2022, Vol. 31
2. 宁夏医科大学临床医学院，银川 750004;
3. 宁夏神经系统疾病诊疗工程技术研究中心，银川 750004;
4. 十堰市太和医院 湖北医药学院附属太和医院重症医学科，十堰442000
2. School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China;
3. Engineering Research Center for Diagnosis and Treatment of Ningxia Nervous System Diseases, Yinchuan 750004, China;
4. Department of Critical Care Medicine, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China
脓毒症（sepsis）是重症监护室的常见病、多发病，它是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。肠道被视作是脓毒症、多器官功能障碍(MODS)的“发动机”，脓毒症患者肠道屏障功能障碍和肠道菌群紊乱在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用[1]，这方面的研究对脓毒症的诊疗具有重大意义。同时，相较于传统的细菌培养技术，现代高通量16S rRNA基因测序技术可以更全面了解肠道菌群结构，是目前人体肠道菌群分析的标准技术[2]。而肠道黏膜损伤的分子标志物中，血D-乳酸和细菌内毒素水平是可靠指标[3]。因此，本研究运用高通量16S rRNA基因测序技术对脓毒症患者进行粪便菌群检测、JY-DLT肠道屏障功能生化指标分析，系统评估脓毒症患者肠道菌群紊乱特点及肠屏障功能障碍，旨在初步探讨肠道菌群紊乱与肠屏障功能障碍之间是否存在联系，并观察临床感染致病菌与肠道菌群中相应致病菌属变化是否存在一致性，从而为改善脓毒症患者肠道微生态紊乱提供临床指导。
1 资料与方法 1.1 一般资料采用前瞻性观察性研究方法，纳入2017年2月至2017年6月收住宁夏医科大学总医院重症医学科(ICU)的脓毒症患者10例(脓毒症组)、同期入住宁夏医科大学总医院ICU且未并发脓毒症的患者10例(非脓毒症组)，并选取本地健康人10例（对照组）作为对照。所有患者纳入标准：①年龄18~75周岁；②脓毒症患者符合2016年美国重症医学会脓毒症的最新定义“Sepsis-3.0”[4]；③预计入组后住ICU时间大于2 d。排除标准：①不符合纳入标准；②肛周感染者；③肠造瘘患者；④慢性胃肠道疾病患者。健康对照组要求：①与前两组患者年龄层次匹配；②身体健康，无慢性疾病及代谢性疾病史（如高血压、冠心病、糖尿病、肝炎、甲亢等）；③无消化道疾病及消化道手术史；④入组前3月内未使用过抗生素、益生菌制剂、肠道营养制剂及其他药物。本研究获得患者或直系亲属的知情同意并经医院伦理委员会批准(伦理审批号：2016-258)。
1.2 观察指标记录脓毒症组和非脓毒症组患者的一般临床资料，包括年龄、急性生理和慢性健康(APACHE Ⅱ)评分、序贯器官衰竭(SOFA)评分、主要诊断、手术类型(腹腔脏器手术和非腹腔脏器手术)、临床感染部位、致病菌(定性培养)、抗生素使用情况(表 1~3)。
| 基础资料 | 健康对照组 (n = 10) |
非脓毒症组 (n = 10) |
脓毒症组 (n = 10) |
H/F/χ2/Z/t值 | P值 |
| 年龄(岁, x±s) | 55 (48.75, 55.25) | 59 (50.00, 74.00)a | 63.50 (44.75, 76.25)ab | 2.05 | 0.36 |
| BMI (kg/m2, x±s) | 23.95 ±2.04 | 27.19 ± 4.40a | 23.91 ±4.09 ab | 2.64 | 0.09 |
| 基础疾病(例) | 0.84 | 0.65 | |||
| 多发伤 | 3 | 4 | |||
| 恶性肿瘤 | 5 | 3 | |||
| 其他 | 2 | 3 | |||
| 手术种类(例) | 0.00 | 1.00 | |||
| 腹部外科手术 | - | 5 | 5 | ||
| 非腹部手术 | - | 5 | 5 | ||
| APACHE Ⅱ评分[M（P25, P75）] | - | 10.00 (7.00, 17.00) | 19.00 (15.25, 21.50) | -2.40 | 0.02 |
| SOFA评分(x±s) | - | 3.30 ±1.42 | 10.80 ±2.97 | -7.20 | ＜0.01 |
| 注: APACHE Ⅱ评分：急性生理评估、慢性健康评估评分系统；SOFA评分：序贯器官功能衰竭评估评分；BMI：身体质量指数 | |||||
| 患者 编号 |
原发感染 部位 |
手术部位 | 入ICU 7 d内抗生素使用类别 |
| S1 | 肺部 | - | 广谱青霉素类 |
| S2 | 腹腔 | 空腔脏器 | 碳青霉烯类+糖肽类 |
| S3 | 肺部 | 空腔脏器 | 碳青霉烯类+恶唑烷酮类 |
| S4 | 肺部 | 骨关节 | 广谱青霉素类+碳青霉烯类 |
| S5 | 腹部 | 空腔脏器 | 广谱青霉素类+糖肽类 |
| S6 | 肺部 | - | 广谱青霉素类+四环素类 |
| S7 | 肺部 | - | 碳青霉烯类+广谱青霉素类 |
| S8 | 腹腔 | - | 碳青霉烯类 |
| S9 | 腹腔 | 空腔脏器 | 碳青霉烯类 |
| S10 | 腹腔 | 空腔脏器 | 碳青霉烯类+糖肽类 |
| 注：Sn代表脓毒症组中编号为n的脓毒症患者，例如S1表示1号脓毒症患者 | |||
| 致病菌 | 培养 标本 |
患者编号 | 对应标本采集时间 （入住ICU后第n天） |
| 鲍曼不动杆菌 | 痰 | S5、S6、S8 | 4、13、23 |
| 嗜麦芽窄食单胞菌 | 痰 | S6、S7 | 1、8 |
| 肠球菌属 | 痰 | S7 | 23 |
| 大肠埃希菌 | 血 | S7 | 1 |
| 注：Sn代表脓毒症组中编号为n的脓毒症患者，例如S5表示5号脓毒症患者 | |||
粪便样品收集及测序：采集脓毒症组患者及非脓毒症组患者入ICU后第1天的粪便标本，以及健康对照组的粪便样本。脓毒症患者及非脓毒症组患者入ICU后第1天自主排便或灌肠后，用采样勺从患者新鲜粪便深处取材，迅速将粪便标本置于专用粪便标本盒内，健康对照组为受试者正常排便后采集到专用粪便标本盒内，然后将装有样品的小粪盒封装、贴上标签后置于液氮罐中，并转移至-80℃的冰箱内冻存。每个粪便样品加790 μL的裂解液（4 mol/L guanidine thiocyanate，250μL; 10% N-lauroyl sarcosine, 40μL; 5% N-lauroyl sarcosine-0.1 mol/L phosphate buffer [pH 8.0], 500 μL），剧烈涡旋后70℃下孵育1h；孵育结束后加入玻璃珠（0.1 mm, 500~750 μL）混合，击打10min（25HZ/S）；后续提取按照抽提试剂盒的说明书进行（E.Z.N.A.®Stool DNA Kit）。利用NanoDrop (Thermo Scientifific)对提取的DNA浓度进行测定。通过引物338F/806R对16SrRNA基因的V3-V4区进行扩增，并利用Illunima Miseq 2×300 bp的平台对PCR产物完成测序。原始测序数据和相关信息可在序列号为PRJNA691455的Sequence Read Archive数据库中获得。
D-乳酸、细菌内毒素检测：采脓毒症组患者入ICU后第1天外周静脉血，每次3 mL于肝素锂抗凝采血管中, 并于采血后0.5 h内利用JY-DLT肠道屏障功能生化指标分析系统进行血清D-乳酸（D-Lac）、细菌内毒素(Endotoxin)水平检测（检测试剂来源：中国北京中生金域诊断技术股份有限公司）。检测流程如下：①开机预热30 min，用肝素锂试采血管采集3 mL静脉血，并以5 000 r/min离心5 min。②试剂反应孔各加入4 µL血浆，插入检测孔，红灯灭取出。③DAO和DLC孔中各加入4 µL稀释液，BT孔中加入4 µL显色液。④放入加热仓，输入患者临床指征，加热15 min后报警响起，对应仓位绿灯闪烁，拔出相应的试剂板，插入检测口，输入相关临床指征，检测并记录数据。实验过程严格按照试剂盒说明书操作。
1.4 统计学方法临床数据采用SPSS 19.0软件进行数据处理及分析，数据均先进行正态性检验及方差齐性检验，正态分布及方差齐的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析(LSD-t检验)；非正态分布的计量资料以M(Q1, Q3)表示，采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
使用USEARCH 8.0处理原始测序数据，并按照97%的序列相似性划分OTU，通过70%的置信度阈值将OTU代表序列与SILVA数据库（http://www.arb-silva.de）比对，获得每个16S rDNA序列的分类学地位。通过Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数等评估各样品的a多样性，利用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis rank sum test多组间进行差异显著性检验。
通过软件R完成PCoA、heatmap以及Lefse的分析。并对脓毒症及非脓毒症患者血D-乳酸和细菌内毒素分别与肠道菌群α多样性指数、主要菌门比例进行Spearman秩相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 组间一般资料比较脓毒症组、非脓毒症组、健康对照组三组间患者年龄和体重指数差异无统计学意义(P＞0.05)。通过χ2检验，脓毒症组与非脓毒症组的基础疾病和手术类型差异无统计学意义(P＞0.05)。同时，脓毒症组的APACHE Ⅱ和SOFA评分显著高于非脓毒症组（P＜0.5）。
2.2 脓毒症组临床感染资料脓毒症组患者原发感染部位以肺部和腹腔为主、在发生了感染后多使用广谱抗生素，具体感染相关临床资料如表 2所示。经过标本的细菌培养，一些脓毒症组患者的痰及血标本培养呈阳性，具体感染病原学及病原学标本如表 3所示。
2.3 脓毒症患者临床感染致病菌与肠道相应致病菌属变化一致性观察分析脓毒症组患者中S5、S6、S7、S8号脓毒症患者痰培养阳性，S7患者血培养阳性。痰培养结果：鲍曼不动杆菌(患者编号为S5、S6、S8)、嗜麦芽窄食单胞菌(患者编号为S6、S7)、肠球菌属(患者编号为S7)；血培养为大肠杆菌（患者编号为S7）。由图 1可见临床细菌培养阳性的脓毒症患者其肠道菌群中已有相应菌属比例升高。
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| Cn表示编号为n的健康人，相对应的柱形图表示其肠道内相应菌属OUT(Operational Taxonomic Unit, 分类操作单元) 丰度 图 1 感染致病菌与肠道相应致病菌属变化一致性观察分析 Fig 1 Observation of the consistency of clinical infection pathogens and intestinal pathogens |
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脓毒症组患者入住ICU后第1天血细菌内毒素水平明显高于非脓毒症组(P=0.01)；而D-乳酸水平比较差异无统计学意义(P=0.82)。见表 4。
| 组别 | D-乳酸 （mg/L） |
细菌内毒素 （U/L） |
| 非脓毒症组 | 15.45 (11.14, 20.83) | 2.26(1.00, 5.84) |
| 脓毒症组(D1) | 13.09 (6.90, 26.45) | 12.14(5.79, 14.46) |
| Z值 | -0.23 | -2.80 |
| P值 | 0.82 | 0.01 |
在对脓毒症肠道菌群特点研究的基础之上采用Sperman秩相关性分析提示：非脓毒症组和脓毒症组患者血D-乳酸水平与其肠道厚壁菌门比例呈负相关，与变形菌门比例呈正相关(均P < 0.05)；与α多样性指数、厚壁菌门+拟杆菌门比例(即F+B)、拟杆菌门比例均无相关性(均P > 0.05)。非脓毒症组和脓毒症组患者细菌内毒素水平与上述指标均无相关性(均P > 0.05)。
| 变量 | D-乳酸 | 细菌内毒素 | |||
| r值 | P值 | r值 | P值 | ||
| 变形菌门比例 | 0.468 | 0.038 | 0.169 | 0.477 | |
| 厚壁菌门比例 | -0.532 | 0.016 | 0.021 | 0.930 | |
| 拟杆菌门比例 | 0.069 | 0.772 | -0.206 | 0.383 | |
| F+B | -0.382 | 0.097 | 0.110 | 0.645 | |
| ACE指数 | 0.126 | 0.596 | -0.084 | 0.724 | |
| Chao指数 | 0.033 | 0.890 | -0.081 | 0.733 | |
| Shannon指数 | -0.274 | 0.243 | -0.035 | 0.885 | |
| Simpson指数 | 0.244 | 0.301 | 0.032 | 0.895 | |
脓毒症发病率、病死率高，早期识别及治疗困难，已经成为困扰全球的问题，进一步提高脓毒症患者的诊疗水平对全球健康问题具有深远的意义[6]。脓毒症3.0定义[4]强调了脓毒症同器官功能障碍间的密切关系，而肠道被公认为器官功能障碍的“发动机”[1]。肠道菌群作为肠道的重要组成部分，发挥着生理影响、生物合成、代谢等重要的生理作用，而危重疾病却导致菌群多样性发生多种变化，如多样性的减少和致病菌的过量过度增长等[7-8]。本研究的前期研究通过脓毒症组、非脓毒症组、健康对照组肠道菌群α多样性、β多样性比较，证实与健康对照组相比较脓毒症组及非脓毒症组无论是菌群数量和分布状态，还是组间结构均存在差异性[10]。通过优势物种Heatmap图显示健康对照组、非脓毒症组、脓毒症组存在共有菌属，但非脓毒症组、脓毒症组患者均出现正常菌属的含量下降、消失及异常菌属的出现。研究发现，厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)是健康对照组粪便菌群的两大主要菌门，两者共占肠道菌群74.4%~97.6%。与健康对照组相比，非脓毒症组、脓毒症组患者厚壁菌门与拟杆菌门之和(即F+B)在粪菌中的比例下降，差异均具有统计学意义(均P < 0.05)。在健康患者粪菌中变形菌门(proteobacteria)比例均 < 10%，而非脓毒症组、脓毒症组患者变形菌门扩张，个别患者比例可高达82%，差异均有统计学意义(均P < 0.05) [5]。因此，不难发现脓毒症和非脓毒症患者肠道菌群紊乱存在三大特征表现：第一、肠道菌群丰度及多样性下降，菌群结构变化且个体间差异更大[8]；第二、优势专性厌氧菌丰度下降、兼性厌氧菌丰度升高[8-9]；第三、有益菌共生菌属含量下降，致病菌属含量增多并可占主导地位[8, 11]。而ICU内的非脓毒症、脓毒症患者肠道菌群结构发生如此大的变化并不令人意外。首先脓毒症患者及非脓毒症患者生理状态发生变化，导致肠道环境及肠黏膜血供改变，发生肠黏膜炎症，进而导致肠道菌群正常生长平衡被打破，出现肠道菌群紊乱[12-14]。其次因为ICU患者都不同程度接触各种内源性调节剂(如儿茶酚胺产生增加、葡萄糖代谢改变和胃肠动力障碍)以及临床干预措施(如质子泵抑制剂、阿片类药物、营养支持和抗生素)都将不同程度影响菌群的居住环境，进而影响菌群结构[15]。
入住ICU的脓毒症及非脓毒症患者发生了肠道菌群紊乱，同时也出现了肠道屏障功能障碍[16]。本研究将脓毒症及非脓毒症患者血D-乳酸、细菌内毒素水平分别与肠道菌群的α多样性指数、主要菌门进行相关性分析。结果表明脓毒症患者肠道厚壁菌门比例与肠屏障损伤程度呈负相关、而变形菌门比例与肠屏障损伤呈正相关。健康人结肠上皮保持着缺氧环境，而ICU内脓毒症和非脓毒症发生肠道炎症或抗生素治疗等会增加结肠上皮细胞氧合作用，从而破坏肠道厌氧环境致使兼性厌氧的变形杆菌门可以进行有氧呼吸而在肠道内扩张，而专性厌氧的厚壁菌门丰度下降。而厚壁菌门是产生丁酸盐的主要菌门，丁酸盐又是肠道上皮细胞的主要能量来源，因此脓毒症患者肠道菌群紊乱可导致肠道上皮细胞丧失能量来源而凋亡[9, 17-20]，导致肠屏障损伤。同时，肠道菌群的组成变化与许多人类疾病有关，但驱动这种失调的机制还不完全清楚。到目前为止的多项研究均提示这种“失调”表现为变形杆菌门的兼性厌氧细菌的扩张[19]。本研究表明入住ICU的脓毒症和非脓毒症患者变形菌门比例与肠屏障损伤呈正相关。有研究表明，抗生素治疗导致小鼠和人类的兼性厌氧变形菌门细菌的非生物扩展[21]。在小鼠模型中，由遗传易感性、化学物质损伤或肠道病原体感染亦可引发肠道炎症导致变形菌门细菌在肠道内不受控制地扩张[22-23]。此外，在低度肠道炎症，包括肠易激综合征[24-25]和代谢综合征[26]的情况下，可以观察到肠道菌群中变形菌门细菌的大量增加。因此认为，肠道内兼性厌氧的变形菌门的扩张可以作为肠道的微生态失调和肠道上皮功能紊乱的标志[27]，从而间接证明肠道厚壁菌门的丰度下降、变形菌门扩张与肠道屏障功能损伤存在一定相关性。
本研究发现痰培养鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠杆菌、肠球菌属阳性及血培养大肠杆菌阳性的脓毒症患者，在行上述培养获得阳性结果之前已可见其肠道内相应致病菌属的扩张，表明临床感染致病菌与肠道致病菌属扩张可能具有潜在一致性。Taur等[24]研究也发现临床感染的病原体与肠道优势致病菌属具有一致性，当肠道内的致病菌含量明显升高成为优势菌属后，则容易出现该种致病菌导致的临床感染。Tamburini等[28]在菌株水平将血流感染与肠道菌群分析进行精准匹配，发现大肠杆菌、肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者在发生感染前可在肠道中找到相应的菌株，提示感染可能来源于肠道；非肠道致病菌引起的血流感染(铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌)，在患者肠道菌群中也可鉴定出相应菌株。Yeh等[8]也观察到肺炎患者痰培养结果与肠道菌群优势菌属具有一致性。感染、创伤及休克等情况下，肠黏膜屏障在缺血缺氧以及炎症打击的情况下出现结构及功能的受损[1]，并且发生肠道微生态紊乱的现象[6]。笔者推测肠腔内大量复制的致病菌及其产物如内毒素可能通过受损的肠道黏膜屏障进入到血液、淋巴液及其他远隔器官，进而导致远端靶器官功能损伤。
脓毒症患者发生了肠道微生态紊乱，肠道菌群紊乱与肠屏障功能障碍是其重要表现形式，两者之间存在相关性。进一步观察发现脓毒症时肠道致病菌属的扩张与临床感染的病原菌可能具有潜在一致性。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 杨小娟：实验操作、论文撰写；杨小娟、刘丹：数据收集及整理、统计学分析；杨晓军：研究设计、论文修改；彭彬彬：实验操作
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