2022, Vol. 31
2. 郑州市中心医院重症医学科, 郑州 450001;
3. 郑州大学第一附属医院全科医学科，郑州 450000
2. Department of Critical Care Medicine, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450001, China;
3. General Practice Department, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China
中枢神经系统（central nervous system, CNS）感染性疾病是细菌、病毒、真菌及寄生虫等病原微生物侵犯中枢神经系统的实质、被膜或血管等引起的急慢性炎症性疾病[1-4]；其主要包括脑炎、脑膜炎以及脊髓炎等，具有高发病率和病死率的特点[5]，快速准确的检出病原菌，给予患者及时有效的诊疗对改善患者的预后具有重要的意义。约70%的脑炎病例和15%~60%的脑膜炎病例应用常规检测方法仍无法明确诊断[6]，快速准确地检出CNS感染的病原体仍然具有挑战性。宏基因组二代测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）通过提取临床样本中的DNA或RNA片段直接与微生物数据库中数据进行对比分析，可最大限度的识别微生物序列信息[7-9]。然而目前mNGS在CNS感染性疾病病原微生物检测的应用研究多局限于难以诊断的非典型病原微生物或者特殊病原微生物感染的报道[10-15]。mNGS对CNS感染性疾病病原体的总体诊断价值方面，尚缺乏清晰的认知。本研究中利用mNGS技术检测CNS感染性疾病患者脑脊液样本中的病原体，探讨mNGS技术与传统临床检测方法检出的病原菌特征及检出率差异，评估mNGS技术在CNS感染性疾病病原菌鉴定中的价值和意义。
1 资料与方法 1.1 一般资料以2018年1月至2020年6月郑州大学第一附属医院收治的中枢神经系统感染患者为研究对象。纳入标准：①临床诊断为中枢神经系统感染者，诊断标准主要参考2013年国际脑炎联盟共识[16]和欧洲各国（欧洲神经科学协会联盟（EFNS）、荷兰和英国）脑膜炎诊断标准[17-18]；②行mNGS检测者。同时符合以上2个条件方可纳入本研究。排除标准：①未进行病原菌常规方法检测者；②血炎症指标实验室检查结果均缺失者；符合以上任意一条者均排除出本研究。本严格遵循《赫尔辛基宣言》中人体医学研究的伦理原则，因为回顾性研究故免除患者知情同意，经本院科研和临床试验伦理委员会批准（审批号：2021-KY-0951-002）。
1.2 研究方法收集患者的一般资料：年龄、性别、血常规、C反应蛋白及降钙素原、临床主要症状、抗生素使用情况、住院天数、转归等。病原体检测指标：①脑脊液mNGS检测结果；②常规病原学检测结果，具体包括：脑脊液一般细菌培养以及特殊细菌涂片检查，病毒全套检测、EBV以及CMV的PCR检测，结核杆菌抗酸染色，结核杆菌DNA检测，结核特异性抗原抗体检测（结核特异性外膜抗原抗体测定、结核特异性分泌抗原抗体测定以及结核抗体Ig-G测定）；任一种常规检测方法检测出病原体即可表示常规方法为阳性；③常规辅助诊断结核性感染其他指标：脑脊液腺苷脱氨酶ADA；血T-SPOT。每位患者均进行了常规方法检测以及mNGS检测，将检测结果分为常规方法检测组及mNGS组，对比分析两种方法对病原微生物的检出差异及检出病原菌规律。
1.3 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示；不符合正态分布的计量资料用中位数及四分位数（M(Q1, Q3)]）表示；分类资料采用例数及百分比[n（%）]表示，比较采用χ2检验或Fisher's精确检验；一致性检验以Kappa值表示；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基本情况最终纳入170例患者，年龄最小为28 d，最大为82岁，年龄中位数为43.5（27，55）岁；性别主要以男性为主，占比68.8%；就诊到送检mNGS时间中位数为7（3，15）d；总住院时间中位数为26（18，36）d；重症人数占比43.0%，预后好转占比91.8%；主要临床症状占比从高到低为发热60.6%、头痛39.4%、意识障碍28.8%、乏力10.0%以及精神异常8.8%等。见表 1。
| 一般资料 | 患者(n=170) |
| 年龄[岁，M(Q1, Q3)] | 43.5（27，55） |
| 性别（男/女, n） | 117/53 |
| 就诊到送检mNGS时间[d, M(Q1, Q3)] | 7(3，15) |
| 血炎症指标 | |
| WBC[×109/L，M(Q1, Q3)] | 8.08（5.82，11.22） |
| CRP[mg/L，M(Q1, Q3)] | 12.83（2.07，34.74） |
| PCT[ng/ml，M(Q1, Q3)] | 0.137（0.054，0.560） |
| T[℃，M(Q1, Q3)] | 38.5（37.5，39.0） |
| 主要临床症状（n，%） | |
| 发热 | 103（60.6） |
| 头疼 | 67（39.4） |
| 意识障碍 | 49（28.8） |
| 乏力 | 17（10.0） |
| 精神异常 | 15（8.8） |
| 恶心呕吐 | 15（8.8） |
| 采样前使用抗生素人数（n，%） | 128（75.3） |
| 住院天数[d，M(Q1, Q3)] | 26（18，36） |
| 重症人数（n，%） | 73（43.0） |
| 预后（好转，n，%） | 156（91.8） |
在病原体检出率方面，mNGS检出病原体阳性率达58.23%，而常规检测方法仅为18.82%，差异有统计学意义（P < 0.01）。其中两者均为阳性者占比11.76%，mNGS阳性而常规方法阴性者占比46.47%，12例常规检测方法阳性者mNGS为阴性（表 2，图 2）；经一致性检验，两种检测方法检出阳性病原体Kappa系数为0.03，P=0.587，提示两者检出结果一致性较差。
| mNGS（例） | 常规方法（例） | 合计 | χ2检验 | 一致性检验 | ||||
| 阳性 | 阴性 | χ2值 | P值 | Kappa值 | P值 | |||
| 阳性 | 20 | 79 | 99 | 55.75 | < 0.01 | 0.03 | 0.587 | |
| 阴性 | 12 | 59 | 71 | |||||
| 合计 | 32 | 138 | 170 | |||||
mNGS与常规方法均为阳性的共20例，其中有10例mNGS与常规方法检测出的病原体结果完全一致，病原体种类包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生细胞李斯特菌、结核杆菌、白色念珠菌、新型隐球菌以及人类疱疹病毒5型、人类疱疹病毒4型；而5例部分一致的病原体结果显示，mNGS检测出的病原体多于常规检测方法，且两者有部分重叠；剩余5例两种方法检测出的病原体完全不一致（图 1，表 3）。
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| 图 1 mNGS与常规方法检出病原菌一致性分析 Fig 1 Consistency analysis of pathogens detected by mNGS and conventional methods |
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| 编号 | 常规方法 | mNGS |
| 1 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| 2 | 新型隐球菌 | 新型隐球菌 |
| 3 | 鲍曼不动杆菌 | 鲍曼不动杆菌 |
| 4 | 金黄色葡萄球菌 | 金黄色葡萄球菌 |
| 5 | 白色念珠菌 | 白色念珠菌 |
| 6 | 新型隐球菌 | 新型隐球菌 |
| 7 | 人类疱疹病毒5型 | 人类疱疹病毒5型 |
| 8 | 结核杆菌 | 结核分枝杆菌复合群 |
| 9 | 结核杆菌 | 结核分枝杆菌复合群 |
| 10 | 鲍曼不动杆菌 | 鲍曼不动杆菌 |
| 11 | 单核增生细胞李斯特菌 | 单核增生细胞李斯特菌、无害李斯特菌 |
| 12 | 金黄色葡萄球菌 | 金黄色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、斯氏假单胞菌 |
| 13 | 藤黄微球菌、人类疱疹病毒4型、结核杆菌 | 结核分枝杆菌复合群、人类疱疹病毒4型、细环病毒28型 |
| 14 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌、变栖克雷伯菌 |
| 15 | 鲍曼不动杆菌 | 鲍曼不动杆菌、烟曲霉 |
| 16 | 人类疱疹病毒4型 | 单核细胞增生李斯特菌 |
| 17 | 人葡萄球菌亚种 | 沃氏葡萄球菌、白色念珠菌 |
| 18 | 头状葡萄球菌 | 沼泽库克菌、深黄奈瑟菌 |
| 19 | 小肠肠球菌 | 维罗纳气单胞菌、西宫皮肤球菌 |
| 20 | 肺炎克雷伯菌 | 人类疱疹病毒5型 |
如图 2所示，mNGS检出细菌排名前5位的种类为结核杆菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌；在病毒方面，人类疱疹病毒4型为最多检出的病毒种类，其次有巨细胞病毒、人类疱疹病毒1型等；mNGS检出真菌有近平滑念珠菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等；另外，mNGS也可以检出常规方法未能检出的病原体，如人型支原体、口腔支原体、鹦鹉热衣原体等。在常规方法检测结果中，检测出病原菌较多的为肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌以及金黄色葡萄球菌，病毒为人类疱疹病毒4型，真菌如新型隐球菌等。mNGS检出病原体种类及数量均高于常规方法，如图 2所示（分别为细菌、真菌、病毒检出例数排名前10的种类及特殊病原体）。
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| 图 2 mNGS与常规方法检出部分患者病原菌例数 Fig 2 Number of pathogenic bacteria detected by mNGS and conventional methods in some patients |
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另外，在常规方法阳性而mNGS阴性的12例病例中，其中6例检出病毒（均为PCR所检出），检出的病毒包括EB病毒，带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒1型以及腺病毒；细菌包括表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、溶血葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌及结核杆菌各1例。
除以上病原菌之外，mNGS可检出较多正常菌群或者背景菌，如解葡萄醛酸棒状杆菌、多噬伯克霍尔德菌以及马拉色菌属、互隔链格抱菌等。
2.5 mNGS与常规方法对结核分枝杆菌检测阳性率分析研究纳入的病例中，最终明确诊断为结核性脑炎/脑膜炎者共26例，针对结核分枝杆菌的常规方法有血T-SPOT、脑脊液ADA、脑脊液结核杆菌DNA检测、抗酸染色以及结核特异性抗原抗体检测。在所有检测方法中，抗酸染色的检出率最低；其次为结核特异性抗原抗体（4.0%）和脑脊液ADA（24.0%），三者检测阳性率与mNGS技术相比差异均具有统计学意义（P < 0.05）；血T-SPOT检测阳性率最高，达66.7%；其次为mNGS检测（53.8%），而同为识别结核杆菌DNA的PCR技术阳性率为40.0%；mNGS与常规临床检测方法相结合将检出率提高至80.8%。见表 4。
| 检测方法 | 阳性例数/检测例数 | 检出阳性率（%） | χ2值 | P值a |
| mNGS | 14/26 | 53.8 | — | — |
| 常规方法 | 18/26 | 69.2 | 1.30 | 0.25 |
| 结核特异性抗原抗体 | 1/25 | 4 | 15.25 | < 0.01 |
| 结核杆菌DNA | 4/10 | 40.0 | — | 0.71 |
| 抗酸染色 | 0/24 | 0 | 17.95 | < 0.01 |
| 血T-SPOT | 16/24 | 66.7 | 0.86 | 0.42 |
| ADA | 6/25 | 24.0 | 4.76 | 0.03 |
| mNGS+常规方法 | 21/26 | 80.8 | — | — |
| 注：a与mNGS比较 | ||||
本研究结果显示常规方法对病原菌总体检出阳性率明显低于mNGS方法（18.82% vs. 58.23%，P < 0.05），且两者一致性较差；在20例双阳性患者中，有一半病例的两种方法检测结果不一致或不完全一致，考虑其可能的原因为抗生素等药物的使用对常规方法的检测结果影响较大，且检测病毒的常规方法只能针对特定的病毒，导致常规方法检出病原体种类较局限；相比而言，mNGS可直接识别微生物核酸片段，且可完成微生物分种及分型，因此灵敏性较高，检测范围更广[9]。此外，在标本采集、运输及检测过程中存在较低几率的样本污染可能，也会影响检测结果。当两种方法检测不一致或不完全一致时，需要结合患者临床症状变化、实验室检验指标、影像学检查特征等情况，同时参考mNGS检出病原菌的序列数及病原菌自身属性等信息综合作出取舍。因此，对于临床常规方法较难检测出或抗感染治疗无效等疑难病例，应用mNGS可提高检出病原微生物的机率。
本研究发现临床常规方法检测结果中，检出主要病原菌有肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、新生隐球菌等；mNGS检出主要有肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌、葡萄球菌；真菌如念珠菌、真菌以及隐球菌等；其检出总体病原体种类及数量均高于常规方法。此外，mNGS检测到中枢神经系统感染中不常见的病原体，特殊病原体包括口腔支原体、鹦鹉热衣原体等。既往研究中枢神经系统细菌性感染常见的病原菌有肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及葡萄球菌等；真菌感染常见病原体有念珠菌、隐球菌、真菌、镰刀菌等[19-20]；近些年中枢神经系统细菌性感染的病原谱也在发生着变化，金黄色葡萄球菌以及不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌等逐渐占据前列[21]。本研究常规方法与mNGS方法检出结果与既往CNS部分感染的病原菌有所一致，但mNGS检出种类及数量多于常规方法检出结果。
虽然mNGS对病毒的检出种类及数量均高于常规方法，但对病毒的总体检出率以及检出种类不高。研究中有占比75.3%患者测序前不同程度的使用了抗生素或者抗病毒药物，可使其发生变异或者结构破坏；DNA病毒的片段在一些趋于好转的患者中存在降解或滴度下降，可致其检测不出[22]；另外有些病毒本身是RNA病毒，易发生变异。报道述常见病毒性感染主要有人类疱疹病毒、肠道病毒、丙型肝炎病毒及细小病毒等，其中以HSV-1、HSV-3及CMV等为致病病毒最常见[23-24]。本研究中mNGS检出种类主要为人类疱疹病毒的不同型别，如EBV、CMV以及人类疱疹病毒1型和2型，其他的如腺病毒、细小病毒等。另外本研究发现在常规方法检出阳性而mNGS检出阴性的12例病例中，其中有6例为病毒，均为PCR检出，二者均为核酸检测，有关mNGS与PCR技术的检测差异仍有待加大样本研究。
结核分枝杆菌是一类自身构造以及致病性较为特殊的病原体，其诊断的金标准为结核分枝杆菌的培养或染色结果，其阳性率较低，对疾病的早期诊断价值甚微。对疑似结核感染的患者临床诊疗过程中除培养涂片外，还会应用血T-SPOT、脑脊液ADA等方法进行辅助检测。本研究对结核杆菌的检出发现常规方法以及mNGS对结核性CNS感染检测阳性率由高到低分别为血T-SPOT、脑脊液mNGS、结核杆菌DNA、ADA以及结核特异性抗原抗体检测。血T-SPOT的阳性率稍高于脑脊液mNGS检测，考虑可能结核分枝杆菌在细胞内寄生、细胞较难破裂的缘故。血T-SPOT试验是以T细胞为基础的体外IFN-γ反应测定方法。结核性脑膜炎血T-SPOT检测阳性率可达67.5%；本研究T-SPOT检测阳性率为66.7%，与既往研究基本一致；另有报道结核性脑膜炎中应用mNGS检测阳性率可达78.3%，而本研究结果mNGS的阳性率为53.8%，可能由于本研究mNGS检出阴性的患者中大多数（11/12）不同程度的经验性使用了抗生素或者抗结核药物。
本研究的局限和不足：⑴研究为单中心回顾性研究，样本量相对较少，可能存在选择偏倚。⑵研究主要关注不同检测方法检出的所有病原体的特征，并未探究其是否为真正的致病菌。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明：孟翠翠、袁丁：实施研究、分析/解释数据、论文撰写；余言午、王金柱、郭建军、朱桂英：数据收集及整理；韦毅萌、陈继红、张蕾蕾：统计分析、支持性贡献；高艳霞：研究设计、论文修改、技术支持、获取研究经费
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