脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）是指大脑在无直接感染的临床或实验室证据前提下，因全身感染反应引起的多灶性或弥漫性脑功能障碍，临床表现为认知、行为、觉醒和意识状态的改变^[1-4]。研究表明，合并SAE时脓毒症患者病死率高达49%，更为重要的是，脓毒症幸存者往往出现长期的学习、记忆、注意力的减退、焦虑抑郁等认知功能障碍，严重影响其生活自理能力和生活质量，显著增加家庭与社会经济负担^{[2, 4]}。然而，SAE目前的发病机制仍不清楚。越来越多的研究证实, 抑制性微清蛋白（parvalbumin interneuron, PV）中间神经及其神经环路在神经认知活动中发挥重要的作用^[5-9]，推测其在SAE中也起关键作用。本研究旨在探讨海马γ振荡异常在SAE中的作用及机制，为SAE有效防治提供理论依据。

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（2~3个月龄）70只，由南京中医药大学动物中心提供（动物合格证号：NO. 201909968），饲养于湿度45%、温度（24±1）℃，12 h灯照（07:00~19:00）的动物房中，实验过程中保证动物能够自由摄取食物和水。本研究中的所有动物实验均符合动物实验伦理和福利要求。

2%戊巴比妥钠（Sigma公司，美国)、多巴胺4（D4）受体激动剂RO-10-5824（MedChemExpress公司，美国）、兔抗PV多克隆抗体(Abcam公司，英国)、鼠抗D4单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美国）和兔抗GADPH抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）、IgG-FITC或IgG-Cy3（Life Science Technology公司，美国）、辣根过氧化物酶偶联兔或羊抗鼠二抗、ECL显影液、BCA蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，在无菌手术环境下切开腹正中切口暴露盲肠，在距盲肠远端约1 cm处用4-0号缝线结扎盲肠。然后用无菌的22号针将盲肠穿孔两次后轻轻挤压，通过穿刺点使少量粪便内容物进入腹腔。挤压完毕将肠子放回腹部，用3-0号无菌缝线缝合切口，采用本动物模型，大鼠生存率约为70%。根据随机数字表法随机分为以下3组：假手术组（sham组，n=18），盲肠结扎穿孔组（CLP，n =26），CLP+ RO-10-5824组（n =26）。其中，假手术组仅开放腹腔，未进行结扎和穿孔处理；CLP组建模之后立即用预热（37 ℃）生理盐水溶液（皮下注射，20 mL/kg）进行液体复苏治疗；CLP+ RO-10-5824组手术操作同CLP组，行为学测试前30 min给予腹腔注射RO-10-5824（3 mg/kg）。

术后第10天行旷场实验测试，用于评估动物的探索行为和焦虑行为。将大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm的敞箱中心，自由探索5 min。记录并分析中央格停留时间和活动总距离（XRXC404；上海欣软信息技术有限公司）。在每次测试结束时，用75%的酒精进行旷场清洁，以消除气味干扰。

术后第10~11天行新物体识别测试，本实验采用塑料敞箱（100 cm×100 cm×40 cm）检测新物体的记忆和识别，共分两个实验。在第1天（训练试验），将大鼠放在敞箱中，对两个熟悉的物体进行5 min自由探索。在训练24 h后的探究实验中，将大鼠放在敞箱中，但将熟悉的两个物体（5 cm×5 cm×5 cm）中的一个换成颜色、形状和质地明显不同的新物体，继续让大鼠自由探索5 min。用视频跟踪系统记录探索时间，并计算新物体识别率如下：新物体识别率=在新物体区域花费的时间/(在新物体区域花费的时间+在熟悉物体区域花费的时间)。对物体的探索定义为动物的鼻子位于距离不超过2 cm的区域内，并积极地探索物体。

术后第13~14天行条件恐惧实验，将大鼠置于实验箱（32 cm×25 cm×25 cm）内进行条件恐惧实验。适应3 min后，给予30 s单频声音刺激（1 kHz，80 dB, CS），然后给予2 s足底电击（1 mA，US）。24 h后将大鼠再次放入同一实验箱中，在不给予任何刺激情况下进行场景测试以评估僵直行为。2 h后，在新场景中测试线索恐惧记忆，给予大鼠连续3 min和训练时相同的声音刺激并监测僵直行为。通过监测大鼠僵直行为时间来评估认知功能障碍。僵直行为定义为指除了呼吸之外，动物未见任何运动。

大鼠海马标本在添加蛋白酶抑制剂的低温裂解缓冲液中进行裂解。离心取上清液，加热5 min使蛋白变性，凝胶电泳分离。转膜，5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。加入封闭液和一抗抗体PV（1∶1 000）与D4（1∶1 000）室温孵育2 h，洗涤后加入二抗室温孵育1 h，脱色、底物显色反应、显影。采用Image J软件检测海马PV与D4含量。

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉，经心灌注生理盐水，然后用4%多聚甲醛溶液灌注。取脑后固定于4%多聚甲醛溶液中，然后在4 ℃下30%蔗糖溶液中脱水过夜。将样品包埋在最佳切割温度化合物中，使用低温保持器将其切割成30 μm厚的切片，并安装在载玻片上。切片在室温下用3%牛血清白蛋白封闭1 h，使用一抗：PV（1∶500）与D4（1∶500）。切片用PBS洗涤3次后，分别与相对应的二抗：山羊抗兔抗体和大鼠IgG-FITC或IgG-Cy3（1∶500）在室温下孵育1 h。二抗洗净后，用DAPI孵育切片进行核染色。用Image J测量各切片的免疫荧光均值。

2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，后将动物固定于带精密显微操作器的脑立体定向仪上。开颅剥离硬脑膜后，用四通道微丝阵列电极记录单侧海马CA1区局部场电位（local field potential，LFP）。根据大鼠脑图谱在立体定位仪（前部3.8 mm，侧方1.8~2.2 mm，水平距前部3.0 mm）中确定坐标。记录大鼠在新物体识别实验中探索时的局部场电位。经过0.3~300 Hz的通带滤波，然后以2 kHz的频率进一步放大。记录的LFP用50 Hz缺口过滤以去除干扰。对于LFP分析，宽带记录在1250 Hz下采样。所有数据分析应用Neuroexplorer（Plexon Inc, Dallas, TX）软件。

使用Graphpad Prism 7.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准误（Mean±SEM）表示。组间两两比较采用独立t检验，多组间的差异采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey法。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

旷场实验中，各组大鼠在总探索路程、中央格停留时间差异无统计学意义（P > 0.05）。与sham组比较，CLP组动物新事物接触时间、新事物识别率与场景僵直时间均显著降低（P < 0.05），而CLP + RO-10-5824组新事物接触时间与新事物识别率均显著增加（P < 0.05），见表 1。

因D4受体激动剂RO-10-5824可以激活PV功能，不改变D4的含量，本研究仅检测sham组与CLP组海马D4表达量。免疫印迹结果显示，与sham组比较，CLP组动物海马PV与D4水平显著降低（P < 0.05），见图 1。

与sham组比较，aP < 0.05 图 1 各组动物海马PV与D4蛋白表达水平 Fig 1 Hippocampal PV and D4 expressions of each group

图选项

免疫荧光结果显示，与sham组比较，CLP组动物海马PV与D4水平显著降低（P < 0.05），见图 2。

与sham组比较，aP < 0.05 图 2 各组动物海马PV与D4水平变化（免疫荧光，比例尺=100 μm） Fig 2 Immunohistochemistry results of hippocampal PV and D4 expressions of each group (bar=100 μm)

图选项

与sham组比较，CLP组动物海马CA1区γ振荡显著降低（P < 0.05），而CLP+ RO-10-5824组γ振荡显著增加。相关分析显示海马CA1区γ振荡能量与新事物识别时间成正相关（r=0.609 2，P=0.015 9）。各组动物海马CA1区θ、α与β振荡差异无统计学意义（P > 0.05），见图 3。

与sham组比较，aP < 0.05;与CLP组比较，bP < 0.05 图 3 各组动物海马场电位水平变化 Fig 3 Hippocampal local field potential changes of each group

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SAE是脓毒症患者中最常见的脑病形式，其发生率高达70%，临床表现为认知、行为、觉醒和意识状态的改变^[1]。本研究结果显示，SAE动物表现为社交行为异常与记忆受损，这些行为学异常伴随海马PV中间神经元PV表达与D4受体下调以及γ振荡缺失，而特异性D4受体激动剂RO-10-5824可上调γ振荡，逆转SAE动物社交行为异常，提示γ振荡在SAE中发挥关键作用。

目前SAE的发病机制已取得较大进展，如中枢系统炎性反应、氧化应激反应、线粒体功能障碍、神经元损伤与表观遗传学调控等有关^[3-4]，然而其确切的发病机制仍有待进一步阐明。神经元兴奋和抑制平衡是维持正常学习记忆功能的基础，而这种平衡被打破则可能引起中枢系统疾病^[5-8]。PV中间神经元是γ-氨基丁酸（GABA）能神经元的主要细胞类型，约占40%~50%。越来越多的证据表明，PV中间神经元在维持神经网络兴奋和抑制平衡中发挥重要作用。尤为重要的是，PV中间神经元是产生γ振荡的主要细胞类型，后者是神经微环路的一种基本形态且普遍存在于动物和人类皮层、海马以及丘脑等多个大脑区域^[10-11]。研究表明，γ振荡可为神经元的同步化放电提供精确的时间模板，可增强突触前和突触后神经元活动同步性，在“信息整合”功能中扮演重要角色，从而在学习、记忆、注意力、执行力等高级神经活动中发挥重要作用^[12]。在有记忆损害的阿尔兹海默病患者的脑电图中，其自发的或在图片刺激条件下引发的γ振荡均显著降低^[13]。在双向抑郁障碍中，γ振荡亦出现显著异常^[14]。已有研究指出，通过兴奋PV中间神经元诱发的γ振荡能减少阿尔兹海默病动物模型脑内Aβ的产生，从而改善认知功能^[15]。本研究发现CLP后海马PV及D4受体显著降低，γ振荡下降，伴随学习记忆功能受损，而应用D4特异性受体激动剂RO-10-5824激活PV可上调γ振荡，提示PV中间神经元是产生γ振荡的重要细胞类型，这与近期研究结果一致^[6]。进一步分析显示，海马γ振荡能量与新事物识别时间呈正相关，且上调γ振荡可改善部分认知行为学异常，这进一步印证了PV中间神经元及其γ振荡在认知功能中的重要作用。需要指出的是，本研究表明D4特异性受体激动剂RO-10-5824只改善部分认知行为学异常，提示D4特异性受体激动剂可能存在非特异性效应。

综上所述，本研究结果显示海马γ振荡异常在SAE中发挥关键作用，鉴于PV中间神经元及γ振荡在认知功能执行中的重要作用，对其进行有效干预有望成为SAE等相关疾病防治的新方法。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突