2021, Vol. 30
2. 陆军军医大学第一附属医院急救创伤中心，重庆 400038
2. Center of Emergency and Trauma, First Affiliated Hospital of Army Medical University, Chongqing 400038, China
急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是一种严重威胁生命的临床综合征，短时间内大量肝细胞变性坏死等一系列急性病理学与生理学改变，导致肝细胞功能急剧下降，其临床特征为凝血功能障碍、肝性脑病和多器官功能衰竭等，不仅临床发病率高，同时伴有极高的病死率[1-2]。目前导致ALF的病因很多，例如病毒、药物、毒素、酒精、代谢性疾病或自身免疫等[3-5]，然而预防或治疗ALF的措施仍然非常有限。由药物D-氨基半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）/脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱发的急性肝损伤动物实验模型，被广泛用于研究临床肝炎的病理发生机制和新型肝保护剂的开发[6-8]。
大黄素（emodin）是一种从传统中草药大黄根茎中分离提取的蒽醌类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗纤维化和抗癌等药理作用[9-11]。研究表明大黄素对肝脂肪变性和四氯化碳诱导的肝损伤具有保护作用[12-13]。此外，研究表明大黄素可以抑制各种炎症模型中促炎细胞因子如TNF-α、IL-6的产生[14-16]。以上研究提示大黄素具有对炎症反应负性调节作用。有研究表明自噬与炎症有着紧密的联系，其中由内毒素诱导的急性肺损伤中，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达显著降低[17]，而激活自噬将减轻炎症反应[18-20]。然而，大黄素在D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤中的作用与自噬蛋白LC3-Ⅱ等表达的关系尚不清楚。因此，本研究旨在观察大黄素对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤的药理作用机制及其与自噬的关系。
1 材料与方法 1.1 动物与试剂所有BALB/c雄性小鼠，6~8周龄（体质量18~22 g），购于陆军军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证[SCXK（渝）2017-0002]。所有涉及动物实验操作均严格按照陆军军医大学动物实验中心动物伦理规范进行。实验用药物LPS（L2880，大肠杆菌055:B5）、D-GalN（A2795）、emodin（E7881）购于美国sigma公司，自噬抑制剂3-MA（3-methyl-3H-purin-6-amine）购于美国Cayman公司（13242）；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）（C009-1-1）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）（C010-1-1）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）（A044-1-1）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α（TNF-α）（EMC102a）、白细胞介素-6（IL-6）（EMC004）检测试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司；内参GAPDH（5174S）、LC3-Ⅱ（3868S）、Beclin1（4395S）一抗及二抗均购自Cell Signaling Technology公司；化学发光ECL（K-1243-D10）试剂盒购于美国Advantsta公司；BCA蛋白定量分析试剂盒（23225）购于美国Thermo公司。
1.2 动物模型建立与分组第一部分动物实验分组。将40只小鼠采用随机数字表法分为5组（n=8）：对照组、大黄素组、D-GalN/LPS组、大黄素+ D-GalN/LPS组、3-MA+大黄素+D-GalN/LPS组。第二部分生存率实验分组见下文1.8部分。急性肝损伤模型建立经小鼠腹腔注射D-GalN（700 mg/kg）/LPS（10 μg/kg）诱导。各组动物腹腔药物注射情况说明：对照组注射等量药物溶剂，NS+DMSO: 食用玉米油；大黄素组注射大黄素（20 mg/kg）+ DMSO: 食用玉米油；D-GalN/LPS组腹腔内注射LPS（10 μg/kg）+ D-GalN（700 mg/kg）；大黄素+ D-GalN/LPS组模型建立前30 min注射大黄素20 mg/kg；3-MA+大黄素+D-GalN/LPS组模型建立前，按间隔30 min依次注射3-MA 15 mg/kg、大黄素20 mg/kg。各组模型药物注射6 h后麻醉处死，采集血浆、肝组织标本，部分肝组织用于病理组织切片，其余组织-80 ℃低温冰箱保存用于后期相关实验检测。
1.3 转氨酶ALT、AST的检测根据检测试剂盒说明书相关操作步骤，预先制作待测小鼠血浆标本，依步骤加样及相关试剂，直至最后一步显色，酶标仪505 nm波长下，检测各样本吸光度值，根据标准曲线公式求得各样本中ALT、AST实际含量。
1.4 ELISA法检测TNF-α、IL- 6根据TNF-α、IL-6检测试剂盒操作说明书，预制待测样本，并依次完成操作步骤，加样及各种试剂，直至最后一步显色。酶标仪450 nm下，测定各样本吸光度值，根据标准品曲线公式计算实际样本的TNF-α、IL-6浓度。
1.5 肝组织MPO活性检测依据检测试剂盒操作说明书，准备实验器材、仪器设备，并将采集的肝组织匀浆制备待测样本，按步骤完成操作直至最后一步。酶标仪450 nm下测得各样本吸光度值，同时检测制备的各样本蛋白浓度，根据说明书内容将各样本总蛋白进行标准化对比得出结果。
1.6 肝组织HE染色将4%多聚甲醛固定后的部分肝组织，依次脱水、包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色、烘干、脱水、固定、封片，光学显微镜下观察并拍摄记录各组肝组织病理切片变化。
1.7 Western blot检测LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量制备肝组织蛋白上样样本，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各样本蛋白，然后电转至NC膜上，牛奶封闭2 h，一抗LC3-Ⅱ（1∶1 500稀释）、Beclin1抗体（1∶2 000稀释）, 内参GAPDH抗体（1∶3 000稀释），冰箱4℃孵育过夜，TBST洗涤（3次，20 min/次），二抗（1∶2 000稀释）室温孵育2 h，再次洗涤，条带上滴ECL荧光液，充分结合（5 min），在发光仪上显影并记录蛋白表达图片，保存后使用专业软件后期分析条带灰度值。
1.8 生存率分析100只小鼠随机（随机数字法）分5组（n=20）：对照组、大黄素组、D-GalN /LPS组、大黄素+D-GalN/LPS组、3-MA+大黄素+D-GalN/LPS组，观察并记录各组小鼠72 h生存情况，采用Kaplan-Meier法绘制及描述小鼠生存率曲线图。
1.9 统计学方法GraphPad Prism 5软件制图及处理数据，使用SPSS 22.0软件分析数据，正态分布计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用SNK-q检验，方差不齐时采用Games-Howell检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠肝转氨酶、存活率和肝组织病理改变本研究首先确定了大黄素对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中肝转氨酶水平的作用。与对照组比较，D-GalN/LPS组6 h时ALT和AST水平明显升高（P < 0.05），而大黄素+D-GalN/LPS组肝脏转氨酶水平显著降低（P < 0.05），见表 1。同时，与D-GalN/LPS组比较，大黄素+D-GalN/LPS组显著提高了小鼠的存活率，见图 1。组织病理学检查显示，由D-GalN/LPS诱导的肝脏组织显著异常，肝小叶间结构不清，肝索结构破坏，大量肝细胞死亡同时并存有大量红细胞淤积；而大黄素+D-GalN/LPS组可明显减轻这些组织病理学改变，见图 2。以上结果提示，大黄素可改善D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤。自噬抑制剂3-MA在本研究中主要用作干预自噬发生，结果显示3-MA逆转了大黄素对小鼠急性肝损伤保护作用，转氨酶、生存率、组织病理学变化见表 1、图 1~2。提示自噬可能参与大黄素对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤的保护作用。
| 组别 | ALT（U/L） | AST（U/L） |
| 对照组 | 192.97±68.58 | 34.52±14.47 |
| 大黄素组 | 200.37±60.59 | 33.37±17.82 |
| D-GalN/LPS组 | 2 476.80±263.14a | 271.71±47.15a |
| 大黄素+ D-GalN/LPS组 | 1 248.01±380.70b | 142.59±34.63b |
| 3-MA+大黄素+D-GalN/LPS组 | 2 398.78±233.57c | 242.79±43.46c |
| F值 | 181.50 | 86.15 |
| P值 | < 0.01 | < 0.01 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与D-GalN/LPS组比较，bP < 0.05；与大黄素+D-GalN/LPS组比较，cP < 0.05 | ||
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| 与D-GalN/LPS组比较，aP < 0.05；与大黄素+D-GalN/LPS组比较，bP < 0.05 图 1 各组小鼠生存情况（n=20） Fig 1 The survival rate of each group (n=20) |
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| 图 2 各组小鼠肝组织病理学改变（HE染色） Fig 2 The liver histological abnormalities of each group (HE staining) |
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本研究结果显示，炎症细胞因子TNF-α、IL-6在D-GalN/LPS组中显著升高（P < 0.05），与对照组比较，大黄素+D-GalN/LPS组炎症因子产生抑制（P < 0.05），见表 2。为进一步评估嗜中性粒细胞的浸润程度，本研究检测肝脏组织中MPO活性，与对照组比较，D-GalN/LPS组MPO活性明显上调（P < 0.05），而大黄素+D-GalN/LPS组可显著抑制其上调，这与组织病理学检查中所观察到的白细胞浸润减少一致。3-MA对自噬的抑制阻断了大黄素对D-GalN/LPS暴露小鼠TNF-α、IL-6和MPO活性的抑制作用。提示自噬可能有助于大黄素对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤的保护作用。
| 组别 | TNF-α（pg/mL） | IL-6（pg/mL） | MPO（U/mg） |
| 对照组 | 183.93±16.88 | 19.75±5.00 | 0.19±0.07 |
| 大黄素组 | 193.00±34.35 | 19.52±6.20 | 0.18±0.04 |
| D-GalN/LPS组 | 537.92±89.35a | 169.74±25.52a | 1.37±0.22a |
| 大黄素+ D-GalN/LPS组 | 288.91±67.21b | 61.83±13.64b | 0.80±0.21b |
| 3-MA+大黄素+D-GalN/LPS组 | 505.07±67.89c | 151.46±14.11c | 1.27±0.15c |
| F值 | 61.91 | 187.98 | 104.40 |
| P值 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与D-GalN/LPS组比较，bP < 0.05；与大黄素+D-GalN/LPS组比较，cP < 0.05 | |||
为探讨大黄素对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤保护作用机制，检测了肝脏组织自噬相关蛋白表达水平。蛋白免疫印迹分析结果显示小鼠D-GalN/LPS暴露后，与对照组（1.01±0.17；1.01±0.16）比较，D-GalN/LPS组Beclin1和LC3-Ⅱ水平表达显著降低（0.77±0.16；0.75±0.20）（P < 0.05）。而大黄素干预后，与D-GalN/LPS组对比Beclin1和LC3-Ⅱ表达水平显著上调（1.05±0.17；1.04±0.13）（P < 0.05），见图 3。以上结果表明大黄素对急性肝损伤的保护机制可能与自噬激活有关。
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| A: 自噬Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平；B: LC3-Ⅱ/GAPDH灰度比值；C: Beclin1/GAPDH灰度比值；1: 对照组；2: 大黄素组；3: D-GalN/LPS组；4: 大黄素+ D-GalN/LPS组；与对照组比较，aP < 0.05；与D-GalN/LPS组比较，bP < 0.05 图 3 各组小鼠肝组织LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达水平（n=8） Fig 3 Expression of LC3-II and Beclin1 protein in liver tissue of mice in each group (n=8) |
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我国传统中药大黄具有清热解毒、利湿退黄、舒经通络、保肝利胆等功效[21]。而大黄素作为其有效成分之一，不仅具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用，越来越多的证据表明大黄素在炎症反应中也起着重要的调节作用[22-24]。本研究结果显示，大黄素对于急性肝损伤模型小鼠可通过抑制肝转氨酶升高来改善肝脏组织病理学异常、提高动物生存率。说明大黄素对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤有一定的预防作用。
由D-GalN致敏的小鼠肝脏，易被LPS刺激并释放大量的炎症因子，是D-GalN/LPS诱导急性肝损伤模型形成剧烈炎症反应的重要特征[25]。在本研究中，大黄素抑制D-GalN/LPS诱导炎症因子TNF-α、IL-6的产生，提示大黄素对D-GalN/LPS诱导的小鼠肝损伤具有抗炎作用。有研究结果表明，大黄素抑制LPS诱导的巨噬细胞或急性肺损伤产生TNF-α[26-27]。另外，MPO活性的增加被认为是急性炎症病程中中性粒细胞活化和积聚的一个重要指标[28]。本研究中MPO的活性结果表明D-GalN/LPS诱导的模型组小鼠中性粒细胞浸润增多，而大黄素干预组这一现象则有所减轻，这与组织病理学结果一致。
自噬是一种保守过程，通过溶酶体降解清除细胞内受损的细胞器、多余的蛋白质、氨基酸、入侵的微生物等，对细胞的生存起着至关重要的作用[17-20]。研究发现，自噬过程与炎症损伤的发病机制和预后有着紧密的联系[18-20]。LC3-Ⅱ、Beclin1被认为是自噬的标志性蛋白[29-31]。本研究结果显示，D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠肝组织内LC3-Ⅱ、Beclin1表达水平下降，表明细胞自噬过程受到抑制；大黄素处理组显著上调了LC3-II、Beclin1表达水平，表明大黄素激活了自噬作用。本研究中采用自噬抑制剂3-MA干预后，显著阻断了大黄素对肝脏组织病理学异常的保护作用，逆转了大黄素抑制炎症因子释放及提高生存率的有益效应。上述结果表明D-GalN/LPS组使自噬作用失活，大黄素可以在D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤中重新激活自噬作用。因此，笔者推测大黄素通过恢复受损的自噬作用，至少部分地对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤起到保护作用。然而，大黄素激活自噬的具体机制尚不清楚，仍需要进一步研究。
综上所述，本研究结果显示大黄素减轻D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤，通过减少肝脏转氨酶生成，抑制炎症因子的释放，改善肝组织病理学损伤，提高小鼠的生存率；同时伴随着肝组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1水平上调，该保护效应可被自噬抑制剂3-MA所逆转，表明大黄素对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤的保护机制可能与激活自噬有关。尽管大黄素激活自噬的详细机制有待进一步研究，但在本研究结果中，大黄素对急性肝损伤的保护作用仍显示其具有潜在的应用价值。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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