2022, Vol. 31
脓毒症（sepsis）是临床常见的急危重症，其发病机制仍不十分明确。最新的研究[1-4]中，肠道菌群移位被认为是脓毒症发生发展的一个促因子，但是脓毒症患者是否存在肠道菌群结构的改变尚不十分清楚。细菌16S rRNA是30S核糖体小亚基结构的一部分，通过16S rRNA测序技术能够分类很多不能通过培养等方法明确的细菌种类。因此，本研究通过16S rRNA测序技术检测脓毒症组（ZH组）和非脓毒症组（ZB组）两组患者粪便菌群组成及其丰度，再进行数据分析以比较两组患者在肠道菌群上的差异，以期为脓毒症的发病机制提供新的理论依据，并为治疗方面提供新的思路。
1 资料与方法 1.1 一般资料2015年11月至2016年3月期间于北京积水潭医院，中日友好医院，北京医院，北京安贞医院急诊科就诊并符合Sepsis 3.0诊断标准[5]的脓毒症患者25人。筛选年龄、性别、基础疾病、生活地域等因素与脓毒症组患者相匹配的非脓毒症患者30人。脓毒症组患者的纳入标准：①年龄在40~95岁之间；②此次因为肠道疾病以外的病因入院；③符合脓毒症Sepsis 3.0诊断标准；④3个月内无消化道疾病史；⑤2周内未服用抗生素；⑥2周内未服用益生菌及益生元；⑦长期居住北京。非脓毒症组患者的纳入标准：①年龄40~95岁；②无感染存在；③无急性病；④3个月内无消化道疾病史；⑤2周内未服用抗生素；⑥2周内未服用益生菌及益生元；⑦长期居住北京。本研究获得患者或直系亲属的知情同意并经医院伦理委员会批准(伦理审批号：202109-50)。
1.2 样本采集与检测方法在无菌操作下由肛门指诊辅助排便法收集患者大便约3~4 mL装入冻存管（北京华泰昕生物医疗技术有限公司，中国），立即置入液氮罐（YSD-2-30，上海励珩机电科技有限公司，中国）中，再转移至-80℃冰箱（MDF-U53V，Sanyo，日本）保存。每份样品均进行肠道菌群基因组DNA提取、PCR扩增及产物稀释、PCR产物的混样与纯化，使用TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒（Illumina公司，美国）进行文库构建，构建好的文库经过Caliper仪器Qubit 2.0（Invitrogen公司，美国）检测，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250（Illumina公司，美国）进行上机测序。对测序所得原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）对有效数据进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类。根据OTUs聚类结果，得到对应的物种信息和物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算以及Venn图分析，以得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同分组间的共有和特有OTUs信息等。对细菌群落结构差异进行统计分析，有针对性地找出两组间丰度变化差异显著的物种，并得到差异物种在不同组间的富集情况。同时比较组内差异和组间差异的大小，判断不同分组间的群落结构差异是否具有统计学意义。
1.3 统计学方法两组患者的一般资料数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量数据均先进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher's精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
使用Qiime软件（Version 1.7.0）计算ACE指数、Chao1指数、Goods-coverage指数、Observed-species指数、Shannon指数、Simpson指数。使用R软件（Version 2.15.3）绘制物种累积曲线，并进行Alpha多样性指数分析和绘制箱型图，分别进行T-test和wilcox检验。使用R软件（Version 2.15.3）进行组间差异分析，应用多变量统计学方法主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）和无度量多维标定法（Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS）分析，并绘制PCoA图和NMDS图。应用LEfSe(LDA Effect Size)分析两组间差异显著的物种，并绘制LDA值分布柱状图。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 患者基本情况本研究共纳入25名脓毒症患者和30名非脓毒症患者。比较两组患者的一般临床资料，包括性别、年龄和基础疾病构成情况，两组间差异无统计学意义（表 1）。
| 指标 | 脓毒症组 （n=25） |
非脓毒症组 （n=30） |
χ2/t值 | P值 |
| 性别 | ||||
| 男 | 13 | 14 | 0.155 | 0.694 |
| 女 | 12 | 16 | ||
| 年龄（岁） | 75.00±10.34 | 77.30±12.35 | -0.740 | 0.463 |
| 慢性阻塞性肺疾病a | ||||
| 是 | 3 | 2 | - | 0.650 |
| 否 | 22 | 28 | ||
| 高血压病 | ||||
| 是 | 14 | 19 | 0.306 | 0.580 |
| 否 | 11 | 11 | ||
| 2型糖尿病 | ||||
| 是 | 9 | 8 | 0.556 | 0.456 |
| 否 | 16 | 22 | ||
| 冠心病 | ||||
| 是 | 13 | 13 | 0.411 | 0.522 |
| 否 | 12 | 17 | ||
| 脑梗死a | ||||
| 是 | 5 | 5 | - | 1.000 |
| 否 | 20 | 25 | ||
| 注：a组间比较采用Fisher's精确概率法 | ||||
对本研究所纳入的全部患者的粪便标本进行肠道菌群种类分析，结果显示在对0~10个样本检测时，随着样本量的增加，物种累积曲线表现为急剧上升，提示发现的菌群种类明显增加；当样本量进一步加大到20例后，随着样本量的增加，物种累积曲线趋于平缓，提示随着样本量的增加，菌群种类已经不再明显增加(图 1)。
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| 图 1 物种累积曲线 Fig 1 Species accumulation curve |
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脓毒症组具有1 919个OTUs，非脓毒症组具有1369个OTUs，两组之间有1242个共有OTUs，而脓毒症组（ZH组）特有677个OTUs，非脓毒症组（ZB组）特有127个OTUs（图 2）。
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| 每个圈代表一组样品，圈和圈重叠部分的数字代表两组之间共有的OTUs个数，没有重叠部分的数字代表各组特有的OTUs个数 图 2 多样本的物种多样性Venn分析图 Fig 2 Venn analysis diagram of species diversity of multiple samples |
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通过ACE指数、Chao1指数、Goods-coverage指数、Observed-species指数、Shannon指数、Simpson指数分析比较两组组间物种多样性的差异，结果显示差异均无统计学意义（图 3中A、B、C、D、E、F，全部P>0.05）。
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| A：ACE指数，T-test，P=0.163；Two-wilcox，P=0.8735。B：Chao1指数，T-test，P=0.1896；Two-wilcox，P=0.821。C：Goods-coverage指数，T-test，P=0.1532；Two-wilcox，P=0.9632。D：Observed-species指数，T-test，P=0.2018；Two-wilcox，P=0.6542。E：Shannon指数，T-test，P=0.3282；Two-wilcox，P=0.1593。F：Simpson指数，T-test，P=0.2317；Two-wilcox，P=0.2018。ZB代表非脓毒症组；ZH代表脓毒症组 图 3 两组Alpha多样性指数差异分析图 Fig 3 Analysis of the difference between the two groups by the Alpha Diversity Index |
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结果显示同组内样本距离较近，两组间样本距离较远，表明组内物种组成结构相似，而两组间物种组成结构有差异（图 4）。
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| 每个点表示一个样品，横坐标表示一个主成分，纵坐标表示另一个主成分，百分比表示主成分对样品差异的贡献值。ZB代表非脓毒症组；ZH代表脓毒症组 图 4 两组间基于Unweighted Unifrac距离PCoA分析 Fig 4 Analysis by PCoA based on Unweighted Unifrac distance between two the groups |
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结果显示同组内样本距离较近，两组样本距离较远，表明组内物种组成结构相似，而两组间物种组成结构有差异（图 5）。
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| 每个点表示一个样品，点与点之间的距离表示差异程度。ZB代表非脓毒症组；ZH代表脓毒症组 图 5 两组间NMDS分析 Fig 5 NMDS analysis between the two groups |
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LEfSe (LDA Effect Size)软件能够在组与组之间寻找具差异有统计学意义的Biomarker，即组间差异显著的物种。结果提示，与非脓毒症组相比，脓毒症组Negativicutes纲、Selenomonadales目、Veillonellaceae科、Lachnospiraceae科、Faecalibacterium属、Hafnia属、Lachnoclostridium属、Blautia属及Ruminococcus种菌群丰度明显降低；而Bacilli纲、Coriobacteriia纲、Lactobacillales目、Coriobacteriales目、Clostridiaceae科、Coriobacteriaceae科、Clostridium_sensu_stricto属、Collinsella属及Collinsella_aerofaciens种菌群丰度明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）, 见图 6。
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| 展示了LDA Score大于设定值（默认设置为4）的物种，即组间具差异有统计学意义的Biomarker，展示了两组间丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小（即为LDA Score）。c代表纲（Class），o代表目（Order），f代表科（Family），g代表属（Genus），s代表种（Species），均为细菌物种分类等级。 图 6 LDA值分布柱状图 Fig 6 LDA value distribution histogram |
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脓毒症是由机体对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[6]。脓毒症和脓毒性休克是重要的医疗健康问题，每年影响全球数百万人，其中1/6~1/3的患者死亡[6]。目前认为，脓毒症的发病机制涉及多个方面，如炎症反应失衡、免疫功能紊乱、凝血功能异常、神经-内分泌-免疫网络、细胞自噬、细胞器损伤、遗传学差异等[7-11]，但具体机制仍不明确。
人体内寄居着大量的细菌、古生菌、病毒和单细胞真核生物, 这些与宿主共存的微生物的集合称为微生物群[12]。分布在胃肠道的微生物群通常被称为肠道菌群, 人体的肠道菌群具有数量大、多样性、复杂性和动态性的特点，不仅有助于食物的能量收获，对维持人体代谢、免疫、内分泌等生理功能也有深刻影响[13]。肠道内细菌或(和)内毒素的移位所致的肠源性感染与严重创伤、休克、外科大手术等应激后发生的脓毒症、多器官功能障碍综合征密切相关[14]。当脓毒症患者发生了肠道微生态紊乱，肠道菌群紊乱与肠屏障功能障碍是其重要表现形式，两者之间存在相关性[15]。进一步观察[15]发现脓毒症时肠道致病菌属的扩张与临床感染的病原菌可能具有潜在一致性。由此，推测肠道菌群改变既可能是脓毒症发病的原因，也可能是脓毒症发病过程中引起的并发症。
本研究共纳入25名脓毒症患者和30名非脓毒症患者。当分析单样品内的肠道菌群多样性时，随着样本量的加大，物种累积曲线表现为急剧上升，提示群落中有大量物种被发现；当样本量进一步加大，物种累积曲线趋于平缓，提示此时环境中的物种并未再随样本量的增加而显著增多，则表明抽样充分，可以进行数据分析[16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对菌群进行分类鉴定，以了解脓毒症患者与非脓毒症患者之间肠道菌群的差异情况。研究结果提示两组标本均显示了良好的菌群多样性，且两组间进行菌群Alpha多样性的比较时差异无统计学意义。而在对所纳入的全部患者粪便样本的肠道菌群进行PCoA和NMDS分析时，结果显示出组内物种组成结构相似，而两组间物种组成结构是差异有统计学意义的。因此，本研究继续采用LEfSe软件进行分析以寻找两组间差异显著的物种。LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，用于区别两个或两个以上的生物类群，我们由此来识别两组间菌群结构的不同丰度的特征。结果显示，两组菌群结构表现出的差异有统计学意义，即与非脓毒症组相比，脓毒症组患者肠道菌群中Negativicutes纲、Selenomonadales目、Veillonellaceae科、Lachnospiraceae科、Faecalibacterium属、Hafnia属、Lachnoclostridium属、Blautia属及Ruminococcus种的菌群丰度明显降低；而Bacilli纲、Coriobacteriia纲、Lactobacillales目、Coriobacteriales目、Clostridiaceae科、Coriobacteriaceae科、Clostridium_sensu_stricto属、Collinsella属及Collinsella_aerofaciens种的菌群丰度显著增加。Yang等[17]通过对使用抗生素的脓毒症患者进入重症监护室后的粪便样本进行16S rRNA基因测序，结果发现脓毒症组患者的肠道菌群Alpha多样性降低，且从治疗的第1天到第7天逐渐降低。刘丹等[18]研究也发现在重症监护室中的脓毒症和非脓毒症患者均发生了肠道菌群紊乱, 表现为菌群多样性下降、菌群结构改变、专性厌氧菌减少而兼性厌氧菌增多、有益共生菌减少而机会致病菌增多。刘大全等[19]在盲肠结扎穿孔法制作大鼠脓毒症模型中发现大鼠肠道内双歧杆菌、乳杆菌数量明显减少, 而大肠埃希菌的数量则有所增加，这一结果同样提示脓毒症的发病过程中存在着肠道菌群改变, 与本研究结果是一致的，且在动物模型水平上证明了脓毒症发病过程中存在着肠道菌群结构改变。目前，脓毒症并没有诊断的金标准，其诊断主要依靠一系列的临床症状和体征。研究[20]显示中性粒细胞CD64表达和SOFA（Sequential Organ Failure Assessment）评分是脓毒症患者感染早期诊断和预后评估的重要参数。那么，通过检测患者肠道菌群结构是否发生改变以及改变的程度也许可以成为早期筛查出脓毒症高危患者的手段。本研究结果中脓毒症患者存在的差异物种，可能将来可以作为特征菌群来识别脓毒症的发生，这也为脓毒症的预防、早期发现、早期诊断、早期治疗提供了新思路。
肠道菌群调节受到多种疾病状态的影响，但是具体机制尚不明确。杨小娟等[15]研究发现脓毒症患者紊乱的肠道菌群同肠屏障功能障碍之间存在相关性。Shi等[21]通过16S rDNA扩增和测序发现，慢性血液透析患者的肠道菌群与体内血浆炎性标志物C反应蛋白、IL-6（Interleukin-6）等相关，而对需要进行腹膜透析的患者给予肠道微生态制剂治疗可以显著降低血清TNF-α（Tumor necrosis factor-α）、IL-5、IL-6和内毒素水平，提示肠道菌群受到炎症介质的调节。Wang等[22]研究也揭示了可溶性膳食纤维补充剂对肠道微生物群、黏膜屏障功能的影响，即显著减轻了脓毒症小鼠的黏液厚度、炎症反应和肠道损伤程度。Liu等[23]研究探讨了粪便菌群移植对大鼠可通过正向调节肺部菌群和负向调节肠道菌群来改变肺部和肠道菌群的结构和多样性。Avila等[24]探讨了益生菌和粪便移植对脓毒症大鼠肠道炎症和氧化指标的保护作用，为共生菌和粪便移植可以为药物治疗提供额外的免疫调节益处方面提供新的治疗选择。以上的这些研究都是通过对肠道菌群方面给予相应干预，均展现出了肠道菌群的调节改变在脓毒症治疗方面的良好应用前景。我们也希望通过本次研究结果中发现的脓毒症和非脓毒症患者两组间表现出差异的菌群分类来寻找出脓毒症治疗的新的切入点。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 关岚：实验操作、研究设计、论文撰写；周衡、刘志伟：实验操作、数据收集及整理、统计学分析；王聪、赵斌：研究设计、论文修改
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