休克组 | 99±15 | 37±2ab | 37±4ab | 84±12ab | 81.681 | < 0.001 |
| DMSO组 | 102±15 | 36±2ab | 37±3ab | 83±9ab | 114.247 | < 0.001 |
| iCORM-2组 | 98±12 | 37±3ab | 37±3ab | 83±9ab | 137.611 | < 0.001 |
| CORM-2 2 mg/kg组 | 100±11 | 37±2ab | 38±3ab | 85±11ab | 127.514 | < 0.001 |
| CORM-2 4 mg/kg组 | 94±10 | 36±2ab | 38±4ab | 78±9ab | 133.004 | < 0.001 |
| CORM-2 6 mg/kg组 | 96±10 | 38±3ab | 37±4ab | 82±10ab | 129.433 | < 0.001 |
| F值 | 0.457 | 339.190 | 244.197 | 5.271 | ||
| P值 | 0.836 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | ||
| 注：T0为置管后即刻（或休克前），T1为置管后1.5 h（或休克1 h），T2为置管后2.5 h（或休克2 h），T3为置管后3 h（或复苏后）；a为组间不同时间点，与假手术组相比P < 0.05；b为组内不同时相点，与T0比较P < 0.05 | ||||||
如表 2所示，与假手术组相比，休克组、DMSO组、iCORM-2组血清中FITC-葡聚糖浓度增高（均P < 0.05），而CORM-2各组，仅2 mg/kg组血清的FITC-葡聚糖浓度增高（P < 0.05），CORM-2其余各组与假手术组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。与休克组、iCORM-2组和DMSO组相比，CORM-2各剂量组血清FITC-葡聚糖浓度均降低（均P < 0.05）。CORM-2不同剂量组之间比较，血清FITC-葡聚糖浓度差异无统计学意义（均P>0.05），但CORM-2 6 mg/kg血清中FITC-葡聚糖有降低趋势。
| 指标 | 假手术组 | 休克组 | DMSO组 | iCORM组 | CORM-2 2 mg/kg组 | CORM-2 4 mg/kg组 | CORM-2 6 mg/kg组 | H值 | P值 |
| FITC-葡聚糖（μg/mL） | 0.020±0.016 | 5.699±0.438a | 4.517±1.571a | 5.117±1.519a | 0.729±0.396abcd | 0.454±0.261bcd | 0.220±0.214bcd | 27.345 | < 0.001 |
| Chiu评分(分) | 0.89±0.66 | 4.43±0.51ad | 3.64±1.03a | 3.58±0.99a | 3.00±1.68ab | 2.88±0.92ab | 2.58±1.02ab | 47.214 | < 0.001 |
| 注：与假手术组相比，aP < 0.05；与休克组相比，bP < 0.05；与iCORM-2组相比，cP < 0.05；与DMSO组相比，dP < 0.05 | |||||||||
假手术组大鼠回肠黏膜上皮完整，腺体结构清晰，绒毛排列整齐；休克组大鼠回肠绒毛结构消失，绒毛表面游离，肠上皮细胞出现大量坏死，结构不连续，破坏明显，有大量炎症细胞聚集；CORM-2 4 mg/kg组和6 mg/kg组大鼠回肠上皮细胞少量坏死，绒毛部分节段结构不连续，未见明显水肿，较其他休克组明显改善；见图 2。由表 2可见，与假手术组比，休克各组肠黏膜组织病理Chiu评分均升高(均P < 0.05)；与休克组、iCORM-2组和DMSO组相比较，CORM-2不同剂量组Chiu评分均降低(均P < 0.05)；但CORM-2各剂量组之间比较，肠黏膜组织病理Chiu评分无差异（均P>0.05）。
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| 图 2 各组大鼠回肠组织病理改变的比较（HE染色，×100） Fig 2 Comparison of histopathological changes of ileum of rats in each group (HE staining, original magnification×100) |
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各组大鼠肠黏膜上皮T-bet、Foxp3表达情况见图 3。
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| 箭头所指为细胞核中出现棕黄色，视为阳性细胞 图 3 各组大鼠肠黏膜T-bet、Foxp3表达（免疫组化，放大倍数×400） Fig 3 Expression of T-bet and Foxp3 in intestinal mucosa of rats in each group (immunohistochemistry, original magnification × 400) |
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与假手术组相比，诱导休克后仅休克组和DMSO组肠黏膜淋巴细胞T-bet抗原表达升高（均P < 0.05）；iCORM-2组和CORM-2各剂量组T-bet抗原与假手术组比较差异无统计学意义（均P>0.05），均低于休克组（均P < 0.05）；CORM-2各剂量组T-bet抗原表达与iCORM-2组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。见图 4。
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| 1~7依次为假手术组、休克组、DMSO组、iCORM-2组、CORM-2 2 mg/kg组、CORM-2 4 mg/kg组、CORM-2 6 mg/kg组；与假手术组相比，aP < 0.05；与休克组相比，bP < 0.05；与DMSO组相比，cP < 0.05；与iCORM-2组相比，dP < 0.05 图 4 各组大鼠肠黏膜T-bet、Foxp3抗原阳性表达的平均吸光度值比较 Fig 4 Comparison of average optical density of T-bet and Foxp3 antigen-positive expression in intestinal mucosa of rats in each group |
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与假手术组比较，休克组、DMSO组和CORM-2 6 mg/kg组肠黏膜淋巴细胞Foxp3抗原表达升高（均P < 0.05）；CORM-2 2 mg/kg组、CORM-2 4 mg/kg组及iCORM-2组Foxp3抗原表达较休克组和DMSO组均减低（均P < 0.05），但CORM-2 6 mg/kg组与休克组或DMSO组比较差异无统计学意义（均P>0.05）；休克组和DMSO组之间Foxp3抗原表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
2.5 各组大鼠回肠组织IFN-γ、TGF-β、IL-10蛋白表达水平比较与假手术组相比，休克组、DMSO组、iCORM-2组和CORM-2 2 mg/kg组IFN-γ表达升高（均P < 0.05）；CORM-2各剂量组中，仅CORM-2 6 mg/kg组较休克组、iCORM-2组和DMSO相比IFN-γ表达明显降低（均P < 0.05）。见图 5。
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| 1~7依次为假手术组、休克组、DMSO组、iCORM-2组、CORM-2 2 mg/kg组、CORM-2 4 mg/kg组、CORM-2 6 mg/kg组；与假手术组相比，aP < 0.05；与休克组相比，bP < 0.05；与DMSO组相比，cP < 0.05；与iCORM-2组相比，dP < 0.05 图 5 各组大鼠回肠组织IL-10、IFN-γ、TGF-β蛋白相对表达水平比较 Fig 5 Comparison of expression levels of IL-10, IFN-γ, and TGF-β protein in ileum of rats in each group |
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与假手术组比较，仅CORM-2各剂量组TGF-β蛋白表达升高（均P < 0.05），其余各组TGF-β蛋白表达与假手术组差异无统计学意义（均P>0.05）；CORM-2各剂量组中，4 mg/kg组和6 mg/kg组TGF-β表达高于休克组和DMSO组（均P < 0.05）。见图 5。
CORM-2各剂量组IL-10蛋白表达均高于休克组（均P < 0.05），4 mg/kg组和6 mg/kg组IL-10蛋白表达同时高于DMSO组（均P < 0.05）。CORM-2各剂量组中仅6 mg/kg组IL-10蛋白表达较iCORM-2组升高（P < 0.05）。见图 5。
3 讨论休克是由不同原因引起机体有效循环血量减少、微循环灌注不足、细胞代谢紊乱并可引起多器官功能障碍的临床综合征[9]。小肠因其独特的肠绒毛毛细血管袢的分布特点，使之对IRI高度敏感，且肠道是休克时最早损伤、最迟恢复的器官[10]。目前尚缺乏保护肠屏障有效的方法。本研究采用Wiggers改良法建立大鼠失血性休克模型，大鼠维持休克状态120 min, 休克各组MAP均降低，持续至复苏后。休克大鼠回肠黏膜出现柱状细胞与杯状细胞的缺失，绒毛结构消失或排列紊乱，肠上皮大量淋巴细胞浸润。使用FITC-葡聚糖作为渗透标记物检测回肠黏膜组织通透性，结果显示失血性休克大鼠肠黏膜组织通透性增加。以上结果提示失血性休克大鼠肠损伤模型构建成功。
内源性CO是一种气体信使分子, 合适剂量的CO具有抗炎、抗氧化、细胞保护等生理功能[11]。CORM-2是一种新型金属羰基化合物，已被证实在生理条件下能有效地将CO输送到组织中发挥保护作用[6]。本研究使用不同剂量CORM-2干预失血性休克大鼠，结果显示CORM-2干预后休克大鼠回肠黏膜病理损伤减轻，肠黏膜的通透性较休克组降低，证实CORM-2可有效地保护休克大鼠肠黏膜屏障的完整性。其中CORM-2 6 mg/kg对休克大鼠肠黏膜屏障保护作用最强，CORM-2 2 mg/kg的保护作用较弱。
CO保护肠屏障机制尚不清楚。越来越多的证据显示肠道相关淋巴组织是肠IRI的靶标者，也是主动参与者[12]。肠道具有丰富的免疫细胞，淋巴细胞在肠道IRI中发挥重要作用[4-5]。因此，淋巴细胞亚群变化及其调节在保护IRI肠屏障、减少全身炎症反应保护远隔器官功能、改善休克预后中十分关键。本研究探讨CORM-2对休克IRI肠道CD4+T淋巴细胞活化类型及其分泌炎症因子的影响。初始CD4+T细胞根据分泌的细胞因子和功能不同进一步分化为Th1、Th2、Thl7和Treg细胞。多个信号转导子和转录活化子信号通路分子协调CD4+T细胞诱导T-bet表达, 促进Th1细胞的分化[13]。Th1细胞是经典促炎因子，是原生动物的免疫至关重要的一类免疫细胞，可产生IFN-γ[14]。Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的另一种辅助性T细胞，表达特征转录因子Foxp3，分泌IL-10、TGF-β等抑制炎症反应[15]。本研究结果发现休克大鼠肠粘膜淋巴细胞T-bet抗原表达升高，同时肠黏膜IFN-γ表达增高，提示休克肠IRI损伤Th1细胞活化，其促炎介质释放可能参与了肠IRI损伤；CORM-2可能抑制Th1细胞活化，减轻了休克大鼠肠黏膜炎症因子如IFN-γ的释放，减轻缺血肠壁损伤；本研究结果与Nikolic等[16]研究基本一致。
值得注意的是，本研究除证实CORM-2能够抑制促炎因子IFN-γ的释放外，还可上调抗炎因子IL-10和TGF-β的表达，提示CORM-2对休克缺血肠壁的炎症损伤具有抗炎效应。Magierowska等[17]研究证实CO通过上调IL-10和TGF-β发挥抗炎效应促进胃溃疡愈合，与本研究结果一致。总之，以上的证据提示CO可抑制促炎Th1细胞活化引起的炎症反应，或通过促进抗炎因子的释放，减轻失血性休克大鼠缺血肠黏膜的过度激活的炎症反应，保护肠道。然而，本结果提示CORM-2并非增加缺血肠黏膜Treg细胞活化，增加抗炎因子IL-10和TGF-β表达，发挥抑制缺血肠壁炎症反应的效应。本研究分析CORM-2促进IL-10和TGF-β抗炎因子的表达并不依赖于Treg的活化，可能是由其他免疫细胞产生，其具体机制尚待阐明。
综上所述，CORM-2可有效保护失血性休克大鼠肠黏膜屏障，抑制Th1促炎细胞的活化，降低IFN-γ促炎因子表达。CORM-2增加IL-10、TGF-β等抗炎因子表达，减轻缺血肠壁炎症，保护肠屏障。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 牛庆晟：实验操作、论文撰写；张瑞、陈磊：数据收集及整理、统计学分析；王晓红：研究设计、论文修改
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