急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一种重症呼吸系统疾病，病死率仍高达40%^[1]，根据病情进展可划分为急性期与恢复期^[2]。除了对急性期损伤肺组织保护作用的研究^[3-8]，近年来对修复期肺组织的重构再生也越来越受到重视^[9-12]。研究表明，促进肺组织再生是ARDS后肺功能恢复的先决条件^[13-14]。笔者之前的研究发现，在小鼠ARDS模型中，有一种表皮生长因子——双调蛋白(amphiregulin, Areg)在肺损伤急性期大量表达，且能减少肺组织的损伤程度，具有显著的肺组织保护作用，这主要是因为Areg能够抑制肺泡上皮细胞凋亡而减轻组织损伤^[15]。研究发现，除了抗凋亡作用，Areg还能促进细胞增殖分化，加快多种组织在损伤后的修复速度^[16-22]。然而，在ARDS恢复期，Areg是否能够促进损伤肺组织的修复重建至今仍不清楚。本实验采用细菌内毒素诱发的小鼠ARDS模型，观察Areg在恢复期是否能通过加速炎症反应消退、肺泡屏障恢复、肺泡结构重建而促进肺组织的修复，以期为临床上ARDS的治疗提供新的理论依据和实验基础。

成年雄性C57BL/6小鼠[购于由北京维通利华实验动物有限公司，实验动物许可证编号：SCXK (京) 2016-0006]，体重20~25 g，鼠龄6~8周，实验在SPF环境下，控制室温(23± 1)℃，湿度(65± 5) %，光照时间和黑暗时间各12 h。本实验使用重组小鼠Areg(美国R & D systems公司)、脂多糖(美国Sigma公司)、BCA试剂盒(美国Thermo Scientific公司)、IgM、TNF-α、IL-6、IL- 1β ELISA检测试剂盒(欣博盛有限公司)、Areg ELISA检测试剂盒(美国R & D systems公司)、SDE-PAGE配胶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、抗表皮生长因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)抗体(英国Abcam公司)、抗磷酸化- 表皮生长因子(p-EGFR)抗体(美国CST公司)、抗β -actin抗体(武汉安特捷生物技术有限公司)、山羊抗兔IgG抗体(美国Proteintech公司)、抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗体(美国CST公司)、抗表面活性蛋白-C(surface proteins-C, SP-C)抗体(英国Abcam公司)、ECL化学发光试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)。

相关实验操作程序已取得湖北医药学院实验动物使用与伦理管理委员会批准[批准号：湖北医药学院动(福)第2020—实022号]。采用随机数字法将小鼠分为以下5组，每组4只：①对照组(Control组)，在小鼠主支气管滴注PBS (2 mL/kg)；② Areg组，在小鼠主支气管滴注PBS(2 mL/kg)，30 min后腹腔注射重组Areg蛋白(recombinant amphiregulin protein, rmAreg) (5 μ g/ 只)；③ LPS+PBS组，在小鼠主支气管滴注LPS(3 mg/kg)，30 min后腹腔注射PBS (2 mL/ kg)；④ LPS+Areg组，在小鼠主支气管滴注LPS (3 mg/kg)，30 min后腹腔注射rmAreg (5 μ g/ 只)；⑤ LPS+Anti-Areg组，在小鼠主支气管滴注LPS(3 mg/kg)，30 min后腹腔注射Areg中和抗体(amphiregulin neutralizing antibody, Anti-Areg) (50 μ g/ 只)。每隔24 h经同一路径重复给予相同剂量的同种试剂，分别于ARDS后1、3、5、7 d处死小鼠，取肺组织及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。此外，气管内插管且滴注LPS后不进行任何处理，分别于0~7 d处死小鼠，取BALF测Areg浓度变化。

取小鼠左肺，经4% 多聚甲醛固定、酒精脱水、石蜡包埋、切片、病理HE染色后观察各组小鼠肺组织病理学改变，随机选择20个镜下视野，然后进行肺损伤程度的评分，评判方法见表 1。

充分暴露小鼠肺组织，用1 mL PBS反复冲洗肺组织3遍得到小鼠BALF，于4 ℃下离心5 min (800 g)，取上清液，在酶标仪上(562 nm)测得吸光度，根据标准品的浓度和OD₅₆₂制作标准曲线，从而计算各个样本的蛋白浓度。

取每组小鼠BALF离心得到上清液后，严格遵循ELISA双抗夹心法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IgM含量。

取每组小鼠的右肺制得蛋白上样液，将其加入10% SDS-PAGE凝胶中进行电泳；在PVDF膜上进行转膜；5% 脱脂牛奶进行封闭2 h；将封闭好的PVDF膜分别放入p-EGFR抗体(1 ∶ 1 000)、EGFR抗体(1 ∶ 1 000)、β -actin(1 ∶ 1 000)、PCNA(1 ∶ 1 000)及SP-C(1 ∶ 1 000)中，置于4℃冰箱16 h进行孵育；TBST清洗后将条带用辣根过氧化物酶标记二抗(1 ∶ 10 000)室温摇床上孵育1 h；TBST再次清洗后ECL进行显影。

取每组小鼠肺组织石蜡切片，60 ℃烘片30 min；二甲苯脱蜡；降浓度梯度水化；微波炉中进行抗原修复(高火5 min，中火5 min)，0.1%Triton-100破膜40 min，BSA封闭1 h，在封闭好的切片上滴加PCNA(1 ∶ 500)及SP-C(1 ∶ 500) 中，置于4 ℃冰箱16 h进行孵育；PBST清洗后，分别滴加荧光二抗置于湿盒中避光孵育1 h (1 ∶ 1 000)；PBST清洗后Dapi避光5 min；再次清洗后滴加抗荧光淬灭剂并进行封片，荧光显微镜下观察蛋白表达情况。

采用Graphpad 7.04软件对实验数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料采用均值±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与正常小鼠相比，给予LPS后第1天，ARDS小鼠BALF中Areg浓度显著增高(P < 0.05)，然后在第2天恢复正常。到第3天时，Areg浓度再次显著升高(P < 0.01)，且比第1天升高更加明显，到第5天又降低至正常水平，见图 1。

Areg为双调蛋白；与0 d比较，aP<0.05，bP<0.01 图 1 ARDS后小鼠BALF中Areg的浓度变化 Fig 1 The changes of Areg concentration in BALF in ARDS mice

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如图 2所示，在ARDS第1天，对照组与Areg组小鼠肺组织结构正常；LPS+PBS组的肺组织间隔显著增厚，中性粒细胞浸润明显，蛋白质碎片及透明膜形成增加，呈现严重肺损伤。与LPS+PBS组相比，LPS+Areg组及LPS+Anti-Areg组的肺组织结构及损伤评分无差异。在第3、5、7天，与LPS+PBS组相比，LPS+Areg组的肺损伤病理情况与评分均有明显好转(均P < 0.05)，而LPS +Anti-Areg组的肺损伤却更为严重(均P < 0.05)。

A为ARDS各组小鼠肺组织HE染色（× 400），B为各组ARDS后1、3、5、7 d肺损伤评分；与对照组相比，aP<0.05；与LPS+PBS组相比，bP<0.05，cP<0.05；n=4/ 组 图 2 Areg对ARDS小鼠7 d内肺损伤病理学变化及评分的影响 Fig 2 The effect of Areg in lung injury and the associated score in mice at day 7 after ARDS

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与渗透性的影响与对照组相比，LPS+PBS组的中性粒细胞数量增加，TNF-α、IL-1β、IL-6浓度升高，BALF中总蛋白与IgM含量增加。rmAreg干预显著减少了中性粒细胞的数量(P < 0.01)，降低了TNF-α (P < 0.01)、IL-1β(P < 0.01)、IL-6(P < 0.001)、总蛋白(P < 0.01)与IgM(P < 0.001)的水平；而使用中和抗体(Anti-Areg)可增加中性粒细胞数量、炎症因子与总蛋白含量，见图 3。

Areg为双调蛋白，LPS为脂多糖，PBS为磷酸缓冲盐溶液，Anti-Areg为双调蛋白中和抗体，IL为白介素，IgM为免疫球蛋白。A为BALF中中性粒细胞计数；B为BALF中TNF-α含量；C为BALF中IL-1β含量；D为BALF中IL-6含量；E为BALF中总蛋白含量；F为BALF中IgM含量；与对照组相比，aP<0.05；与LPS+PBS组相比，bP<0.05；n=4/ 组 图 3 Areg对ARDS小鼠第3天肺组织炎症反应与渗透性的影响 Fig 3 The effect of Areg in inflammation and permeability of lung tissues in mice at day 3 after ARDS

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ARDS后第5天，与对照组相比，LPS+PBS组的PCNA表达量明显升高(P < 0.01)。与LPS+PBS组相比，Areg使PCNA的表达量进一步升高(P < 0.05)，而Anti-Areg对之无明显影响。与之相似，与LPS+PBS组相比，LPS+Areg组的SP-C表达量显著升高(P < 0.01)，LPS+Anti-Areg组的SP-C表达差异无统计学意义，见图 4。

Areg为双调蛋白，LPS为脂多糖，PBS为磷酸缓冲盐溶液，Anti-Areg为双调蛋白中和抗体，PCNA为增殖细胞核抗原，SP-C为表面活性蛋白-C。A为ARDS后第5天，肺组织中蛋白表达情况；B为PCNA的相对表达；C为SP-C的相对表达；与对照组相比，aP<0.05；与LPS+PBS组相比，bP<0.05；n=4/ 组 图 4 Areg促进ARDS第5天肺组织中PCNA及SP-C的表达 Fig 4 Areg promoted the expressions of PCNA and SP-C in lung tissues at day 5 after ARDS

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ARDS后第5天，与对照组相比，LPS+PBS组的PCNA+SP-C双表达细胞(P < 0.01)含量明显升高。与LPS+PBS组相比，Areg使PCNA和SP-C双表达细胞的表达量进一步升高(P < 0.01)，而Anti-Areg则有所下降(P < 0.01)，见图 5。

Areg为双调蛋白，LPS为脂多糖，PBS为磷酸缓冲盐溶液，Anti-Areg为双调蛋白中和抗体，PCNA为增殖细胞核抗原（绿色荧光），SP-C为表面活性蛋白-C（红色荧光），Dapi为4, 6-二脒基-2- 苯基吲哚（蓝色荧光）。A为ARDS后第5天，肺组免疫荧光表达情况（× 400）；B：PCNA++SP-C+细胞双表达情况；与对照组相比，aP<0.05；与LPS+PBS组相比，bP<0.05；n=4/ 组 图 5 Areg促进ARDS第5天肺组织中PCNA及SP-C的表达（免疫荧光检测） Fig 5 Areg promoted the expressions of PCNA and SP-C in lung tissues at day 5 after ARDS by immunofluorescence

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ARDS第3天，与对照组相比，Areg组与LPS+PBS组肺组织中EGFR的磷酸化水平均有升高(P < 0.05)。与LPS+PBS组相比，Areg处理使EGFR磷酸化水平进一步升高(P < 0.01)，而AntiAreg则降低了p-EGFR的表达(P < 0.05)，见图 6。

Areg为双调蛋白，LPS为脂多糖，PBS为磷酸缓冲盐溶液，AntiAreg为双调蛋白中和抗体，EGFR为表皮生长因子受体，p-EGFR为磷酸化表皮生长因子受体。A为ARDS后第3天，肺组织中EGFR活化情况；B为p-EGFR的相对密度；与对照组相比，aP<0.05，；与LPS+PBS组相比，bP<0.05；n=4/ 组 图 6 Areg增强ARDS第3天肺组织中EGFR磷酸化的表达 Fig 6 Areg enhanced the expression of phosphorylated EGFR in lung tissues at day 3 after ARDS

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本次研究采用了经典的LPS-ARDS模型，主要通过细菌内毒素造成肺泡上皮细胞的凋亡，肺泡- 毛细血管屏障的破坏，蛋白质、炎症因子等渗出。笔者之前的研究发现，在小鼠ARDS急性期，Areg在肺组织中有大量表达，且可以显著减轻肺组织的损伤程度^[23]。然而，Areg对急性肺损伤后的组织修复作用仍不清楚。此次研究发现，Areg可以激活EGFR信号通路，促进小鼠肺泡上皮细胞增殖，加速损伤后的肺组织炎症反应消退与结构恢复。

ARDS发生后，肺组织会经历急性期与恢复期。Johnston等^[24]的研究发现，小鼠肺损伤发生后2~3 d，ARDS由急性期发展为恢复期。在未损伤小鼠肺泡灌洗液中存在着Areg，即Areg在机体内存在基础分泌。笔者之前的实验已证实，早在细菌内毒素诱发肺损伤6 h内，肺泡中的Areg表达就有显著升高，到12 h时其分泌水平达到高峰，之后逐渐降低^[15]。但之前对Areg的表达检测只限定于24 h内。本研究对Areg的检测延长到ARDS发生后7 d，结果发现，除第1天表达升高外，肺组织中的Areg水平在肺损伤后第3天再次升高，到第5天才降低至正常水平。由此可见，在细菌内毒素引发ARDS后，肺组织中的Areg表达出现两次高峰，第一次出现在肺损伤急性期，第二次出现在3 d后的恢复期，提示在恢复期Areg很可能也会对肺组织产生重要作用。

为研究Areg对肺损伤恢复的影响，本实验于内毒素诱发小鼠肺损伤30 min后开始给予外源性Areg。结果发现，ARDS发生后给予Areg(后处理) 并不能降低1 d时肺组织的病理损伤程度、炎症因子水平与肺水蛋白浓度，说明Areg后处理不能减轻ARDS的急性期肺损伤。本研究结果与Areg减轻ARDS肺损伤的研究不同，这可能是因为在之前的研究中，Areg是在肺损伤发生前30 min就注入小鼠体内，属于Areg预处理^[15]，而本研究采用的是Areg后处理。由此可以推断，只有Areg预处理可以通过激活EGFR-Akt信号通路抑制TNF-α死亡信号通路，进而减轻急性肺损伤，而Areg后处理不能抑制ARDS损伤后激活的TNF-α信号通路，故对ARDS急性期的肺组织并没有明显的保护作用。因此，本研究在内毒素诱导ARDS发生后将外源性Areg注入小鼠体内，确保了各组ARDS小鼠在急性期的肺损伤程度一致。

ARDS肺组织在急性损伤后的修复伴随着炎症反应消退、肺组织渗透性降低与病理结构改善^[24]。本实验结果显示，ARDS发生后持续给予Areg (1次/d)，在第3天时，肺泡中TNF-α、IL-6与IL-1β的表达量显著降低，肺泡中IgM浓度与肺水含量减少；在第5天时，肺泡结构的再生与形成也更加明显。此外，本研究还使用Areg的中和抗体(Anti-Areg)来抑制内源性Areg的作用，结果显示Anti-Areg抑制了炎症因子降低、肺水蛋白减少与肺泡结构重建。因此，这些实验结果说明Areg能够促进ARDS损伤肺组织的修复。之前已有研究报道了Areg能促进皮肤^[17-18]、角膜^[19]、肌肉^{[16, 20-21]}、肾脏^[22]的损伤愈合，本研究进一步证实了Areg对受损的肺组织也有明显的修复功能。

研究已证实，在肺泡的再生恢复过程中，肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelium type Ⅱ，AT Ⅱ) 是主要的功能祖细胞，不仅具有增殖能力，还能分化为AT Ⅰ来构建肺泡- 毛细血管屏障，维持肺组织功能，因此AT Ⅱ的增殖水平升高能明显促进肺泡结构再生与功能恢复^[25]。AT Ⅱ表面含有多种特异性活性蛋白，其中SP-C的表达占比高达65%，故常用SP-C的表达情况来判断肺组织中AT Ⅱ的数量^[26-27]。鉴于Areg处理后第5天，损伤肺组织的修复有显著改善，本实验检测了ARDS后第5天肺组织的SP-C含量，同时检测增殖信号PCNA表达。结果显示，外源性Areg显著提高了SP-C与PCNA的表达水平，这提示Areg能明显促进AT Ⅱ的增殖。同样通过对损伤后第5天各组肺组织免疫荧光学的检测，发现Areg促进肺的PCNA及SP-C的双表达，再次提示Areg可以促进AT Ⅱ的增殖情况。之前有研究报道，Areg可以通过调节支气管上皮细胞增殖分化，减轻肺组织纤维化^[28-30]。本实验证明Areg能通过促进AT Ⅱ细胞增殖，促进ARDS肺泡结构的恢复。

EGFR是Areg的唯一受体，广泛存在于多种脏器组织(包括肺组织)中。其活化形式为磷酸化EGFR(p-EGFR)，除抑制细胞凋亡外，还能促进细胞的增殖和迁移，从而加速损伤组织的修复^[31]。已有研究证实，EGFR通路活化可以促进肠道上皮细胞、肾小管上皮细胞与心肌细胞的增殖修复^[32-34]，还可以通过促进皮肤血管的生成及角质细胞的增殖而促进皮肤的愈合^[35]。在本实验中，由于肺组织内Areg的表达水平再次升高出现于ARDS后第3天，且Areg处理后第3天损伤肺组织有了明显的好转，因此本实验检测损伤第3天肺组织的EGFR活化情况。结果显示，给予外源性Areg显著增加了肺组织内EGFR的磷酸化水平，而Anti-Areg则对EGFR的活化有明显的抑制作用。结合之前的实验结果，可以得出EGFR通路的活化介导Areg促进ARDS肺组织修复的作用。

综上所述，Areg在ARDS恢复期通过激活EGFR通路，促进AT Ⅱ细胞增殖，从而促进肺组织内炎症反应消退、肺泡屏障功能恢复与肺泡结构重建。因此，本实验证明在急性肺损伤中，Areg后处理具有明显的组织修复功能，为临床上ARDS恢复期的治疗提供了理论依据。

利益冲突   所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明   田书宁：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章；蒙臣：酝酿和设计实验、分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、工作支持；罗向红、王贤裕：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持