2021, Vol. 30
本研究的研究对象为2020年2月至2021年4月复旦大学附属中山医院急诊科收治的肝脓肿患者。纳入标准：①年龄≥18岁，性别不限；②影像学检查（包括CT和超声）明确肝脓肿诊断；③获得知情同意并签订知情同意书。排除标准：①晚期肿瘤；②不愿签署知情同意书。观察终点为患者出院或临床死亡。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会审核批准（No.B2020-016R）。
1.2 分组根据脓毒症3.0定义，将有持续性低血压，并在充分容量复苏后仍需血管收缩药以维持平均动脉压≥65 mmHg、血清乳酸浓度>2 mmol/L的患者纳入脓毒症休克组，其余为非休克组。
1.3 样本留取① 肝脓肿诊断明确后，符合入组标准的患者，入院时完成APACHEⅡ评分及SOFA评分，完善血常规、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、细胞因子（IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10）、乳酸等实验室检查。同时，留取外周血液样本，分别送常规微生物培养及mNGS检测。根据患者情况，尽早完成脓肿穿刺引流，留取引流液样本分别送常规微生物培养及mNGS检测；②入院后7~10 d，再次送检血液样本和引流液样本复测mNGS。
1.4 常规微生物学培养血液样本及引流液样本均送复旦大学附属中山医院微生物实验室，接种于血琼脂平板进行培养。
1.5 mNGS检测方法 1.5.1 样本采集及运送① 血液样本：抽取3 mL静脉血注入细胞游离核酸保存管中，常温下保存及转运；②引流液样本：3~5 mL引流液放入无菌采样瓶，-20℃保存及转运。
1.5.2 样本处理血液和引流液样本按标准程序提取DNA（广州微远基因科技有限公司），基于Illumina高通量测序平台进行基因测序、生信分析。
1.6 mNGS结果判读根据基因测序及生信分析结果，得到样本中的病原体的检出序列数（Reads）。检出序列数高于其他任何微生物10倍以上并且结合临床特征判断为致病病原体。
1.7 统计学方法采用SPSS 25.0处理数据。计量资料进行正态性检验和方差齐性分析，正态分布资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，非正态资料以中位数(四分位距)表示，计数资料以n(%)表示。统计学方法采用独立样本t检验及χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般资料分析本研究纳入肝脓肿患者共35例，均签订知情同意书。其中男性19例，女性16例，年龄28~86岁；糖尿病患者19例，占54.3%；脓毒性休克组患者14例，占40.0%；死亡患者2例，占5.7%。根据CT影像学表现，将脓肿病灶大小按直径（mm）分为三组（≤50，50~100，≥100）（表 1）。
| 指标 | 数值（n=35） |
| 年龄（岁, Mean±SD） | 65.2±12.8 |
| 性别(男, n) | 19（54.3） |
| 脓毒性休克(n) | 14（40.0） |
| 90 d内死亡(n) | 2（5.7） |
| 基础疾病(n) | |
| 糖尿病 | 19（54.3） |
| 高血压 | 14（40.0） |
| 慢性心功能不全 | 5（14.3） |
| 穿刺引流(n) | 29（82.9） |
| 病灶大小（CT中直径mm）(n) | |
| ≤50 | 10（28.6） |
| 50~100 | 19（54.3） |
| ≥100 | 6（17.1） |
| 实验室检查(Mean±SD) | |
| WBC（×109/L） | 12.2±8.7 |
| CRP[mg/L, M(Qr)] | 197.8（183.6） |
| PCT[ng/mL, M(Qr)] | 21（14.3） |
| 临床评分及预后 | |
| 住院时间[d, M(Qr)] | 21（14.3） |
| APACHEⅡ评分(Mean±SD) | 13.5±5.8 |
| SOFA评分[M(Qr)] | 4（3.5） |
| 注：WBC：血常规白细胞计数，正常范围（4~10）×109/L，CRP：C反应蛋白，正常范围 < 10 mg/L，PCT：降钙素原，正常范围 < 0.5 ng/mL | |
结果显示（表 2）：常规微生物培养法共送检血液样本33例，引流液样本29例。血液样本阳性5例，阳性率15.2%；引流液样本阳性16例，阳性率55.2%。5例血培养阳性患者引流液培养同样为阳性；11例血培养结果为阴性，引流液培养为阳性；其余患者血培养及引流液培养均为阴性。
| 序号 | 血培养 | 引流液培养 | 血mNGS | 引流液mNGS |
| P01 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P02 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P03 | （-） | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P04 | （-） | NA | 变栖克雷伯菌 | NA |
| P05 | （-） | （-） | 普雷沃菌 | 普雷沃菌 |
| P06 | （-） | （-） | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P07 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P08 | （-） | （-） | （-） | 化脓拟杆菌 |
| P09 | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 | NA |
| P10 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P11 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P12 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P13 | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 | NA |
| P14 | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 | NA |
| P15 | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 | NA |
| P16 | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 | NA |
| P17 | NA | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P18 | （-） | （-） | 普雷沃菌 | 普雷沃菌 |
| P19 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P20 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P21 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P22 | （-） | （-） | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P23 | NA | （-） | NA | 肺炎克雷伯菌 |
| P24 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 | 肺炎克雷伯菌 |
| P25 | （-） | （-） | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P26 | （-） | 屎肠球菌 | 屎肠球菌 | 屎肠球菌 |
| P27 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P28 | （-） | （-） | 粪肠球菌 | 粪肠球菌 |
| P29 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P30 | （-） | 肺炎克雷伯菌 | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P31 | （-） | （-） | 粪肠球菌 | 粪肠球菌 |
| P32 | （-） | 屎肠球菌 | 屎肠球菌 | 屎肠球菌 |
| P33 | （-） | 大肠埃希菌 | （-） | 大肠埃希菌 |
| P34 | （-） | （-） | （-） | 肺炎克雷伯菌 |
| P35 | （-） | （-） | （-） | 溶组织阿米巴滋养体 |
| NA：未送检；（-）：未检出致病病原体 | ||||
mNGS检测送检血液样本34例，引流液样本29例。血液样本检出致病病原体23例，检出率67.6%，引流液样本检出致病病原体29例，检出率100%。入院时血培养和血mNGS双阳性5例，双阴性11例；引流液培养和引流液mNGS双阳性16例，无双阴性。血液和引流液mNGS检出致病病原体阳性率显著高于常规微生物培养（血液：67.6% vs. 15.2%，P < 0.05；引流液：100% vs. 55.2%，P < 0.05）。
2.3 两种检测结果与临床诊断符合情况结合血液样本和引流液样本，本研究中35例肝脓肿的致病病原体，肺炎克雷伯菌（25例）占71.4%。入院时血培养和血mNGS检出同一致病病原体5例；血培养阴性病例，血mNGS检出致病病原体18例，均符合临床。引流液培养和引流液mNGS检出同一致病病原体16例；引流液培养阴性病例，引流液mNGS检出致病病原体13例，均符合临床。治疗1周后再次送检样本进行mNGS检测，共送检血液样本20例，引流液样本12例。治疗后血液样本原致病病原体阳性8例，Reads数较入院时显著减少（P < 0.05），12例转为阴性。治疗后引流液样本原致病病原体Reads数较入院时显著减少（P < 0.05）（图 1）。
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| 检测结果为阴性时认定Reads数为0，纵坐标为Log10（Reads）。18例患者完成2次血液样本检测，12例患者完成2次引流液样本检测，配对数据以直线连接。 图 1 治疗前后血液样本（A）和引流液样本（B）mNGS检出致病病原体Reads数变化 Fig 1 Changes of the number of Reads in blood sample (A) and drainage fluid sample (B) before and after treatment |
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按常规微生物培养结果将患者分为阳性、阴性2组，比较这两组患者mNGS检出的致病病原体Reads数之间差异（图 2）。血培养阳性组5例，阴性组18例；引流液培养阳性组16例，阴性组13例。血培养阳性组患者血液样本mNGS检出致病病原体Reads数显著高于血培养阴性组（P < 0.05）。引流液培养阳性组与阴性组之间，引流液样本mNGS检出的致病病原体Reads数差异无统计学意义（P=0.116）。
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| A：血培养阳性组患者血液样本mNGS检出致病病原体Reads显著高于血培养阴性组，P<0.05。B：引流液培养阳性组与阴性组之间，引流液样本mNGS检出致病病原体Reads数差异无统计学意义，P=0.116。 图 2 常规微生物培养结果阳性、阴性两组中mNGS检出致病病原体Reads数的对比 Fig 2 Comparison of the number of pathogenic Reads detected by mNGS in the positive and negative groups of routine microbial culture |
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本研究纳入的肝脓肿患者中，根据脓毒性休克诊断标准，14例患者纳入休克组，21例纳入非休克组。对比分析两组患者基本临床资料，包括：入院时APACHEⅡ评分、SOFA评分、住院时间、病死率以及血常规、CRP、PCT、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、乳酸等实验室检查结果（表 3）。两组患者中，SOFA评分、病死率、血白细胞计数、血小板计数、乳酸、IL-6、IL-8、IL-10差异有统计学意义。
| 指标 | 休克组（14例） | 非休克组（21例） | P值 |
| 年龄（岁） | 65±20 | 67±16.5 | 0.485 |
| APACHE评分 | 19（10） | 8（10） | 0.955 |
| SOFA评分 | 7±4 | 3±2 | < 0.05 |
| 住院时间（d） | 23（14） | 18（14） | 0.611 |
| 死亡人数 | 2（14.3%） | 0（0%） | < 0.05 |
| 入院实验室检查 | |||
| WBC（×109/L） | 15.2±29.7 | 9.3±10.2 | < 0.05 |
| PLT（×1012/L） | 86（61.6） | 13.7（56.2） | < 0.05 |
| CRP（mg/L） | 200（198.6） | 164.4（177.6） | 0.742 |
| PCT（ng/mL） | 86±73.2 | 13.7±39.9 | 0.105 |
| Lac（mmol/L） | 5.4±2.1 | 2.3±1.5 | < 0.05 |
| IL-1β（pg/mL） | 14（28.8） | 6.2（2.9） | 0.063 |
| IL-2R（U/mL） | 4016（2361.5） | 1480（2029.5） | 0.704 |
| IL-6（pg/mL） | 60.1（484.3） | 33.3（69.6） | < 0.05 |
| IL-8（pg/mL） | 84（1937.5） | 52（34.5） | < 0.05 |
| IL-10（pg/mL） | 20.2（533.9） | 8.5（9.2） | < 0.05 |
| 注：WBC：血常规白细胞计数；PLT：血常规血小板计数；CRP：C反应蛋白；PCT：降钙素原；Lac：血乳酸；IL：Interleukin白细胞介素 | |||
本研究比较两组中致病病原体为肺炎克雷伯菌的25例患者mNGS检测出的致病病原体Reads数。结果显示：血液样本中肺炎克雷伯菌的Reads数在两组患者中差异无统计学意义（P=0.321）；引流液样本中肺炎克雷伯菌的Reads数，脓毒性休克组高于非休克组，差异有统计学意义（P < 0.05）（图 3）。
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| A：血液样本中Reads数在两组患者中差异无统计学意义，P=0.321。B：引流液样本中休克组Reads数高于非休克组，P<0.05 图 3 脓毒性休克组和非休克组患者mNGS检查出的肺炎克雷伯菌Reads数对比 Fig 3 Comparison of the Reads of Klebsiella pneumoniae between the shock and non-shock groups |
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传统的病原微生物培养、涂片镜检在感染性疾病的病原学诊断中广泛应用，但这些检测方法存在诸多的局限性，比如敏感性低、周期长、病原谱窄等。有研究表明，细菌性肝脓肿患者的静脉血培养和引流脓液培养阳性率分别为25%、65%~70%[9-12]，因此对临床上抗感染方案的选择造成了困难。本研究中，通过传统微生物检测方法血培养阳性率仅为15.2%，引流液培养阳性率只有55.2%，证实了这一点。mNGS与传统微生物检测方法相比，不依赖于微生物培养，直接提取核酸（DNA或RNA），采用高通量测序技术，然后经过数据库比对与生物信息分析，一次性完成细菌，真菌，病毒[13]和寄生虫等病原体的检测。mNGS在急危重症感染中的应用也有了专门的专家共识[14]。
在将这种技术应用于肝脓肿病例后，笔者发现mNGS的病原体检出率显著高于传统培养（血液：67.6% vs. 15.2%，引流液：100% vs. 55.2%）。纳入本研究的肝脓肿患者34例为细菌性肝脓肿，检出病原体主要为肺炎克雷伯菌（71.4%），与文献报道的亚裔患者细菌性肝脓肿主要为肺炎克雷伯菌导致[15-17]相符合。
本研究中2例患者在血液及脓肿引流液样本中均检出高序列数的普雷沃菌，而培养结果为阴性。普雷沃菌为口腔内常见细菌，常在痰液样本的mNGS检测中检出，通常Reads数较少，多被列为背景菌，而这2例病例样本中Reads数较高（病例1：血8 803、引流液353 321，病例2：血438、引流液16 613），通过针对普雷沃菌抗感染治疗后临床症状明显好转，确诊为普雷沃菌引发的肝脓肿，mNGS检出病原学结果符合临床。这也提示，传统培养方法无法检测的病原体，可以通过mNGS技术进行检测，从而更准确地明确病原学诊断，指导临床用药。
通过样本中病原体Reads数的对比发现，血培养阳性患者血液样本mNGS检出致病病原体Reads数显著高于血培养阴性患者。因为mNGS是直接检测临床样本中的核酸，病原体的Reads数越多表明临床样本中存在的病原体核酸量越大。而临床样本中既有存活的病原体所包含的核酸，也有已经死亡或被破坏的病原体释放出的核酸。笔者认为血液培养阳性表明血液样本中存在更多存活的致病病原体，故mNGS能检出更高的Reads数。而肝脓肿的引流液中多为坏死组织，培养存在假阴性可能，所以引流液样本mNGS检出的致病病原体Reads数与培养结果无显著相关性。
本研究还发现，经过治疗后复查mNGS，致病病原体的Reads数显著减少。脓毒性休克患者脓肿引流液中肺炎克雷伯菌的Reads数高于非休克患者，故认为致病病原体Reads数和感染的严重程度呈正相关。在此基础上，对肝脓肿并发休克和非休克的患者进行对比，发现休克患者的SOFA评分、病死率、血白细胞计数、乳酸、IL-6、IL-8、IL-10均显著高于非休克患者，而休克患者的血小板计数显著低于非休克患者。提示可能可以通过这些实验室数据来预测肝脓肿的严重程度。肝脓肿是引发脓毒症的重要疾病之一，其免疫反应是个非常复杂的过程，入侵微生物或其毒性产物的直接作用，释放大量炎症介质并激活补体。炎症风暴也被认为是脓毒性休克的重要因素之一[18-20]。细胞因子是调节免疫系统，参与介导组织和器官核心功能的基质细胞间沟通的蛋白质。IL-1、IL-2具有促炎作用，IL-8、IL-10可增强B细胞功能，促进机体产生细胞毒性T细胞，具有抑炎作用[21]。抑炎反应可能会减少过量炎症反应的毒性作用，但也可能减弱针对感染宿主的保护效果。发生休克的肝脓肿患者中IL-6、IL-8、IL-10显著增高，提示可能抑炎作用过度增强，导致炎症调节失衡、病情加重。
既往关于脓肿样本和脑脊液样本的mNGS研究认为，体内组织和脑脊液均为无菌（除了感染病原体）组织标本[5, 7]，因此，脓肿样本和脑脊液样本的mNGS数据比痰液、肺泡灌洗液这些来自非无菌场所的样本数据更容易解读。在后一种情况下，这些样本很难区分污染、定植菌或致病病原体。而对明确感染的脓肿组织或引流液样本进行mNGS检测时，致病病原体的序列数会显著高于背景菌，致病菌检出率更高[22]。
所以针对肝脓肿患者，无论是血液样本还是脓肿引流液样本，通过mNGS检测，都可以快速且准确的得到致病病原体结果，优于传统的培养方法。引流液的mNGS检测阳性率比血液样本更高，但在无法取得脓肿引流液样本时，还是推荐尽早进行血液mNGS检测。
本研究有一定的局限性。由于研究样本量较少，并且患者在采样前已接受抗生素治疗，这可能会降低常规微生物培养的阳性率和mNGS检出的病原体Reads数。此外，mNGS检测也有其无法避免的缺点。人类宿主背景及定植微生物Reads数的高表达可能会使mNGS的数据结果复杂化，从而导致mNGS的特异性不足[23]。mNGS理论上可以检测样本中所有的微生物信息，可能检出多种微生物，无法确定致病病原体。所以对mNGS结果的解读，特别是那些来自呼吸道、混合了口腔菌群和定植菌的标本[23-26]，是具有挑战性的。还有宏基因组测序的成本相对较高，这些问题一定程度上限制了mNGS在病原学鉴定领域的临床应用。随着生物科技的进步，现在开发出了宿主背景菌耗减[27]、研究机体菌群组成[28]等新的测序技术，将会不断改善、解决这些问题。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
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