2022, Vol. 31
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）发病急、病死率高，逐渐年轻化，严重威胁人类健康和生命安全[1-3]。研究表明心肌梗死、心力衰竭等过程伴随着心肌细胞的大量凋亡[4]。近年来大量研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在心肌细胞损伤、凋亡调控中扮演重要角色[5-6]。LncRNA-B230352I09是本小组前期通过RNA测序技术筛选得到，可能与心脏损伤修复相关[7]，然而其具体生物学功能及作用机制目前尚不清楚。LncRNAs时空表达规律对其功能定位有着重要的指导价值[8]。因此本研究拟采用乳鼠心脏组织分析lncRNA-B230352I09的空间组织分布以及时间表达规律，并通过心尖损伤模型观察心肌损伤后lncRNA-B230352I09的表达变化，为进一步探索lncRNA-B230352I09在心肌损伤中的作用机制提供实验依据。
为了探索LncRNA-B230352I09是否通过调控心肌细胞凋亡发挥功能，本研究拟通过体外培养原代心肌细胞，构建缺血性心肌损伤模型，转染lncRNA-B230352I09过表达质粒，检测心肌细胞凋亡情况，可能为心肌梗死的治疗提供新的研发线索。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 新生小鼠C57BL/6鼠购于南方模式生物有限公司，本实验对动物操作符合动物伦理学要求（No: 201804001Z）。
1.1.2 试剂与仪器实时荧光定量（RT）PCR仪（ABI公司，美国）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、探针、定量PCR试剂盒（Life Technology公司，美国）；原代心肌细胞提取试剂盒（Thermo公司，美国）；ROS检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、Hoechst染液（上海碧云天生物科技有限公司，中国）。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学分析利用UCSC网站（http://genome.ucsc.edu），在线分析lncRNA B230352I09生物学特征；catRAPID预测lncRNA B230352I09可能结合的蛋白。
1.2.2 原代心肌细胞的提取和细胞质粒转染选取出生1 d的小鼠乳鼠，采用原代心肌细胞提取试剂盒进行心肌细胞提取。小鼠原代心肌细胞贴壁24 h后，应用Lipofectamine 3000转染试剂将lncRNA-B230352I09过表达质粒（由上海吉玛制药技术有限公司构建）转染至细胞中，转染48 h后处理细胞。
1.2.3 心肌损伤模型构建乳鼠心尖切除模型：该模型构建主要参考先前文献报道[9]。原代心肌细胞缺氧模型：lncRNA-I0C0030C13过表达载体转染心肌细胞48 h后，将培养基更换为无血清无糖培养基，放置于37℃缺氧箱（1%O2，5% CO2）缺氧24 h。
1.2.4 RT-PCR检测取小鼠心脏组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA模板，GAPDH为内参，分别设计扩增基因的引物，其中lncRNA B230352I09的正向引物序列：5'ATCACAACAATCCCTTCCAC3'，反向引物序列：5'GCAACAGAAAAGAAACCAAGA3'。GAPDH正向引物序列：5′GACCTGACCTGCCGTCTA3′，反向引物序列：5′AGGAGTGGGTGTCGCTGT3′。PCR仪上进行扩增，反应条件：95℃ 10 min预变性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，重复40个循环。结果用2-ΔΔCT方法进行分析。
1.2.5 Hoechst染色观察细胞凋亡形态心肌细胞缺氧处理后，吸尽培养液，按照Hoechst染色试剂盒说明书指导加入Hoechst 33258染色液，荧光显微镜观察细胞核形态（正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白）。
1.2.6 活性氧ROS水平检测心肌细胞缺氧处理后，去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，参照活性氧检测试剂盒说明书操作，最后置于荧光显微镜观察，并利用Image-Pro Plus6软件分析绿色荧光的强度（荧光强度反应活性氧的水平）。
1.2.7 心肌细胞线粒体膜电位检测心肌细胞缺氧处理后，吸除培养液，参照线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)方法加入荧光探针JC-1，最后置于荧光显微镜观察：线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，产生红色荧光；线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。
1.3 统计学方法应用SPSS 17.0软件对数据进行统计处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析(LSD-t检验)，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 LncRNA- B230352I09的基本特征LncRNA B230352I09在小鼠基因组定位于7号染色体: 123031415-123066439 forward strand，全长663 bp。与该lncRNA相邻基因有Rbbp6（图 1）。catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)，预测lncRNA结合蛋白发现Rbbp6可能是其结合的蛋白（http://service.tartaglialab.com/email_redir/374511/b75e1e7644）。
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| 图 1 LncRNA B230352I09的生物信息学特征 Fig 1 Bioinformatics characteristics of lncRNA B230352I09 |
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Real-time PCR结果显示，随着心脏发育，在小鼠出生后7 d内lncRNA-B230352I09表达水平呈逐渐下降趋势（图 2A）；取新生1 d小鼠探索lncRNA B230352I09的器官分布情况，显示lncRNA B230352I09在心、脑、肾、肝组织中均有表达（图 2B）；进一步取心脏组织提取心肌细胞检测发现lncRNA B230352I09在非心肌细胞中的表达量明显少于心肌细胞[(1.0± 0.03) vs. (9.2± 3.29)，P=0.013]，提示该lncRNA B230352I09主要表达于心肌细胞。见图 2C。
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| A: LncRNA B230352I09在出生后7 d内的小鼠心脏组织中的表达规律；B : LncRNA B230352I09在出生后1 d的小鼠器官分布；C : LncRNA B230352I09在出生后1 d的小鼠心脏组织分布, aP＜0.05 图 2 LncRNA B230352I09在小鼠心脏中的时空表达规律 Fig 2 Temporal and spatial expression of lncRNA B230352I09 in mouse heart |
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通过real-time PCR检测lncRNA B230352I09在心肌损伤前（d0）、后不同时间点（d1、d3、d5、d7）的表达水平。结果发现，lncRNA B230352I09在心肌损伤后表达水平呈现逐渐下降趋势，相对正常发育小鼠lncRNA B230352I09表达量有升高趋势，但差异无统计学意义[D0(1.0± 0.1) vs. (1.0± 0.08)，P=0.95；D1(0.83± 0.01) vs. (0.84± 0.01)，P=0.49；D3(0.75± 0.06) vs (0.85± 0.1)，P=0.25；D5(0.37± 0.04) vs. (0.43± 0.05)，P=0.16；D7(0.01± 0.001) vs. (0.02± 0.004)，P=0.13]（图 3）。
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| 图 3 lncRNA B230352I09在心肌损伤小鼠心脏中的表达规律 Fig 3 Expression of lncRNA B230352I09 in the heart of mice with myocardial injury |
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培养原代心肌细胞，构建缺氧模型，Hoechst染色试剂盒检测示心肌细胞缺氧损伤后细胞表现出明显的凋亡状态：细胞核致密浓染，呈碎块状，lncRNA B230352I09过表达处理后可明显抑制缺氧损伤后心肌细胞凋亡（图 4）；DCFDA探针法检测缺氧损伤后心肌细胞ROS含量显著升高([(1.0±0.11) vs. (3.8±0.71)，P=0.002])，lncRNA B230352I09过表达干预后明显减少缺氧心肌细胞ROS生成([(3.8±0.71) vs. (1.65±0.56)，P=0.015])（图 5）；JC-1荧光探针检测缺氧心肌细胞线粒体膜电位变化，结果显示lncRNA B230352I09过表达组心肌细胞线粒体膜电位较缺氧组明显增高（图 6）。
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| 图 4 过表达lncRNA B230352I09对缺氧心肌细胞凋亡的影响(×200) Fig 4 Effect of overexpression of lncRNA B230352I09 on apoptosis of hypoxic cardiomyocytes |
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| aP < 0.05, bP < 0.01 图 5 过表达lncRNA B230352I09对缺氧心肌细胞ROS的影响(×100) Fig 5 Effect of overexpression of lncRNA B230352I09 on ROS in hypoxic cardiomyocytes(×100) |
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| JC1 aggregates产生红色荧光，代表线粒体膜电位较高；JC1 monomer产生绿色荧光，代表线粒体膜电位较低 图 6 过表达lncRNA B230352I09对缺氧心肌细胞线粒体膜电位的影响(×200) Fig 6 Effect of overexpression of lncRNA B230352I09 on mitochondrial membrane potential of hypoxic cardiomyocytes |
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前期本课题组采用高通量测序技术获得大量心脏再生相关的差异表达的lncRNAs，并借助生物信息学方法对结果进行初步分析，为挑选具有潜在功能的候选lncRNAs奠定基础。本研究利用UCSC网站（http://genome.ucsc.edu），在线分析lncRNA B230352I09生物学特征，发现lncRNA B230352I09在小鼠基因组定位于7号染色体：123031415-123066439，全长663 bp，与其相邻基因有Rbbp6。通过catRAPID预测lncRNA结合蛋白显示Rbbp6可能为B230352I09的作用靶标。文献报道Rbbp6是肿瘤相关蛋白，参与调控细胞周期、凋亡[10]。LncRNA对染色体临近位置的mRNA可以进行调控表达[8]。因此，推测lncRNA B230352I09很可能通过Rbbp6发挥作用，为后续机制研究提供线索。
本研究通过PCR技术检测发现lncRNA B230352I09在新生乳鼠心脏中的表达随着时间推移逐渐下降，至7 d表达量基本测不出，这和乳鼠心肌再生能力时间窗吻合[11]；进一步研究发现lncRNA B230352I09主要表达于心肌细胞，非心肌细胞中表达甚少。而在心肌损伤状态下lncRNA B230352I09表达量较正常小鼠有所增多。基于上述结果，可推测lncRNA B230352I09在心肌损伤修复过程中可能扮演一定角色。近些年大量研究表明lncRNAs可通过调控心肌细胞增殖、凋亡、心脏分化和心脏重编程等参与心脏损伤修复过程[12-14]。那么在心肌损伤刺激后，lncRNA B230352I09是否通过上述机制参与心脏损伤修复值得进一步探讨。
心肌细胞缺血缺氧再灌注损伤后导致大量细胞凋亡，其中线粒体功能障碍及氧化应激在心肌细胞凋亡过程扮演重要角色。目前已有报道lncRNAs亦可通过调节线粒体功能及氧化应激影响心肌细胞凋亡，如lncRNA-MDRL通过吸附miRNA-361，抑制线粒体降解，减少缺氧复氧的心肌细胞凋亡；LncRNA-HOTAIR通过激活细胞保护激酶AMPKα，减少心肌缺血-再灌注损伤中的氧化应激和心肌细胞凋亡。线粒体膜电位是衡量线粒体功能正常与否的重要指标，而活性氧一定程度可以反映氧化应激水平，因此本研究通过检测细胞凋亡、ROS水平以及线粒体膜电位评估lncRNA B230352I09对损伤心肌细胞的影响，结果发现lncRNA B230352I09能够显著抑制心肌细胞凋亡、抑制ROS生成、提高线粒体膜电位。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈玉梅：设计实验、实施实验、分析/解释数据、起草文章；徐斐翔：实施实验、分析/解释数据；薛明明、汪升：统计分析、技术支持和指导；杜施霖、童朝阳：指导实验设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、经费支持。
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