热射病（heat stroke，HS）是人体体温调节功能失调而出现的严重综合征，永久性的神经损伤是热射病患者预后不良的重要特征^[1]。小胶质细胞极化状态与中枢神经系统炎症密切相关^[2]，对其极化状态的干预，可能是改善热射病神经损伤预后的关键手段。环状RNA (circular RNA, circRNA) 在神经损伤及相关疾病的发生和发展过程中起着重要的调控作用^[3]，但是关于非编码RNA在热射病中的研究很少，尤其是circRNA与热射病的相关研究尚未见有报道。本研究将检测circhipk3在热射病神经损伤中小胶质细胞的表达情况，探讨circhipk3对小胶质细胞极化的影响及机制，为热射病的治疗提供理论依据和新的靶点。

63只12周龄健康雄性BALB/c小鼠由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SYSK（苏）2017-0046。饲养及实验过程中遵守南通大学动物管理与保护准则。

恒温水浴循环器（江苏博医康公司）；MX3005p型Real－Time PCR仪（美国Stratagene公司）；立体式显微镜-SZ61（日本奥林巴斯公司）；恒温恒湿培养箱-SPX-250C（上海博讯实业有限公司）。

Trizol RNA试剂盒购于上海赛默飞世尔科技有限公司；定量PCR试剂盒购于上海赛默飞世尔科技有限公司；大鼠CD45抗体（ab208022，1:500）、CD11-b抗体（ab133357，1:500）、CD206抗体（ab125028，1:500）、FIZZ抗体（ab226335, 1:500）、Arg1抗体（ab124917，1:500）均购于上海艾博抗贸易有限公司；β-Actin抗体（A5441, 1:3000）上海斯信生物科技有限公司；circhipk3 mimics，circhipk3 inhibitor由上海美乐生物技术研发中心合成；IRDye® 800CW Conjugated Goat (polyclonal) Anti-Mouse, （1：10 000）及Anti-Rabbit（1：10 000）购于上海赛默飞世尔科技有限公司。

所有小鼠经异丙嗪腹腔麻醉满意后固定，采用随机数字表法将动物分为健康对照组（control）及热射病组（HS）。对照组15只不进行热应激处理，而HS组使用电热毯加热至直肠温度达到（42.4±0.2）℃认为达到热暴露损伤要求，表示热射病小鼠建模成功。根据不同的损伤后时间分为3组，即热射病0.8 h组(HS 0.8)，热射病8 h组（HS 8），热射病24 h组（HS 24），每组小鼠16只。

将小鼠处死取脑组织，将胰酶消化后提取出原代的小胶质细胞收集至1.5 mL EP管中，加入适量的Trizol裂解细胞；向1.5 mL EP管中加入200 μL氯仿振荡混匀后静止5 min；4℃ 12 000 r/min离心10 min吸取上清于一新的1.5 mL EP管中；向分离出的上清中加入（以1:1的比例加入等量的）异丙醇，充分混匀；4℃ 12 000 r/min离心10 min弃上清；用75% 乙醇洗涤沉淀一次，4℃ 7 500 g离心5 min，室温晾干，加入20~50 μL DEPC水溶解，测定浓度，-80℃保存。

将上述总RNA样本利用MxPro-Mx3005P real-time PCR系统开展Q-PCR检测，取1 μg的mRNA按照说明书进行逆转录后，取2 μL cDNA制备成PCR反应体系，终体积为20 μL用做对应的组用于做q-PCR的模板。每组在实验时设置三个复孔。记录每个模板的CT值。利用2-ΔCT法检测circhipk3、CD45、CD11-b、TNF-α、CD206、FIZZ、Arg1、HPRT以及HO-1mRNA相对丰度，相对表达量计算公式：RQ = 2-(DCtq -DCtcb)

将小鼠处死后不同时间点的脑组织进行Western blot检测，在各组细胞中加入RIPA裂解液充分提取总蛋白，十二烷基硫酸钠钠盐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光显色成像。以β-action作为对照，分析CD45、CD11-b、CD206、FIZZ、Arg1、HPRT以及HO-1蛋白的相对表达量。

将原代的小胶质细胞移入培养皿中，加入适量的培养基进行培养。检测CD45和Arg1在小胶质细胞的表达情况，将培养稳定后的神经细胞，弃掉培养基，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后，加入4%多聚甲醛室温固定40 min，PBS漂洗10 min、3次，用荧光封闭液室温孵育2 h，结束后，CD45抗体，Arg1抗体4℃孵育过夜，PBS漂洗5 min、3次后，加入Dylight 594（1∶400）荧光标记和Dylight 488（1∶400）荧光标记的二抗室温避光孵育2 h，PBS避光漂洗5 min、3次，加入DAPI复染细胞核避光孵育30 min，再次PBS漂洗15 min、3次，用荧光封片液封片。使用共聚焦显微镜观察并照相。融合图像叠加图像，显示两重标记的单元格。

将制备的原代小胶质细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/mL后接种于24孔细胞板上，将其随机（随机数字法）分为对照组，circHIPK3 NC组，circHIPK3 mimics组，circHIPK3 inhibitor组，组含有3个复孔。以Lipofectamine2000分别转染至相应小胶质细胞中，空白对照组细胞不做转染。转染6 h后，更换培养液后继续培养48 h。定量PCR验证转染成功后，加入TNF-α诱导M1型小胶质细胞。24 h后，收集细胞行定量PCR实验检测CD45、Arg1、HO-1 mRNA表达水平。

SPSS19.0软件对实验结果进行统计分析，小胶质细胞M1、M2型标志分子表达水平以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

将健康对照组及热射病0.8 h组(HS 0.8)，热射病8 h组（HS 8），热射病24 h组（HS 24）的小鼠脑组织进行处理，分离出小胶质细胞，电镜所示如下，放大倍数×400（图 1所示）。电镜下观察到随着热刺激时间的延长，小鼠小胶质细胞在热刺激组（HS 0.8、HS 8、HS 24）较对照组增多，尤其以热刺激8 h明显增多。但热刺激8 h与24 h的小鼠小胶质细胞数量没有明显改变趋势。预示热射病8 h可能是小胶质细胞极化较为重要的时间节点。

热刺激后不同时间小鼠小胶质细胞的电镜图（×400）。A：Control组；B：HS 0.8组；C：HS 8组；D：HS 24组 图 1 小鼠热刺激后小胶质细胞改变 Fig 1 Microglial changes in mice after thermal stimulation

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为了检测热刺激后小鼠小胶质细胞的分型，进一步检测小胶质细胞M1型标记物CD45、TNF-α、CD11-bmRNA以及M2型标记物CD206、FIZZ、Arg1mRNA表达情况，同时进行Western blot检测表达分析。

HS 8组在CD45、CD11-b表达较对照组明显上升[（4.41±0.18）vs.（1±0.15），P=0.000]、[（3.47±0.19）vs.（1±0.15），P=0.000]，而HS 24组的CD45、CD11-b较HS 8组明显下降[（1.34±0.15）vs.（4.41±0.18），P=0.000]、[（1.38±0.21）vs.（3.47±0.19），P=0.001]（图 2）。

A: 检测不同分组中小鼠小胶质细胞M1型标记物CD45、TNF-α、CD11-bmRNA的表达情况，HS 8组在CD45、CD11-b表达较正常组明显上升，而HS 24组的CD45、CD11-b较HS 8组明显下降。B: 四组对应的Western blot检测表达情况 图 2 热射病小鼠小胶质细胞M1标记物表达情况 Fig 2 Expression of M1 markers in microglial cells of mice with heat sickness.

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同时HS 8组在CD206、FIZZ、Arg1表达较对照组开始上升[（1.59±0.16）vs.（1±0.12），P=0.014]、[（1.62±0.15）vs.（1±0.15）, P=0.002]、[（2.23±0.28）vs.（1±0.19）, P=0.004]，而HS 24组的CD206、FIZZ、Arg1较对照组显著升高[（2.67±0.20）vs.（1±0.12），P=0.002]、[（2.19±0.15）vs.（1±0.15），P=0.000]、[（3.04±0.18）vs.（1±0.19），P=0.001]（图 3）。预示热射病早期（8 h）脑组织中主要为M1型小胶质细胞活跃，而M2型小胶质细胞开始参与；热射病24 h脑组织中主要为M2型小胶质细胞，M1型明显减少。

A: 检测不同分组中小鼠小胶质细胞M2型标记物CD206、FIZZ、Arg1mRNA的表达情况，HS 8组在CD206、FIZZ、Arg1表达较正常组开始上升，而HS 24组的CD206、FIZZ、Arg1较正常组显著升高。图B为四组对应的Western blot检测表达情况 图 3 热射病小鼠小胶质细胞M2标记物表达情况 Fig 3 Expression of M2 markers in microglial cells of mice with heat sickness

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继续检测热刺激后HPRT和HO-1基因mRNA表达情况，HPRT在热射病0.8 h、24 h较对照组表达均差异无统计学意义[（1.42±0.12）vs.（1±0.17），P=0.055]、[（1.25±0.13）vs.（1±0.17），P=0.182]；而8h较对照组、24 h均差异有统计学意义[（1.54±0.10）vs.（1±0.17），P=0.016]、[（1.54±0.10）vs.（1.25±0.13），P=0.004]。同时HS 0.8组及HS 8组的HO-1较正常组明显升高[（8.12±0.25）vs.（1±0.20），P=0.000]、[（7.86±0.24）vs.（1±0.20），P=0.000]，HS 24组的HO-1较正常组明显下降[（5.60±0.21）vs.（1±0.20），P=0.000]（图 4）。热刺激后HO-1的变化趋势与上述小胶质细胞M1型标记物极化趋势相似，预示HO-1可能是小胶质细胞M1型标记物之一。

热刺激后四组小鼠小胶质细胞HPRT和HO-1基因mRNA表达情况，HPRT在热射病各小组表达差异无统计学意义；而HS 0.8组及HS 8组的HO-1较正常组明显升高，HS 24组的HO-1较正常组明显下降。 图 4 热射病小鼠脑组织小胶质细胞HPRT和HO-1mRNA表达情况 Fig 4 Expression of HPRT and HO-1 mRNA in microglia of brain tissue of mice with heat radiation disease

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免疫荧光镜下所示，CD45显示红色荧光标记，Arg1显示蓝色荧光标记。CD45在HS 0.8开始表达明显；HS 8较对照组显著表达，HS 24表达减退；而Arg1在热损伤后HS 24表达显著增加，预示热刺激后8 h主要以小胶质细胞M1型活跃，24 h以小胶质细胞M2型活跃为主。（图 5所示）。

CD45显示红色荧光标记，Arg1显示蓝色荧光标记。CD45在HS 0.8开始表达明显；HS 8较对照组显著表达，HS24表达减退；而Arg1在热损伤后HS24表达显著增加 图 5 免疫组织荧光共定位小胶质细胞标志物表达（100 mm） Fig 5 Fluorescence co-localization of microglial marker expression in immunohistochemistry (100 mm)

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qPCR检测circHIPK 3在正常组与热射病组小胶质细胞间的表达情况，从各组小胶质细胞抽提其中RNA后，逆转录合成cDNA，Realtime PCR circhipk3的表达。结果显示HS 0.8组、HS 8组小胶质细胞的circhipk3的表达水平较正常组小胶质细胞开始升高[（1.27±0.11）vs.（0.76±0.10），P=0.000]、[（3.20±0.08）vs.（0.76±0.10），P=0.000]，HS 24组较对照组显著增高[（6.15±0.26）vs.（0.76±0.10），P=0.000]（图 6）。

qPCR检测circHIPK 3在正常组与热射病组小胶质细胞间的表达情况，HS 0.8组、HS 8组小胶质细胞的circhipk3的表达水平较正常组小胶质细胞逐渐升高，HS 24组较对照组明显增高 图 6 热射病小胶质细胞circhipk3表达情况 Fig 6 Circhipk3 expression in microglial cells

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分离培养原代小胶质细胞，分别用circhipk3 NC，circhipk3 mimics，circhipk3 inhibitor进行转染。qPCR检测M1（CD45）和M2（Arg1）及HO-1细胞因子的表达（图 7）。与NC转染组相比，circhipk3 mimicis显著增高Arg1表达[（7.26±0.06）vs.（3.86±0.06），P=0.000]，抑制CD45及HO-1表达；同时circhipk3 inhibitor促进CD45及HO-1表达[（2.96±0.03）vs.（1.63±0.09），P=0.000]、[（2.52±0.10）vs.（1.30±0.02），P=0.000]，抑制Arg1表达。这一趋势预示circhipk3参与热射病小胶质细胞极化，主要促进小胶质细胞向M2型活化。

qPCR检测M1（CD45）和M2（Arg1）及HO-1细胞因子的表达。与NC转染组相比，circhipk3 mimicis显著增高Arg1表达，抑制CD45及HO-1表达；同时circhipk3 inhibitor促进CD45及HO-1表达，抑制Arg1表达 图 7 circhipk3参与热射病小胶质细胞极化 Fig 7 Circhipk3 participates in microglial polarization of heat radiation disease

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热射病往往并发多器官功能障碍综合征(multiple organdysfunction syndrome，MODS)，其中30%的热射病患者神经功能受到不同程度的缺失^[5]。热刺激对中枢神经系统造成损伤的原因^[6]，首先高热直接造成细胞膜损伤，引起酶变性、线粒体功能障碍、细胞膜稳定性破坏、通透性改变和能量代谢途径异常；随后由炎症因子及其他免疫介质诱发的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）对脑组织造成继发性损伤。小胶质细胞是参与中枢炎症反应的重要细胞类型，其不同的极化状态对神经元细胞产生损害（M1型）或保护作用（M2型）^[7]，故调控小胶质细胞极化状态是控制炎症反应的关键。

在HS发生的早期，全身血流量开始重新分布，皮肤血流量增加而减少了内脏器官的血流量，脑组织发生缺血缺氧性损害，小脑是热损伤的重要靶器官之一，对热应激异常敏感^[8]，此时主要由下丘脑区域释放促炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α等)及过氧化物(ROS)继发性加重脑损伤^[9]，促使神经细胞进一步凋亡、坏死。既往研究发现小鼠的部分血清炎症因子（如IL6）在热刺激后0.5 ~1 h可达到峰值^[10]，大鼠在热暴露24 h、48 h、72 h时巨噬细胞iNOS mRNA及蛋白无差别，而ArgⅠmRNA及蛋白在24 h开始降低^[11]。考虑机体所能耐受的最高体温时间约45 min至8 h^[12]，结合高温的持续时间和小鼠脑组织耐受高温的程度。故本研究设定热刺激0.8 h、8 h及24 h作为早期热射病神经组织的观察分组。

由于热射病多为散发病例，大规模的临床研究收集资料很难实施，因此通过构造动物模型来研究热射病的发病机制具有积极意义。本研究成功进行热射病小鼠模型构造，在热射病早期（8 h）脑组织中检测出CD45、TNF-α、CD11-b，主要为M1型小胶质细胞活跃。提示M1型小胶质细胞参与热射病早期神经损伤炎症反应。故调控M1型小胶质细胞的极化趋势成为降低热射病早期神经损伤反应的有效方法。

血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一种在多种因素（压力、损伤、刺激）下应激产生的微粒体酶，HO-1及其介导激活的相连物质释放而起到保护机体的作用^[13]，HO-1在抗氧化反应发生、抗炎、抑制细胞凋亡、改善组织微循环、重塑细胞结构等方面发挥重要作用，是调控内源性氧化应激的重要信号通路^[14-15]，目前主要研究集中在抑制心肌纤维化、延缓心肌重构^[16]等方面；高糖导致的足细胞损伤中均证实HO-1与上调自噬有关^[17]；诱导减轻肾损伤时肾小管上皮细胞的衰竭程度^[18]等。本实验中发现HS 0.8组及HS 8组的HO-1较正常组明显升高，HS 24组的HO-1较正常组明显下降。HO-1的变化趋势与其他小胶质细胞M1型标记物（CD45、TNF-α、CD11-b）极化趋势相似，Li等^[19]认为大鼠热射病时HO- 1表达增加了小脑浦肯野细胞的损伤。笔者认为HO-1可能是小胶质细胞M1型标记物之一。

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，HPRT）能控制细胞周期和增殖机制，RNA代谢，DNA复制和修复等，参与调解神经元/神经胶质细胞的功能^[20]。试验中进行HPRT基因的mRNA表达检测，发现HPRT在热射病各小组表达差异无统计学意义。提示HPRT可能不参与热射病小胶质细胞极化的机制。

Circ RNAs因其环状结构比线性RNA具有更好保守性及稳定性^[21]，成为近期研究热点。目前发现circ HIPK3具有心脏保护及再生新生微血管的作用^[22]，可促进糖尿病视网膜血管的生成^[23]，此外过表达circ HIPK3可抑制膀胱癌细胞的迁移^[24]等。实验中发现HS 0.8组、HS 8组的小胶质细胞circhipk3的表达水平逐渐升高，HS24组显著增高。进一步进行circhipk3 NC，circhipk3 mimics，circhipk3 inhibitor分组并转染，circhipk3 mimicis显著增高M2型标记物表达，抑制M1型标记物表达；同时circhipk3 inhibitor促进M1表达，抑制M2表达。提示热射病中circhipk3参与小胶质细胞活化，主要促进M2极化，负向调控M1型小胶质细胞，从而间接抑制小胶质细胞炎症反应。circhipk3可能是调控小胶质细胞极化机制的有效作用靶点。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突。