2021, Vol. 30
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一种常见的急腹症，大多数患者表现为轻型急性胰腺炎，具有一定的限性，约有20%可进展为重症急性胰腺炎，病死率可高达20%~40%[1]。目前随着时代发展，急性胰腺炎发病呈现升高趋势[2]，但尚无有效的办法控制急性胰腺炎的进展。ISO-1是一种巨噬细胞移动抑制因子(macrophags migration inhibitory factor, MIF)的抑制剂，具有有效的抗炎、抗肿瘤活性[3]，对脓毒症[4]、结肠炎[5]、胰腺癌[6]等多种疾病模型均具有保护作用。之前的研究也证明了使用MIF抑制剂或敲除MIF基因对于急性胰腺炎及其相关肺损伤有保护作用[7-8]，但具体机制尚不清楚。本研究旨在探索ISO-1在急性胰腺炎中发挥保护作用的机制。
1 材料与方法 1.1 实验试剂L-精氨酸和BCA蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。ISO-1购自美国MCE公司。RIPA裂解缓冲液、磷酸酶抑制剂和辣根过氧化物酶(HRP)结合的次级抗体购自上海碧云天生物技术公司，血清淀粉酶和脂肪酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物技术科技有限公司。丙二醛(MDA)和超歧物过氧化物酶(SOD)测定试剂盒购自南京建城生物工程研究所。NLRP3抗体购自美国博士德生物工程有限公司，IL-1β抗体购自美国CST公司，MIF和β-actin抗体购自中国Abways技术公司。
1.2 动物模型本实验所需C57BL/6小鼠从华兴动物实验中心购买，年龄6~8周，体质量18~20 g。将其随机(随机数字法)分为3组，每组6只，分别为对照(CON)组、模型(AP)组和治疗(ISO-1)组。对照组接受腹腔注射两次等剂量生理盐水，AP模型组接受腹腔注射两次L-精氨酸(4 g/kg, pH=7，最终浓度8%)，间隔1 h; ISO-1治疗组在AP造模前30 min，给予一次腹腔注射ISO-1(3.5 mg/kg)。所有小鼠均在最后一次注射72 h后处死，取胰腺组织标本和血标本待用，所有动物和实验程序均符合郑州大学第一附属医院伦理研究委员会(伦理审查编号2019-KY-140)。
1.3 胰腺组织组织学评分胰腺组织标本用4%多聚甲醛固定，制备成HE切片。每张切片随机选择10个高倍镜视野，根据现有的组织学评估方法[7]进行评分。
1.4 血清淀粉酶脂肪酶测定用ELISA试剂盒测定小鼠血清中淀粉酶脂肪酶水平。
1.5 胰腺组织MDA和SOD测定用生化试剂盒检测胰腺组织匀浆中MDA和SOD，检测步骤及计算方法均按照说明书进行。
1.6 蛋白免疫印迹根据BCA试剂盒测定的各蛋白样品浓度，取等质量蛋白上样，经过聚丙烯凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤，使用双色红外激光成像系统进行图像采集，并使用Image-J软件测定蛋白条带灰度值。
1.7 统计学方法所有统计数据均采用SPSS 21.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，多组间均数比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组间大体标本病理变化相对于对照组，AP组小鼠出现明显腹水，肝脏、肺组织及肾组织出现明显出血点，胰腺组织出现明显肿大和坏死。ISO-1治疗组小鼠未出现腹水，肝脏、肺组织及肾组织未出现明显出血点，且胰腺相比对照组出现水肿或轻微水肿，但未见明显坏死。
2.2 各组淀粉酶脂肪酶变化AP组血淀粉酶、脂肪酶水平显著高于对照组，ISO-1组显著低于AP组，差异均有统计学意义(P＜0. 05)。见表 1。
| 组别 | 淀粉酶(IU/L) | 脂肪酶(ng/mL) |
| CON组 | 90.9±25.42 | 24.88±3.865 |
| AP组 | 255.8±24.42a | 117.3±27.67a |
| ISO-1组 | 143.8±16.23b | 64.68±5.258b |
| 注: 与CON组相比, aP < 0.05; 与AP组相比, bP < 0.05 | ||
如图 1所示，相比对照组，模型组胰腺组织有明显的小叶间隔和细胞间隙增宽、细胞呈现片状坏死和炎症细胞浸润。ISO-1治疗组胰腺组织水肿坏死和炎症细胞浸润明显减轻。根据组织学评分分析发现，AP模型组组织学评分明显高于CON组，而ISO-1治疗组较AP模型组降低，且差异均有统计学意义(P＜0. 05)。
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| 注: 与CON组相比, aP < 0.05;与AP组相比, bP < 0.05 图 1 胰腺组织病理学改变和病理评分 |
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如表 2所示，AP组胰腺组织MDA水平高于对照组，SOD水平显著低于对照组; 而ISO-1处理则降低了MDA水平和升高了SOD水平，差异均有统计学意义(P＜0. 05)。
| 组别 | SOD (U/mg prot) | MDA(nmol/mg prot) |
| CON | 44.14±7.465 | 37.02±4.013 |
| AP | 32.70±4.352 a | 104.3±12.84 a |
| ISO-1 | 40.50±5.915 b | 64.55±6.205 b |
| 注: 与CON组相比, aP < 0.05;与AP组相比, bP < 0.05 | ||
AP模型组MIF蛋白表达显著高于对照组，ISO-1组显著低于AP组，差异有统计学意义(P＜0. 05)。见图 2。
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| 与CON组相比, aP < 0.05;与AP组相比, bP < 0.05 (n=6) 图 2 胰腺组织中MIF蛋白表达 |
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AP模型组NLRP3、IL-1β蛋白表达显著高于对照组，ISO-1组显著低于AP组，差异有统计学意义(P＜0. 05)。见图 3。
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| 与CON组相比, aP < 0.05;与AP组相比, bP < 0.05 (n=6) 图 3 胰腺组织中NLRP3和IL-1β蛋白表达 |
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急性胰腺炎是一种急性无菌性炎症，早期仅表现为胰腺局部损伤，随着疾病进程可发展为全身炎症反应综合征，并发胰腺外脏器损伤，进展为MODS。氧化应激反应在AP早期阶段胰腺组织局部损伤中发挥着重要作用[9]。在本研究中发现，AP模型组中，胰腺组织中MDA水平上升和SOD水平下降; 同样的有临床研究表明急性胰腺炎患者的血清MDA水平上升和SOD水平下降[9]，而这与本实验结果一致。MIF抑制剂ISO-1，作为一种小分子抑制剂被广泛应用于炎症性疾病研究; 在本研究中发现，ISO-1除了对AP模型中的胰腺组织损伤具有保护作用，而且具有抗氧化作用，降低了急性胰腺炎胰腺组织中MDA水平并升高了SOD水平。多项研究证明，抗氧化可以明显缓解急性胰腺炎动物模型的严重程度[11-14]，因此笔者推测，ISO-1可以通过抑制氧化应激反应对AP模型中胰腺组织损伤发挥保护作用。
ISO-1除了能够抑制胰腺组织氧化应激外，还可以抑制NLRP3炎症小体的激活。ISO-1作为MIF的小分子抑制剂，早在2018年被发现可以抑制NLRP3炎症小体的激活; 除此之外在该项研究中还发现MIF可能是作为NLRP3的分子伴侣，而被NLRP3炎症小体激活所必需[15]。2020年有研究发现在AP模型中，NLRP3炎症小体可以调控全身炎症反应和代偿性抗炎反应综合征; 当使用NLRP3抑制剂和敲除NLRP3基因后减轻了AP模型中胰腺组织损伤[16]。因此推测ISO-1对胰腺组织发挥保护作用可能与ISO-1抑制NLRP3炎症小体激活有关。
在本研究中仅观察到ISO-1抑制胰腺组织氧化应激反应和NLRP3炎症小体激活，未来需要进一步研究明确ISO-1是通过直接作用抑制NLRP3炎症小体的激活，还是通过抑制氧化应激间接作用于NLRP3炎症小体的激活。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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