2020, Vol. 29
2 苏州大学附属第二医院急重症医学科 215004
2 Department of Emergency and Critical Care Medicine, the Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China
脓毒症是一种全身性炎症反应综合征，是由于宿主无法对感染进行局部限制而引起的。多型核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）是机体宿主防御的主要屏障，在脓毒症发病过程中起着重要角色。为了成功清除病原体并防止它们扩散到体循环中，PMNs被募集至感染部位吞噬侵入的病原体。另外，炎症介质与微生物终产物的协同作用可诱导PMNs活化, PMNs释放与颗粒抗菌肽和酶相关的染色质纤维网络，如DNA、髓过氧化物酶（MPO）、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G等，称为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）。Brill等[1]在深静脉血栓形成的动物模型中证实了NETs的存在，并认为NETs在脓毒症相关血管病变中的作用是基于血小板的聚集和活化。Kambas等[2]研究了脓毒症过程NETs中的组织因子（tissue factor，TF）在诱导凝血和血栓形成中所起的作用，然而调控NETs在脓毒症血栓形成中的作用机制和途径仍不明了。
干扰素长期以来被用于炎症、代谢和癌症的机制研究。研究表明干扰素-λ1（interferon-λ1, IFN-λ1）在免疫调节和辅助性T细胞分化中具有多效性[3]，在不影响宿主适应性的情况下构成抗病毒防御的前线[4]。然而，IFN-λ在中性粒细胞功能的其他炎性方面，如NETs释放中的作用罕有探讨。本研究假设脓毒症血清来源的C5a补体活化导致TF表达的NETs的释放是脓毒症血栓形成的机制之一，白介素29（interleukin 29，IL-29）对NETs的释放具有负调控作用，并抑制了NETs相关的凝血酶的生成，以进一步探讨免疫机制在脓毒症血栓形成中的调节作用。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集12例健康志愿者和12例脓毒症患者的外周血样，分别来自2018年5月至2019年6月苏州大学附属第二医院门诊和住院者，每个志愿者或患者及其亲属签署知情同意书，并得到医院伦理委员会的批准（批准号：JD-LK-2019-102-01）。脓毒症患者符合2016年美国重症医学会和欧洲重症医学会联合发布脓毒症3.0定义及诊断标准，血培养鉴定出革兰阴性菌为必备条件，D-二聚体含量 > 0.5 mg/L，CT肺血管造影、彩色多普勒超声检查显示血栓存在。
1.2 实验试剂RIPA裂解液、BCA蛋白试剂购自碧云天；重组IL‐29购自R & D公司；凝血酶-抗凝血酶（TAT）ELISA试剂盒购自Assaypro公司；4’，6-二脒基-2-苯吲哚（DAPI），碘化丙啶（PI）购自Sigma公司；人源化抗CD88抗体、小鼠抗人TF单克隆抗体，兔抗人GAPDH多克隆抗体，HRP标记的驴抗小鼠、山羊抗兔多克隆抗体，IgG1抗CD19单克隆抗体，羊抗小鼠的Alexa Fluor 488抗体，均来自Abcam公司。
1.3 实验方法 1.3.1 分离PMNs分离来自健康志愿者的肝素化静脉血中分离PMNs。根据产品说明，使用多型核分离试剂通过密度梯度离心分离PMNs，并用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。Giemsa染色评估嗜中性粒细胞纯度 > 98%，在不含Ca2+ / Mg2+离子的Hanks平衡盐溶液中洗涤PMNs，调节细胞数量至2×106个细胞/mL, 然后将其悬浮在RPMI 1640培养基中。
1.3.2 刺激和抑制PMNs以每孔1.5×106个细胞/mL浓度接种于6孔培养板中，根据需要预先置入多聚赖氨酸处理的无菌玻片，PMNs在37℃（5%CO2）的RPMI培养基中与来自健康对照组血清或脓毒症患者的血清一起培养3 h，终浓度为6%。据以往研究报道，6%为刺激PMNs和避免NETs降解的最佳浓度，并且PMNs释放NETs的最佳时间为3 h[5]，与本实验结果基本一致（资料未显示）。为了研究IL-29是否可以作为NETs释放的有效抑制剂，重组IL-29 (50 ng/mL）预处理PMNs 30 min。为了研究C5a在脓毒症患者血清中的可能作用，首先在冰上用C5a受体阻断剂抗CD88抗体（1:50稀释）预处理细胞30 min。本研究中使用的所有试剂均不含内毒素。
1.3.3 NETs的免疫荧光染色固定和破膜：从6孔板中取出细胞爬片，用4%多聚甲醛（PFA）4 ℃过夜固定细胞。依次用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，用含0.5% Triton X-100的PBS透膜。
样品染色：利用小鼠抗TF单克隆抗体（1:200稀释）进行样品染色，IgG1抗CD19单克隆抗体（1:200稀释液）作为同种型对照，多克隆羊抗小鼠的Alexa Fluor 488抗体（1:1 000）作为第二抗体，4’，6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI，1:2 000）对DNA进行了复染，激光共聚焦显微镜成像，通过在双盲实验过程中检测200个细胞来确定NETS释放细胞的百分比。
1.3.4 蛋白质印迹PMNs通过在冰上重悬浮于RIPA缓冲液中1 h以裂解细胞。4℃下14 000 r/min离心10 min除去碎片后，用BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce）测量蛋白质浓度。将蛋白质（每泳道约含80 μg蛋白质）在2×SDS上样缓冲液中1:1稀释，在100℃加热5 min，在变性条件下用12%SDS-PAGE分离样品，并转移至0.45 μm硝酸纤维素膜。将膜在含3%脱脂乳的Tris-HCl吐温缓冲液（TBST）溶液中封闭2 h，然后与以下一抗孵育:小鼠抗人TF mAb（1:1 000稀释），兔抗人GAPDH多克隆抗体（1:4 000稀释），在4℃温育过夜。用TBST彻底洗涤后，然后与HRP连接的完整驴抗小鼠（1:4 000稀释）或羊抗兔多克隆抗体（1:4 000稀释）分别在室温下孵育1.5 h。使用ECL检测系统检测免疫反应性蛋白质并暴露于X线胶片，凝胶成像分析仪进行吸光度扫描，采用Image J软件对图像条带作半定量分析，将TF蛋白与内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的比值作为各自的相对表达量。
1.3.5 酶联免疫吸附测定凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物浓度将1.5×106体外刺激的PMNs在37℃（5%vs）的RPMI培养基中接种于6孔培养板中，3 h后用RPMI培养基洗涤细胞两次。为了分离NETs结构，向每个孔中加入1 mL RPMI，并在剧烈搅拌后将培养基液体以1 300 r/min离心5 min收集NETs结构。将分离的NETs上清液与健康志愿者血浆以1:4的比例混合，并在37℃下孵育30 min，用TAT ELISA试剂盒测量TAT复合物水平，最低检测水平为300 pg/mL。
1.3.6 循环DNA定量将上述分离的NETs上清液在PBS中稀释1:10（v/v）。稀释后的液体与50 μL体积1 μg/mL浓度的碘化丙啶（PI）混合，PI用于标记循环DNA，荧光分析仪上536 nm激发的617 nm发射的荧光信号被记录。根据DNA标准曲线（0.1~8 μg/mL范围）计算DNA浓度，并用PBS与1 μg/mL PI混合测定自发荧光。
1.4 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 脓毒症患者血清C5a诱导健康志愿者PMNs上TF的累积和表达TF的NETs释放TF是凝血级联反应的关键因子。为了测试源自脓毒症血清的诱导因子C5a对表达TF的NETs形成的影响，本研究采用脓毒症患者血清刺激健康志愿者PMNs，通过免疫荧光技术共聚焦显微镜双盲观察200个细胞，以TF和DAPI阳性表达为NETs释放细胞。结果显示，与健康志愿者血清孵育的PMNs释放NETs水平（4.4±2.6）%相比，表达TF的NETs释放细胞明显增多（20.5±3.7）%（q=11.34，P < 0.01）。同时通过免疫印迹对PMNs释放的NETs中TF的表达进行定位，与健康志愿者血清孵育的PMNs上TF相对表达水平（0.38±0.04）%相比，脓毒症血清C5a诱导的PMNs上TF相对表达水平明显增多（0.81±0.03）%，差异有统计学意义（q=4.81，P < 0.01）。本研究进一步评估了C5a在实验模型中的作用，将C5a受体（CD88）用抗CD88抗体阻断，在冰上处理PMNs 30 min，然后与来自脓毒症患者的血清一起孵育，与未经阻断脓毒症血清C5a诱导的PMNs上TF表达的NETs释放水平相比，阻断C5a受体后导致PMNs释放TF表达的NETs显著减少（7.3±3.1）%（q=8.73，P < 0.01）。与未阻断脓毒症血清C5a诱导的PMNs上TF相对表达水平相比，阻断后TF相对表达水平显著降低（0.57±0.02）%，（q=3.21，P < 0.05）。循环核小体和PMNs活化与深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）之间有一定的相关性，血清中DNA含量可作为体内NETs形成的间接标志物[6]，本研究发现脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs上清液中循环DNA含量显著升高（3.40±1.11）μg/mL，用健康志愿者血清刺激的PMNs上清液中未出现上升迹象（0.42±0.17）μg/mL，两者差异有统计学意义（q=14.56，P < 0.01）。当用C5a受体阻滞剂抗CD88抗体阻断后，脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs上循环DNA含量明显下降（0.64±0.25）μg/mL（q=12.85，P < 0.01），见表 1和图 1~2。
| 组别 | 例数 | 免疫荧光法 | 荧光光谱法 | 免疫印迹法 | 酶联免疫法 | |||
| NETs释放细胞（%） | 循环DNA（μg/mL） | TF相对表达（%） | TAT复合物（ng/mL） | |||||
| 健康志愿者血清组 | 12 | 4.4±2.6 | 0.42±0.17 | 0.38±0.04 | 3.2±0.9 | |||
| 脓毒症患者血清组 | 12 | 20.5±3.7a | 3.40±1.11c | 0.81±0.03e | 7.8±0.7g | |||
| 脓毒症患者血清+IL-29组 | 12 | 5.0±1.5b | 0.44±0.19d | 0.52±0.03f | 3.3±0.4h | |||
| 脓毒症患者血清+抗CD88组 | 12 | 7.3±3.1b | 0.64±0.25d | 0.57±0.02f | 4.6±0.7h | |||
| F值 | 133.39 | 103.92 | 117.66 | 106.46 | ||||
| P值 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 | ||||
| 注：与健康志愿者血清组同类方法NETs释放细胞表达水平比较，aP < 0.01；与脓毒症患者血清组同类方法NETs释放细胞表达水平比较，bP < 0.01；与健康志愿者血清组同类方法循环DNA表达水平比较，cP < 0.01；与脓毒症患者血清组同类方法循环DNA表达水平比较，dP < 0.01；与健康志愿者血清组同类方法TF相对表达水平比较，eP < 0.01；与脓毒症患者血清组同类方法TF相对表达水平比较，fP < 0.05；与健康志愿者血清组同类方法TAT复合物表达水平比较，gP < 0.01；与脓毒症患者血清组同类方法TAT复合物表达水平比较，hP < 0.01 | ||||||||
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| TF（绿色）和DAPI标记DNA（蓝色），原始放大倍数600倍，标尺：5μm 图 1 共聚焦显微镜分析脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs上TF表达的NETs释放 Fig 1 Detection of the release of NETs expressed by TF on PMNs of healthy volunteers induced by serum-derived C5a of sepsis patients under confocal microscopy |
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| 图 2 免疫印迹分析抗CD88抗体、IL-29对脓毒症患者血清C5a处理的PMNs上TF表达作用 Fig 2 Western blot analysis of the effects of anti-CD88 antibodies and IL-29 on TF expression from PMNs of healthy volunteers after stimulation with serum-derived C5a of sepsis patients |
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在脓毒症血栓形成炎症环境中血清C5a诱导PMNs上出现TF的细胞内累积和NETs的释放，IL-29作为细胞因子具有一定的免疫调节作用，因此研究IL-29是否有抑制NETs形成作用的能力。结果表明，与未经IL-29处理的脓毒症血清C5a诱导PMNs上TF相对表达水平相比，用IL-29预处理的PMNs细胞内TF相对表达的显著减少（0.52±0.03）%（q=3.44，P < 0.05）。并且IL-29预处理消除了由脓毒症血清C5a诱导的PMNs上表达TF的NETS形成，免疫荧光表达NETs释放水平明显降低（5.0±1.5）%，与脓毒症血清C5a诱导的PMNs上表达TF的NETs释放水平相比（20.5±3.7）%，差异有统计学意义（q=9.23，P < 0.01）。同时，与未经IL-29处理的脓毒症血清C5a诱导PMNs上清液中循环DNA表达水平相比（3.40±1.11）μg/mL，IL-29预处理也降低了在分离的NETs结构上清液中循环DNA的水平（0.44±0.19）μg/mL（q=11.24，P < 0.01），见表 1和图 1~2。
2.3 IL-29抑制血栓形成的脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs上NETs相关的凝血酶生成为研究脓毒症患者血清C5a对通过源自PMNs释放的NETs是否能诱导凝血酶产生的能力，且NETs依赖性凝血酶生成是否由脓毒症血清的特定组分诱导，本研究进行了凝血酶生成测定，通过检测脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs的上清液中TAT复合物生成能力加以确认。结果显示，用脓毒症患者血清C5a诱导的PMNs上清液中TAT复合物水平显著升高（7.8±0.7）ng/mL，当与抗CD88抗体预孵育阻断PMNs上C5a受体，降低了上清液中TAT复合物水平（4.6±0.7）ng/mL，差异有统计学意义（q=5.27，P < 0.01）。之前结果显示，IL-29既可作为PMNs表达TF的调节剂，又可作为NETs的抑制剂，因此，本研究测试IL-29对NETs相关的凝血酶形成活性的影响，发现与未经IL-29处理的脓毒症血清C5a诱导的PMNs上清液中的TAT复合物水平相比，IL-29的处理减弱由脓毒症血清C5a刺激的PMNs上NETs相关的凝血酶形成信号，TAT复合物表达水平为（3.3±0.4）ng/mL，差异有统计学意义（q=6.77，P < 0.01）。以上结果提示，补体C5a对NETs相关的凝血酶生成具有重要的作用，但其可被免疫细胞因子IL-29和C5a受体阻滞剂所消除，见表 1。
3 讨论近年来，免疫调节、炎症反应、血栓形成之间潜在的相互作用一直是研究的热点和探讨的方向，补体和PMNs是先天免疫和急性炎症的关键组成部分，在脓毒症炎症过程中，C5a通过外周补体的激活而过量产生，PMNs被C5a激活发挥免疫防御作用，除了能够吞噬消灭病原体、脱颗粒释放抗菌物质外，PMNs也能通过一种由颗粒蛋白和DNA构成的NETs来捕获病原体。前期研究表明，补体过敏毒素C5a上调了急性呼吸窘迫综合征患者肺泡内中性粒细胞上TF的表达[7]，C5a又可促进血液透析患者相关血栓形成[8]，对抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）患者血栓形成的中纤维蛋白凝块成分研究发现，凝块中含有包括血液凝固成分之外的一些NETs形成相关蛋白的存在，如髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），组蛋白等[9]，表明NETs可能参与血栓形成并影响其性质，这些研究也暗示了C5a、NETs、血栓形成三者之间存在着某种关联。本研究显示，用脓毒症患者血清C5a刺激健康志愿者PMNs，导致PMNs细胞内TF的累积，携带TF表达的NETs释放增多，及其相关的TAT复合物水平的升高，表明补体C5a诱导的PMNs上表达TF的NETs释放可激活随后的凝血级联反应并产生凝血酶。在用C5a受体拮抗剂抗CD88单抗处理后，导致NETs释放的减少和NETs相关凝血酶生成的降低，说明了C5a和NETs在脓毒症患者血栓形成机制中的可能作用，以及它们作为新治疗靶标的潜在用途。
一些针对NETs形成的抗血栓治疗策略已成功应用于小鼠模型中，例如用肽酰基精氨酸脱亚氨酶（PAD4）抑制剂、NETs分解剂、DNase酶等药物来靶向治疗NETosis——一种中性粒细胞特殊的死亡程序[10]。但是这些NETs抑制剂具有一定的局限性，已有文献报道这些靶向药物在抗血栓治疗中有出血风险，因而寻求新型、安全的NETs抑制剂刻不容缓。之前有研究表明IL-29通过抑制中性粒细胞浸润和IL-1β的产生以发挥抗炎作用[11]，而且，IL-29基本不影响正常的止血功能[12]，本研究探讨了IL-29通过调节中性粒细胞信号通路以减少血栓形成的炎症。本研究结果表明，IL-29抑制了血清C5a诱导的PMNs上TF的累积和NETs的释放，以及NETs相关的凝血酶的生成。以上结果证明，在血栓形成的脓毒症炎症环境中，IL-29对PMNs调节起着重要作用，同时它作为抗凝血能力的调节因子，用于治疗NETs相关的血栓形成，可以实现很好的抗血栓效果。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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