随着社会的进步，急性心肌梗死的发病率却逐年上升，并且有年轻化的趋势^[1]。虽然再灌注治疗已经极大降低了急性心肌梗死的病死率^[2]，但心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）的问题却日趋显现^[3]。炎症反应是MIRI损伤和修复阶段的重要机制^[4]，而调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一类具有负相免疫调节功能的成熟T细胞亚群，可以减轻炎症反应。目前研究较多的与MIRI相关的Treg亚群为CD4⁺FOXP3⁺ Treg^[5]。Treg可改变缺血区巨噬细胞的极性，促进血管再生，减少促炎因子释放，促进抑炎因子分泌，从而改善心室重构，促进缺血区心肌修复^[6]。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell, BM-MSC，以下简称MSC)具有免疫调节功能，在体内体外均能诱导Treg的产生^[7]。因此本研究旨在明确MSC是否可通过上调Treg从而减轻MIRI。

1 材料与方法 1.1 建立小鼠MIRI模型^[8]

24只C57小鼠购于中国江苏昭衍新药研发有限公司，体质量20~25 g。采用冠状动脉结扎法，1%的水合氯醛（上海展云中国）腹腔麻醉小鼠，背位固定。心电图的针型电极插入小鼠四肢，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。于胸骨左侧3、4肋间胸大肌边缘做1 cm切口，钝性分离皮下和肌肉组织，蚊式镊穿过肋间，挤出心脏。在左心耳下缘1~2 mm找到冠状动脉左前降支结扎。放置1.5 mm的乳胶管于结扎线，收紧结扎线，心电图显示Ⅱ导联S-T段的抬高超过0.2 mV时确认造模成功，30 min后拉松结线，心肌再灌注后缝合。

1.2 实验分组与处理

将24只成年雄性C57小鼠按照随机数字表法进行分组。假手术组（SO组，n=3），手术时仅穿手术缝线，不行结扎。经小鼠尾静脉注射和其余组同体积的生理盐水；缺血-再灌注组（RI组，n=7），造模再灌注6 h后尾静脉注射同体积的生理盐水；MIRI模型MSC治疗组（MSC+RI组，n=7），再灌注6 h后经小鼠尾静脉注射10⁶个^[9]RFP-MSC细胞（cyagen美国）；MIRI模型MSC治疗合并Treg清除组（MSC+RI+PC61组，n=7），再灌注6 h后经小鼠尾静脉同时注射10⁶个RFP-MSC细胞和200 μg/只PC61。

1.3 心肌中Treg比例的观察

取小鼠新鲜心脏组织，制成单细胞悬液。将4组的心肌细胞进行流式分析。分别设立空白对照组（不加入任何抗体），和三染组（加入CD4抗体、CD25抗体和FOXP3-PE抗体）（BD美国）孵育。将每组获得的抗体均为阳性的细胞数进行比较。

1.4 血清CK、TNI、BNP、IL-10、TGF-β含量的观察

采用ELISA试剂盒（江莱生物南京建成中国）检测血清CK、TNI、BNP的活性：断头法取血2 mL，在3 000 r/min离心10 min，取血清标本20 μL，按说明书加入要求试剂后水浴、离心定磷再水浴后，酶标仪（MD美国）测定吸光度OD值。ELISA试剂盒（联科生物中国）检测血清转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、白介素10（interleukin-10，IL-10）的表达。步骤为制备标准品，制备多种浓度的检测液，按标准孔、待测样品孔各加样100 μL。每孔先后加入检测溶液A和B各100 μL，覆膜、温育、洗涤。每孔加TMB底物溶液90 μL，覆膜，避光显色终止反应，测各孔吸光度OD值。

1.5 心肌组织病理学观察

取小鼠的心肌组织，进行固定、脱水、包埋、切片等处理后，进行HE染色，使用光学显微镜(×200)观察心肌组织病理学改变。

1.6 凋亡心肌细胞检测

具体操作参考陈俊杰等^[10]研究，对每张切片的凋亡区域进行不重叠拍照，将图片编号，采用随机数字表法选取5个视野(×200)统计凋亡细胞，正常细胞呈紫蓝色，TUNEL阳性为棕褐色。用凋亡指数来反映各组小鼠心肌细胞凋亡。

1.7 心肌梗死面积测定^[11]

纵切小鼠心脏，切成4~5圈组织。放入2%的TTC溶液中37℃避光孵育15~30 min，后放入4%甲醛中固定24 h，心肌梗死组织呈灰白色，正常心肌组织为红色，拍照计算梗死面积（佳能505D），计算心肌梗死面积占心室总面积的百分比。

1.8 心肌纤维化检测

制作各组心肌组织蜡块，制成后按5 µm厚度切片，再进行脱蜡复水入Bouin液，天青石蓝染色液滴染2~3 min后水洗，Mayer苏木精染色液滴染2~3 min后水洗，分化流水冲洗，丽春红品红染色液滴染10 min后冲洗，磷钼酸溶液处理约10 min。滴入苯胺蓝染色液染5 min，最后进行弱酸处理，脱水，透明化，封固后完成。显微镜下观察，蓝染处为纤维结缔组织。

1.9 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示，参数的多组间比较采用单因素的方差分析(One-way ANOVA)，多样本均数间两两比较用LSD-t法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基本生理参数和死亡情况

各组小鼠的体质量、收缩压、舒张压、心率相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

2.2 各组小鼠心肌中Treg比例的比较

MSC+RI组心肌中Treg的比例最高，且差异有统计学意义（P＜0.01）。SO组心肌中Treg的比例最低，与其他三组相比差异也有统计学意义（P＜0.01）。RI和MSC+RI+PC61两组间心肌中Treg比例的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠血清中CK、TNI、BNP、IL-10、TGF-β含量的比较

MSC+RI组小鼠血清中IL-10、TGF-β含量最高，与其他三组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。MSC+RI组小鼠CK、TNI和BNP的含量较SO组高，较RI组和MSC+RI+PC61组低，差异有统计学意义（P＜0.01）。RI组和MSC+RI+PC61组的CK、TNI、BNP、IL-10、和TGF-β的含量相比较均差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组小鼠心肌组织病理学比较

HE染色显示SO组心肌纤维排列整齐，细胞核清晰，细胞质呈伊红色，间质未见水肿和炎性细胞。RI组和MSC+RI+PC61组梗死区较多成纤维细胞增生，心肌纤维水肿，部分被疏松结缔组织替代，炎症细胞浸润。MSC+RI组梗死区心肌细胞排列较为整齐，局部少许组织水肿和炎症。

2.5 各组小鼠心肌细胞凋亡指数比较

除SO组外，MSC+RI组的心肌凋亡指数最低，和其余两实验组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），RI组和MSC+RI+PC61组心肌凋亡细胞指数均较高，和SO组、MSC+RI组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），但此两组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 各组小鼠心肌梗死面积比比较

除SO组外，MSC+RI组的心肌梗死面积比最小，与其余两实验组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。RI组和MSC+RI+PC61组心肌梗死面积比均较大，与SO组和MSC+RI组相比差异有统计学意义（P＜0.01），但此两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 Masson染色检测心肌纤维化情况

SO组为正常心肌细胞，Masson染色见正常红染肌纤维组织，未见蓝染区域。RI组可见满屏蓝染区域，为损伤的心肌细胞被纤维结缔组织所取代，中间夹杂少量红染的心肌细胞。MSC+RI组大部分为红染的心肌细胞，中间夹杂及少许蓝染的胶原纤维。MSC+RI+PC61组图片表现与RI组类似。

3 讨论

MSC对MIRI有治疗作用，能够提高左室射血分数，改善心肌灌注和心室重构^[7]，但其治疗的机制仍在不断探索当中。MIRI的机制和Ca²⁺超载与氧化应激、细胞凋亡与自噬、以及某些小分子物质如线粒体通透性转换孔和MicroRNA有关^[12-13]。其中炎症反应也是MIRI损伤和修复阶段的重要机制^[14]。MIRI早期主要为促炎反应阶段，表现为损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPS）, 活性氧（reactive oxygen species，ROS）和补体的产生，释放白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）, 白细胞介素18（interleukin-8，IL-18）, 趋化因子配体2（chemokine ligand 2，CCL2）等细胞因子, 介导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和CD8⁺T细胞等进入梗死区。72 h后梗死区逐渐开始产生抑炎反应，表现为IL-10、TGF-β等抑炎因子的产生、单核细胞和巨噬细胞极性的变化以及Treg、CD4⁺T细胞和树突状细胞的募集，缓解炎症损伤^[15]。Treg的负性免疫调节作用可减少促炎因子γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等释放，促进抑炎因子IL-10、TGF-β等分泌；Tregs也可减少基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2 MMP-2）的激活，减少白细胞趋化，减少炎症因子释放^[5]；Tregs有直接保护细胞基质作用，减少细胞凋亡，从而改善心室重构，促进缺血区心肌修复，改善心功能^[6]。而MSC具有免疫调节功能，在体内体外均能诱导Treg的产生，通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子增加Treg的数量，从而降低炎症反应，减轻组织损伤^[16-17]。

因此，本实验通过建立小鼠MIRI模型，探讨MSC对MIRI的治疗作用的机制是通过诱导Treg来实现。文献[11]以及前期预实验表明，MIRI小鼠注射10⁶个MSC可以达到理想的实验效果，若MSC浓度过高会引起实验动物栓塞死亡。MIRI最早发生于再灌注后6 h^[18], 因此本研究选择了在缺血-再灌注后6 h时注射实验试剂。Chen等^[19]发现MSC移植24 h后，50%以上的移植细胞凋亡，7 d后超过90%的移植细胞凋亡，考虑到监测指标的时效性及小鼠的生存率，因此本研究的实验取材均在缺血-再灌注后72 h进行^[20]。首先明确了MSC的确会使MIRI小鼠心肌中Treg产生增多。MSC+RI组给予MIRI小鼠MSC治疗后，与其他三组相比，在心肌中诱导出最多数量的Treg，使得MIRI小鼠血清中的抑制型的细胞因子IL-10、TGF-β增高，减轻MIRI后的炎症反应，减轻心肌损伤。故除对照组外，该组的CK、TNI、BNP最低，心肌组织病理学仅表现为少数部位有组织水肿和少量炎症，心肌凋亡细胞，心肌梗死面积，心肌纤维化和其余实验组相比最少。以上实验结果证实了MSC通过诱导Treg产生，使抑炎因子IL-10、TGF-β增多，从而减轻心肌的炎症损伤，改善心脏重构和功能。RI组和MSC+RI+PC61两组的实验数据相近，相比差异无统计学意义，说明给予Treg清除剂PC61后，由MSC诱导的Treg会下降至无MSC治疗的水平，MSC对MIRI的治疗效果消失，这从侧面证明了MSC对MIRI的治疗作用是通过诱导Treg产生的。Casiraghi等^[21]研究表明小鼠心脏移植前注射MSC可以使Treg扩增，延长移植心脏的存活时间。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突