中华急诊医学杂志  2021, Vol. 30 Issue (12): 1484-1488   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.12.013
中性粒细胞与淋巴细胞比值和中性粒细胞胞外诱捕网与脓毒症肝损伤的临床研究
高飞 , 高嵩 , 惠姣洁 , 梁锋鸣 , 杨挺     
南京医科大学附属无锡人民医院重症医学科,无锡 214023
摘要: 目的 探讨外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio, NLR)联合中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)对预测脓毒症患者发生肝损伤的临床价值。方法 采用前瞻性观察性研究方法,选择2019年03月至2020年06月南京医科大学附属无锡人民医院重症医学科收治的符合脓毒症3.0诊断标准、肝损伤诊断标准的患者作为研究对象,记录患者的基础资料,根据入院时血常规计算NLR,使用PicoGreen荧光定量检测试剂盒检测患者入院时外周血浆游离DNA(cf-DNA/NETs)定量水平,根据是否发生肝损伤,将患者分为脓毒症非肝损伤组和脓毒症肝损伤组,二元logistics回归分析发生脓毒症肝损伤的危险因素,绘制受试者工作特征曲线(ROC),并分析NLR、NETs、NLR联合NETs对预测脓毒症患者发生肝损伤的价值。结果 入选脓毒症患者122例,其中发生脓毒症肝损伤的患者45例,发生率为36.89%。脓毒症肝损伤组NLR为(21.63±4.71),脓毒症非肝损伤组NLR为(15.03±4.71),脓毒症肝损伤组NETs水平为(505.86±250.05)μg/L,脓毒症非肝损伤组NETs水平为(179.27±67.20)μg/L,两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。二元Logistics回归分析发现,入院时NLR(OR=1.470, 95% CI: 1.121~1.926, P<0.05)、NETs(OR=1.018, 95% CI: 1.005~1.030, P<0.05)是脓毒症患者发生肝损伤的独立危险因素。NLR的最佳截断值为16.68,NETs的最佳截断值为317μg/L,联合应用NLR和NETs预测脓毒症患者发生肝损伤的灵敏度为77.78%,特异度为98.70%,曲线下面积为0.930,约登指数为0.765。结论 外周血NLR和NETs水平是脓毒症患者发生肝损伤的独立危险因素,联合应用NLR和NETs对脓毒症患者发生肝损伤具有一定的预测价值。以NLR为16.68、NETs为317 μg/L作为界值,可以作为预测脓毒症患者发生肝损伤的早期预警指标。
关键词: 中性粒细胞    淋巴细胞    比值    中性粒细胞胞外诱捕网    脓毒症    肝损伤    预测    危险因素    
Clinical study on neutrophil to lymphocyte ratio and neutrophil extracellular traps with liver injury in patients with sepsis
Gao Fei , Gao Song , Hui Jiaojie , Liang Fengming , Yang Ting     
Department of Intensive Care Unit, Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214000, China
Abstract: Objective To explore the clinical value of peripheral blood neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR) combined with neutrophil extracellular traps (NETs) in predicting liver injury in patients with sepsis. Methods A prospective observational study was conducted. The patients who met the diagnostic criteria for sepsis 3.0 admitted to the Department of Intensive Care Unit in Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University from March 2019 to June 2020 were selected as the research objects. The basic informations of the patients were recorded. NLR based on blood routine at admission was calculated. PicoGreen fluorescence quantitative detection kit was used to detect the quantitative level of free DNA (cf-DNA/NETs) in the peripheral plasma of patients at admission. According to whether liver injury occurred, the patients were divided into the sepsis without liver injury group and sepsis with liver injury group. Binary Logistics regression analysis was used to predict the risk factors of sepsis with liver injury. The receiver operating characteristic (ROC) curve was drawn. The value of NLR, NETs, NLR combined with NETs in predicting liver injury in patients with sepsis was analyzed. Results A total of 122 patients with sepsis were enrolled, of which 45 patients suffered from septic liver injury, with an incidence rate of 36.89%. The NLR of the sepsis wth liver injury group was (21.63 ± 4.71), the NLR of the sepsis without injury injury group was (15.03 ± 4.71), and the NETs level of the sepsis with liver injury group was (505.86 ± 250.05) μg/L, the level of NETs in the sepsis without liver injury group was (179.27 ± 67.20) μg/L, and the differences between the two groups were statistically significant (all P < 0.05). Binary logistic regression analysis found that NLR (OR=1.470, 95% CI: 1.121-1.926, P < 0.05) and NETs (OR=1.018, 95%CI: 1.005-1.030, P < 0.05) at admission were the independent risk factors for liver injury in patients with sepsis. The best cut-off value of NLR was 16.68, and the best cut-off value of NETs was 317 μg/L. The sensitivity of combined application of NLR and NETs to predict liver injury in patients with sepsis was 77.78%, specificity was 98.70%, the area under the curve was 0.930, and the Youden Index was 0.765. Conclusions The peripheral blood NLR and NETs levels are independent risk factors for liver injury in patients with sepsis. The combined application of NLR and NETs has a certain predictive value for liver injury in patients with sepsis. Taking NLR of 16.68 and NETs of 317 μg/L as the cut-off values, they can be used as early warning indicators to predict liver injury in patients with sepsis.
Key words: Neutrophil    Lymphocyte    Ratio    Neutrophil extracellular traps    Sepsis    Liver injury    Predict    Risk factors    

脓毒症是重症监护室危重患者死亡的最常见原因之一,每年全球约有1 800万人发生脓毒症,病死率约为28%~40%[1]。脓毒症发生时,病原体及其释放的毒素和炎症因子会损害肝脏,轻则肝细胞功能障碍,重则肝损伤,甚至为肝衰竭[2],而脓毒症导致的肝功能衰竭更是危重症患者死亡的重要原因之一[3]。因此尽早识别脓毒症肝损伤、及时适当的治疗对降低患者病死率至关重要。

中性粒细胞是免疫炎症反应中起重要作用的细胞,脓毒症时活化的中性粒细胞参与了肝损伤的发生和发展[4-5]。中性粒细胞和淋巴细胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio,NLR)可直接通过血常规计算,其作为一种非特异度炎症标志物已在多种疾病中被证实可用[6-7]。目前认为中性粒细胞分泌中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是其消灭微生物的机制之一[8],NETs是一种由组蛋白和抗菌蛋白修饰的网状DNA结构[9-10],但NETs的过度产生又会对细胞、组织造成损伤[11],既往的研究也发现外周血NETs水平与脓毒症肝损伤发生具有一定的相关性。

因此,本研究旨在通过观察外周血NLR联合NETs对脓毒症患者发生肝损伤的预测价值,进而对脓毒症发生肝损伤的早期预警和尽早干预提供一定的帮助。

1 资料与方法 1.1 一般资料

采用前瞻性观察性研究方法,选择2019年3月至2020年6月南京医科大学附属无锡人民医院重症医学科收治的脓毒症患者作为研究对象。纳入标准:脓毒症符合脓毒症3.0诊断标准(由SCCM、ESICM联合发布)[12]; 肝损伤诊断定义[13]为(至少包括以下2项):(1)总胆红素(TBIL)>43 μmol/L; (2)血清谷丙转氨酶(ALT)高于正常上限2倍; (3)凝血酶原时间(PT)高于参考值1.5倍或者国际标准化比值(INR)高于1.5倍; 年龄18~80岁; 预计ICU住院时间满24 h及以上。排除标准:基础有慢性肝脏疾病,包括肝脏恶性肿瘤、肝炎、肝硬化等; 胆道梗阻后感染引起的脓毒症; 各种结缔组织病; 各种血栓性疾病。

1.2 研究分组

根据入院时是否发生肝损伤,将患者分为脓毒症非肝损伤组和脓毒症肝损伤组。

1.3 伦理学

本研究符合医学伦理学标准,获得医院伦理委员会批准(伦理审查编号:HS2019006),所有标本的获取和检测均获得患者或家属的知情同意,并在中国临床试验注册中心进行了临床试验注册(注册号:ChiCTR1900022219)。

1.4 研究指标检测

入组患者收住ICU时立即抽取静脉血,送检验科检查血常规,统计中性粒细胞和淋巴细胞计数值,并计算NLR=中性粒细胞/淋巴细胞。主要试剂:人外周血中性粒细胞分离液试剂盒,购自中国天津灏洋华科生物公司; Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA试剂盒,购自美国Thermo Scientific公司。同时EDTA抗凝管留取外周静脉血4 mL,4℃下1 000×g离心15 min,留取血浆,-80℃冰箱保存,血浆复温后取100 μL,使用PicoGreen荧光定量检测试剂盒检测外周血浆游离DNA(cf-DNA/NETs)定量水平。

1.5 临床资料

统计入组患者的年龄、性别、高血压、糖尿病、慢性肾病等基础资料,记录入组患者收住ICU时白细胞(WBC)、前降钙素(PCT)、乳酸(Lac)、TBIL、ALT、PT、INR,计算入院时急性生理与慢性健康状况评分(APACHE Ⅱ评分)、序贯器官衰竭评分(SOFA评分)。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据处理,对计量资料进行正态性检验,正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean ± SD)表示,两组间比较方差齐采用成组t检验,方差不齐采用Mann-Whiney U检验; 计数资料采用χ2检验; 使用二元Logistics回归分析发生脓毒症肝损伤的危险因素; 根据脓毒症患者是否发生肝损伤的预测价值评价,绘制受试者工作特征曲线(ROC),并计算ROC曲线下面积(AUC)。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基础资料比较

最终纳入脓毒症患者122例,男性73例,女性49例,年龄(58.18±11.07)岁; 其中发生脓毒症肝损伤的患者45例,发生率为36.89%。脓毒症肝损伤组患者APACHE Ⅱ评分明显高于脓毒症非肝损伤组(P < 0.05);两组患者年龄、性别、高血压、糖尿病、慢性肾病、SOFA评分等基础情况比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。同时,对脓毒症患者感染来源比较,发现脓毒症肝损伤组中腹腔感染、胆道感染为病因所占比例高于脓毒症非肝损伤组(P < 0.05),见表 1

表 1 脓毒症肝损伤组与脓毒症非肝损伤组资料的比较 Table 1 Comparison of information between the sepsis with liver injury and sepsis without liver injury groups
组别 脓毒症肝损伤组(n=45) 脓毒症非肝损伤组(n=77) t /χ2 P
年龄(岁,Mean ± SD) 58.09±12.28 58.23±10.38 -0.069 0.945
男性(n,%) 28(62.22) 45(58.44) 0.290 0.590
APACHE Ⅱ评分(Mean ± SD) 21.80±8.46 17.35±7.28 3.065 0.003
SOFA评分(Mean ± SD) 11.42±3.12 10.44±2.96 1.733 0.086
高血压(n,%) 21(46.67) 32(41.56) 0.302 0.583
糖尿病(n,%) 14(31.11) 22(28.57) 0.088 0.767
慢性肾病(n,%) 6(13.33) 10(12.99) 0.003 0.956
肺部感染(n,%) 5(11.11) 19(24.68) 3.307 0.069
血流感染(n,%) 2(4.44) 15(19.48) 5.354 0.021
腹腔感染(n,%) 15(33.33) 9(20.00) 8.421 0.004
泌尿道感染(n,%) 3(6.67) 11(14.29) 1.623 0.203
胆道感染(n,%) 18(44.44) 10(12.99) 11.720 0.001
  注:APACHE Ⅱ评分:急性生理与慢性健康状况评分; SOFA评分:序贯器官衰竭评分
2.2 入院时NLR、NETs水平及其他指标比较

两组患者入院时NLR、NETs、Lac、PCT差异有统计学意义(P < 0.05),WBC差异无统计学意义(P>0.05),见表 2

表 2 脓毒症肝损伤组与脓毒症非肝损伤组NLR、NETs水平及其他指标的比较 Table 2 Comparison of NLR, NETs and other indexes between the sepsis with liver injury and sepsis without liver injury groups
指标 脓毒症肝损伤组 脓毒症非肝损伤组 t P
NLR 21.63±4.71 15.03±4.71 8.333 <0.001
cf-DNA/NETs(μg/L) 505.86±250.05 179.27±67.20 8.582 <0.001
WBC(×109/mL) 17.01±6.55 14.88±6.75 1.704 0.091
PCT(ng/mL) 5.72±1.13 4.87±0.71 4.574 <0.001
Lac(mmol/L) 6.56±2.12 4.87±1.29 4.860 <0.001
  注:NLR: 中性粒细胞与淋巴细胞比值; cf-DNA: 游离DNA; NETs: 中性粒细胞胞外诱捕网; WBC为白细胞; PCT: 前降钙素; Lac: 乳酸
2.3 二元Logistics回归分析

把单因素分析中P < 0.15的自变量纳入二元Logistics回归分析中,结果表明NLR、NETs、乳酸是脓毒症患者发生肝损伤的独立危险因素,见表 3

表 3 脓毒症患者发生肝损伤独立危险因素的二元Logistics回归分析 Table 3 Binary Logistics regression analysis of independent risk factors of liver injury in patients with sepsis
变量 β S.E. Wald P OR(95% CI)
NLR 0.385 0.138 7.790 0.005 1.470(1.121~1.926)
NETs 0.018 0.006 7.983 0.005 1.018(1.005~1.030)
PCT 0.858 0.502 2.917 0.088 2.357(0.881~6.307)
APACHE Ⅱ评分 0.101 0.066 2.344 0.126 1.106(0.972~1.258)
乳酸 1.521 0.544 7.821 0.005 4.577(1.576~13.289)
常量 -27.025 7.332 13.587 0.000 /
2.4 NLR联合NETs水平预测肝损伤的价值

以NLR>16.68预测脓毒症患者发生肝损伤的灵敏度为84.44%,特异度为77.92%,曲线下面积为0.885;以NETs>317 μg/L预测脓毒症患者发生肝损伤的灵敏度为71.11%,特异度为97.40%,曲线下面积为0.879;NLR与NETs联合应用预测脓毒症患者发生肝损伤的灵敏度为77.78%,特异度为98.70%,曲线下面积为0.930,与单一指标比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表 4图 1

表 4 NLR、NETs水平对脓毒症患者发生肝损伤的预测价值 Table 4 The predictive value of NLR and NETs levels for liver injury in patients with sepsis
变量 AUC 约登指数 95% CI P 最佳截断值 灵敏度(%) 特异度(%)
NLR 0.885 0.624 0.822~0.947 <0.001 16.68 84.44 77.92
NETs 0.879 0.685 0.809~0.949 <0.001 317.00 71.11 97.40
两者联合 0.930 0.765 0.876~0.983 <0.001 0.68 77.78 98.70

图 1 NLR、NETs及两者联合预测脓毒症患者发生肝损伤的ROC曲线 Fig 1 ROC curve of NLR, NETs and their combination in predicting liver injury in patients with sepsis
3 讨论

脓毒症是由宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[14],脓毒症导致的器官损伤与免疫炎症反应密切相关,而肝脏既是炎症介质的来源,又是脓毒症期间炎症反应的主要部位,其结果是肝细胞坏死和凋亡,最终导致肝脏功能衰竭,甚至导致多器官功能障碍[15-17]。本研究发现脓毒症肝损伤发生率高达36.89%,脓毒症肝损伤组患者APACHE Ⅱ评分、SOFA评分高于脓毒症非肝损伤组,提示脓毒症患者一旦合并肝损伤,病情更加危重。因此,寻找易于诊断、敏感的标志物显得尤为重要。同时,本研究进一步对脓毒症的病因统计分析,发现以腹腔感染、胆道感染为病因引起的脓毒症较其他病因引起的的脓毒症,更容易引起脓毒症相关的急性肝损伤,究其原因可能为腹腔感染、胆道感染本身可能直接对肝脏造成损伤,同时这两者容易合并脓毒性休克,也是脓毒症肝损伤发生的高危因素之一。另外,本研究通过前瞻性观察性研究脓毒症患者的临床数据分析发现,脓毒症肝损伤患者入院时NLR、NETs、Lac、PCT明显高于脓毒症非肝损伤组患者,通过进一步二元Logistics回归分析,结果表明NLR、NETs、乳酸是脓毒症患者发生肝损伤的独立危险因素。由于脓毒症本身往往导致乳酸水平升高,而肝功能不全干扰乳酸代谢,因此本研究最终仅纳入NLR、NETs两项指标判断其诊断价值。

免疫系统的变化和全身性炎症反应与循环细胞组成的变化有关,白细胞计数已被确定为重要的全身性炎症标志物。先前研究的数据表明,白细胞的改变(包括中性粒细胞和淋巴细胞)与炎症性疾病有关。中性粒细胞是免疫炎症反应中起重要作用的细胞,是构成先天免疫防御的第一道防线,中性粒细胞的聚集是控制感染的先天免疫反应的最重要特征之一,这个多步骤的过程包括促炎介质、趋化因子和细胞黏附分子的有序表达[4]。但在严重脓毒症期间,中性粒细胞被招募到感染病灶的情况会明显减少,这些细胞反而在远离感染部位的器官中被不适当的隔离、浸润导致组织损伤,从而导致多个器官功能障碍,并且其与脓毒症的严重程度相关。中性粒细胞的募集除了会损伤肝细胞外,同时也是脓毒症诱发的胆汁淤积的关键组成部分。另外,多项研究发现中性粒细胞分泌NETs是脓毒症导致肝损伤的机制之一。淋巴细胞是机体适应性免疫的主要部分,脓毒症时淋巴细胞计数往往明显下降,提示脓毒症时存在免疫功能障碍,导致机体抗感染能力进一步下降,从而加重脓毒症,淋巴细胞减少与皮质醇产生和神经内分泌应激有关,所以NLR代表了两个负相关的免疫途径:一个代表不受抑制的炎症反应,另一个代表潜在的免疫途径。

NLR是一个容易获得的参数,可以基于全血细胞计数进行分析。本研究发现脓毒症肝损伤患者的外周血NLR水平高于脓毒症非肝损伤患者,当NLR大于16.68时,可以预测脓毒症患者的发生。而使用荧光定量分析技术可以快速测定外周血浆中cf-DNA/NETs水平,为本研究提供技术基础。在本研究中脓毒症肝损伤患者NETs水平高于脓毒症非肝损伤患者,并且当其大于317 μg/L时,可以预测脓毒症肝损伤的发生,对于脓毒症肝损伤的评估具有诊断价值。众所周知,单一指标的诊断价值往往存在灵敏度或特异度的局限性,因此联合指标诊断可以提高诊断价值。本研究经ROC曲线分析提示对于脓毒症患者发生肝损伤的预测,NLR、NETs联合时灵敏度为77.78%,特异度为98.70%,可见对于NLR>16.68、NETs>317 μg/L的脓毒症患者需密切监测肝损伤的发生,尽早干预,以防肝损伤进一步加重,甚至进展为病死率极高的肝衰竭。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献
[1] Hotchkiss RS, Nicholson DW. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis[J]. Nat Rev Immunol, 2006, 6(11): 813-822. DOI:10.1038/nri1943
[2] Yan J, Li S, Li S. The role of the liver in sepsis[J]. Int Rev Immunol, 2014, 33(6): 498-510. DOI:10.3109/08830185.2014.889129
[3] Kobashi H, Toshimori J, Yamamoto K. Sepsis-associated liver injury: Incidence, classification and the clinical significance[J]. Hepatol Res, 2013, 43(3): 255-266. DOI:10.1111/j.1872-034x.2012.01069.x
[4] Phillipson M, Kubes P. The neutrophil in vascular inflammation[J]. Nat Med, 2011, 17(11): 1381-1390. DOI:10.1038/nm.2514
[5] Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003, 284(1): G15-G26. DOI:10.1152/ajpgi.00342.2002
[6] Omran A, Maaroof A, Saleh MH, et al. Salivary C-reactive protein, mean platelet volume and neutrophil lymphocyte ratio as diagnostic markers for neonatal sepsis[J]. J Pediatr (Rio J), 2018, 94(1): 82-87. DOI:10.1016/j.jped.2017.03.006
[7] Kim WH, Park JY, Ok SH, et al. Association between the neutrophil/lymphocyte ratio and acute kidney injury after cardiovascular surgery: a retrospective observational study[J]. Medicine (Baltimore), 2015, 94(43): e1867. DOI:10.1097/MD.0000000000001867
[8] Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria[J]. Science, 2004, 303(5663): 1532-1535. DOI:10.1126/science.1092385
[9] Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities[J]. Nat Rev Immunol, 2006, 6(3): 173-182. DOI:10.1038/nri1785
[10] Papayannopoulos V, Zychlinsky A. NETs: a new strategy for using old weapons[J]. Trends Immunol, 2009, 30(11): 513-521. DOI:10.1016/j.it.2009.07.011
[11] Camicia G, Pozner R, de Larrañaga G. Neutrophil extracellular traps in sepsis[J]. Shock, 2014, 42(4): 286-294. DOI:10.1097/SHK.0000000000000221
[12] Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3)[J]. JAMA, 2016, 315(8): 801-810. DOI:10.1001/jama.2016.0287
[13] Bakker J, Grover R, McLuckie A, et al. Administration of the nitric oxide synthase inhibitor NG-methyl-L-arginine hydrochloride (546C88) by intravenous infusion for up to 72 hours can promote the resolution of shock in patients with severe sepsis: results of a randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter study (study no. 144-002)[J]. Crit Care Med, 2004, 32(1): 1-12. DOI:10.1097/01.CCM.0000105118.66983.19
[14] 桂逢柳, 程涛, 曹钰, 等. 血氨在急诊科脓毒症患者预后评估中的作用[J]. 中华急诊医学杂志, 2021, 30(3): 307-311. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.03.009
[15] Siore AM, Parker RE, Stecenko AA, et al. Endotoxin-induced acute lung injury requires interaction with the liver[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289(5): L769-L776. DOI:10.1152/ajplung.00137.2005
[16] Yin WP, Li JB, Zheng XF, et al. Effect of neutrophil CD64 for diagnosing sepsis in emergency department[J]. World J Emerg Med, 2020, 11(2): 79-86. DOI:10.5847/wjem.j.1920-8642.2020.02.003