中华急诊医学杂志  2020, Vol. 29 Issue (6): 815-819   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2020.06.015
GPR174通过调控炎症反应影响汉族人群脓毒症的易感性
王建李1 , 仇冬则2 , 胡延妍1 , 童朝阳1 , 宋振举1     
1 复旦大学附属中山医院急诊科,上海 200032;
2 复旦大学附属中山医院中西医结合科,上海 200032
摘要: 目的 失控的炎症反应是脓毒症的主要发病机制。近期发现G蛋白偶联受体-174 (GPR174)在免疫反应的调控和自身免疫性疾病的发病过程中具有重要的作用。本研究探讨GPR174基因多态性与汉族人群脓毒症易感性的相关性和机制。方法 收集2005年5月至2017年12月入住复旦大学附属中山医院急诊重症监护室(ICU) 575例脓毒症和579例非脓毒症的患者进行病例对照研究,利用ABI 7900平台TaqMan Real-time PCR方法对GPR174基因的SNP rs3827440进行基因测序,酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。建立CLP脓毒症小鼠模型,观察Gpr174基因敲除后(Gpr174 KO)对脓毒症小鼠生存率和炎症反应的影响。结果 GPR174基因rs3827440与汉族人群脓毒症的易感性显著相关。脓毒症患者携带TT/T基因型/等位基因比例明显高于ICU非脓毒症对照组,Logistic回归分析纠正性别因素差异有统计学意义(OR= 1.68, 95% CI: 1.19-2.20, P = 0.0004)。进一步研究发现,脓毒症患者外周血IL-6和TNF-α的浓度与基因型有关,携带TT/T基因型患者外周血IL-6和TNF-α浓度显著高于携带CC/C基因型的患者,去除混杂因素后差异有统计学意义(P < 0.05)。动物实验发现,与野生型小鼠相比,Gpr174 KO小鼠脓毒症的生存率明显升高,血清中炎症介质TNF-α、IL-6、IL-1β的表达明显降低,抗炎因子IL-10明显升高(P < 0.01)。结论 结论GPR174通过调控炎症反应,影响脓毒症的发病和易感性。
关键词: 脓毒症    G蛋白偶联受体-174    易感性    免疫反应    炎症介质    
GPR174 was associated with the immune response and sepsis susceptibility in Chinese Han population
Wang Jianli1 , Qiu Dongze2 , Hu Yanyan1 , Tong Chaoyang1 , Song Zhenju1     
1 Department of Emergency Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, 200032;
2 Department of Integrative Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, 200032
Abstract: Objective Dysregulated host immune responses contribute to the pathogenesis of sepsis. G protein-coupled receptor 174 (GPR174) was found to be involved in the immune responses and associated with the susceptibility to autoimmune diseases. This study aimed to investigate the association of GPR174 variants with sepsis susceptibility and the contribution of GPR174 in sepsis development. Methods From May 2005 to December 2017, a total of 575 sepsis patients and 579 non-septic controls admitted to our Emergency ICU were enrolled in this case-control study. The non-synonymous SNP rs3827440 in GPR174 was genotyped using TaqMan Real-time PCR assays on ABI7900 platform. Then the correlation between rs3827440 and serum levels of interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were investigated in septic patients. Gpr174-defi cient mice were generated and subjected to cecal ligation and puncture (CLP). The concentrations of infl ammatory cytokines were measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Results Rs3827440 TT/T genotype in GPR174 was positively associated with sepsis risk after logistic regression analysis adjusted for sex [odds ratio (OR) = 1.68, 95% confi dence interval (CI): 1.19-2.20, P = 0.0004]. IL-6 and TNF-α serum levels in female TT and male T allele carriers of septic patients were signifi cantly higher than those in female CC and male C allele carriers (P < 0.05). Preclinical validation of Gpr174 gene was performed in Gpr174 knockout (KO) mice using CLP models. Gpr174 KO mice had higher survival rate. Moreover, Gpr174 KO mice had significantly decreased serum concentrations of IL-1β, IL-6 and TNF-α compared with WT mice, while the levels of IL- 10 was increased (P < 0.01). Conclusion GPR174 as a novel sepsis susceptibility gene in Chinese Han population is involved in the development and physiopathology of sepsis.
Key words: Sepsis    GPR174    Genetic variation    Immune response    Inflammatory mediators    

脓毒症(sepsis)是严重创伤、烧伤、休克、感染和外科术后的常见并发症,是非心脏ICU患者死亡的主要原因[1-2]。脓毒症患者的病情程度和预后与年龄、基础疾病、免疫状态和性别有关,但临床发现其发病和预后存在着较大的个体差异。大部分感染患者病情较轻,但20% ~ 30%患者进展为脓毒症,死于脓毒性休克和多器官功能衰竭[3]。较多研究已证实遗传因素在脓毒症发病过程中发挥了重要的作用,相继发现多个参与免疫反应的基因(IL- 10、IL-1、CD14、TNF-α、TOLLIP和TIRAP等)变异与脓毒症的易感性有关[3-4]。G蛋白偶联受体174 (GPR174)是细胞内外信号转导的重要蛋白,近期发现其参与了免疫反应的调节,在自身免疫性疾病、AIDS感染等过程中作用明显,其基因变异与Graves’病和Addison’ s疾病有关[5-6]。GPR174基因变异是否与脓毒症的易感性相关,至今未见研究报道。本研究探讨GPR174基因变异与中国汉族人群脓毒症的易感性,并进一步探讨了其可能的机制。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2005年5月至2017年12月入住复旦大学附属中山医院急诊ICU的575名脓毒症和579例非脓毒症的患者纳入本研究。脓毒症的诊断参照Sepsis 3.0的诊断标准[2],ICU病例对照组为同期入住ICU、具有脓毒症发病的高危因素(感染),但在住院期间未进展至脓毒症和既往无脓毒症病史的的患者。本研究的入选标准为:①年龄≥ 18周岁;②符合脓毒症的诊断标准或具有脓毒症患病的高危因素;③中国汉族人群;④患者之间无血缘关系;⑤病史资料、临床试验室和辅助检查结果齐全。排除标准包括:①患自身免疫性疾病或获得性免疫缺陷病;②恶性肿瘤;③近期接受化疗或者放疗;④患严重的慢性呼吸系统疾病(需要家庭氧疗或呼吸机治疗);⑤严重的慢性肝脏疾病(Child-Pugh评分>10分)。收集患者的基本资料和临床资料:感染部位、血常规、肝功能、血肌酐、28 d的病死率、用药史、慢性病史和家族史等。采用APACHE Ⅱ和SOFA评分系统对患者的严重程度进行评价。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会的批准(No: 2006-23),家属或患者签署知情同意书后入选本研究。

1.2 GPR174基因SNP分型

研究发现GPR174非同义突变-rs3827440与Graves’和Addision’ s病有关,并影响个体GPR174 mRNA的表达[5]。因此,本研究探讨rs3827440与脓毒症的易感性。采用外周血DNA提取试剂盒(Qiagen, Germany)提取DNA,操作按照试剂盒的说明书进行,提取后的DNA进行电泳鉴定和浓度测定。用Taqman SNP基因分型探针(C_25954273_10)在ABI 7900平台(Applied Biosystems, USA)上对GPR174基因的SNP rs3827440进行分型。根据检测到的荧光不同,用Prisms SDS 2.1软件进行聚类判断样本的基因型。

1.3 外周血细胞因子IL-6和TNF-α测定

为进一步探讨rs3827440是否影响患者的炎症反应,共收集116例脓毒症患者外周血,测定炎症介质的表达水平。脓毒症患者入院后24 h内抽取外周静脉血5 mL,肝素抗凝,室温下放置30 min后,4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液-80 ℃保存备用。采用ELISA方法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度进行检测。ELISA测定试剂盒购自美国R&D Systems, 公司,具体操作试剂盒按说明书进行。

1.4 CLP脓毒症小鼠模型的制备和生存率观察

选择10~12周龄健康C57BL/6小鼠,盲肠结扎穿孔法制作脓毒症模型。小鼠以0.2 mL/10 g腹腔注射2, 2, 2-三溴乙醇(Sigma公司),腹部剃毛,75%酒精消毒腹部区域,在无菌条件下,在腹中线打开腹部,找到盲肠,用6.0丝线结扎盲肠的一半,用19号针头在结扎盲端处对穿,轻轻挤压盲肠,从穿孔部位挤出少量粪便。将盲肠纳入腹腔,用6.0缝线缝合腹膜和腹部。在小鼠颈部皮下注射1 mL预热的0.9%生理盐水复苏小鼠,将术后小鼠放在加热垫上,直到从麻醉后苏醒放入鼠笼。

1.5 统计学方法

rs3827440的关联分析,因GPR174基因位于X染色体,首先对男性与女性的分别进行关联分析,对男女混合样本的整体分析,在Logistic回归分析中引入性别作为共变量用PLINK软件分析rs3827440与脓毒症发病的相关性。OR值的计算,在女性中是用纯合子之间的比较来计算的,忽略女性杂合子;在男性中则为等位基因之间的比较。在男女混合人群中,把男性半合子等同于相应的女性纯合子,两者进行合并,忽略女性杂合子,用合并后的两组的数目来计算OR[5]。正态分布的数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,并进行方差分析;非呈正态分布的数据则以四分位数或中位数表示,并进行秩和检验。分类资料用χ2检验。多元Logistic回归分析对影响脓毒症患者IL-6和TNF-α浓度的混杂因素(年龄、APACHE Ⅱ和SOFA评分)进行校正。生存分析采用KapanMeier分析,生存曲线使用GraphPad Prism7绘制。所有统计学分析均采用SPSS 22.0软件,双侧检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 入组患者的临床特征、GPR174 rs3827440基因型在脓毒症和ICU对照患者中的分布

研究期间共入选脓毒症患者575例,非脓毒症患者579例作为疾病对照组。所有纳入研究患者的一般资料和临床特征资料见表 1。脓毒症组与非脓毒症对照组患者相比,在性别、年龄、合并基础疾病、感染部位等方面差异无统计学意义(P>0.05),但脓毒症组患者APACHE Ⅱ评分、SOFA评分、28 d病死率均明显高于ICU对照组(P < 0.01)。

表 1 脓毒症和ICU对照组患者的一般临床特征 Table 1 Demographic and clinical characteristics of septic patients and ICU controls
指标 脓毒症组 脓毒症组 P
数量 575 579
年龄(岁) 64.1 ± 8.9 68.6 ± 7.8 0.150
性别(男/女) 351/224 362/217 0.605
APACHE Ⅱ评分 18.6 ± 4.6 10.2 ± 3.2 0.001
SOFA评分 8.2 ± 1.8 1.6 ± 0.4 0.002
住院时间(d) 18.6 ± 7.8 8.6 ± 2.3 0.001
病死率 204 (35.47%) 60 (10.36%) < 0.001
    糖尿病 61 (10.61%) 72 (12.43%) 72 (12.43%)
    慢性肝脏疾病 21 (3.65%) 13 (2.25%) 0.209
    慢性肾脏疾病 23 (4%) 38 (6.56)% 0.065
    慢性心力衰竭 36 (6.26%) 30 (5.18)% 0.430
    慢性呼吸衰竭 49 (8.52%) 60 (10.32)% 0.285
感染部位
    肺部 379 (65.91%) 366 (63.21%) 0.338
    腹部 144 (25.04%) 163 (28.21%) 0.208
血流 18 (3.13%) 12 (2.07%) 0.259
    泌尿系统 15 (2.61%) 26 (4.49%) 0.084
其他 19 (3.3%) 12 (2.07%) 0.196

GPR174基因SNP rs3827440等位基因和基因型频率在研究群体中符合哈代-温伯格平衡(P > 0.05)。研究发现rs3827440等位基因和基因型频率在脓毒症组和非脓毒症对照组差异具有统计学意义。脓毒症患者携带rs3827440等位基因T和TT基因型的频率明显高于非脓毒症对照组患者,无论在男性患者和女性患者中均差异有统计学意义(Plogistic = 0.0004; OR = 1.68, 95% CI 1.19 ~ 2.20),见表 2。结果提示,GPR174基因SNP rs3827440与脓毒症易感性有关。

表 2 rs3827440基因型/等位基因在脓毒症组和ICU对照组患者中的分布 Table 2 Genotypic frequencies of rs3827440 in septic patients and ICU controls
指标 脓毒症组(%) ICU对照组(%) P OR (95%CI)
TT/T CC/C TC TT/T TC CC/C
女性 90(41.3) 32(14.7) 95(44.0) 61 (29.0) 50(23.8) 99(47.1) 2.31(1.33~4.00)
男性 229(65.4) 121(34.6) 199(55.4) 160(44.6) 1.52(1.12~2.06)
整合 319(56.2) 153 27.0) 95(16.8) 260 (45.7) 210 (36.9) 99(17.4) 0.0004 1.68(1.19~2.20)
2.2 SNP与外周血炎症介质关联研究

rs3827440是非同义突变,可以导致编码氨基酸改变,Chu等[5]研究发现rs3827440变异引起健康个体外周血单个核细胞GPR174 mRNA表达的变化,为探讨GPR174基因变异对脓毒症发病的影响机制,进一步探讨rs3827440变异对脓毒症患者炎症介质表达的影响。收集116例脓毒症患者入院24 h内的血清,其中15例女性携带rs3827440 CC等位基因,28例女性患者携带TT基因型,25例男性患者携带C等位基因,48例男性患者携带T等位基因。携带rs3827440杂合子的女性患者被排除,以避免X染色体失活对基因表达的影响。研究结果发现,携带等位基因T男性和基因型TT女性患者,血清IL-6和TNF-α的浓度高于携带等位基因C和CC基因型的患者(IL-6: P = 0.019、P = 0.004;TNF-α:P = 0.019、P = 0.01)。携带等位基因T男性和基因型TT女性患者联合分析后,血清IL-6和TNF-α的浓度明显高于携带等位基因C和CC基因型的患者(IL-6:P = 0.00046;TNF-α:P = 0.001) (见图 1-a1-b);Logistic回归分析去除年龄、APACHE Ⅱ和SOFA评分等因素后,仍具有统计学意义(Padj = 0.0093, Padj = 0.016)。

图 1 脓毒症患者血清炎症介质IL-6和TNF-α浓度与rs3827440基因型相关 Fig 1 The association between IL-6, TNF-α levels and rs3827440 genotypes
2.3 Gpr174对CLP模型小鼠生存率和炎症介质表达的影响

利用Gpr174 KO和同窝出生的野生型小鼠,CLP方法制作脓毒症模型,探讨Gpr174对脓毒症小鼠炎症反应和生存率的影响。研究发现CLP造模成功后,Gpr174 KO小鼠脓毒症病死率明显下降,低于野生型小鼠(图 2),且体温和体质量恢复快于野生型小鼠。进一步检测炎症活化急性期细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平。结果发现,与野生型小鼠相比,Gpr174基因敲除小鼠存在炎症反应的峰值变化,促炎症细胞因子的水平明显降低(IL-1β、IL-6和TNFα),而参与拮抗炎症反应的IL-10水平高于野生型,差异有统计学意义(图 3)。

图 2 Gpr174对CLP小鼠生存率的影响 Fig 2 Effect of Gpr174 on the survival of rats with CLP-induced sepsis

a P < 0.01; b P < 0.05. 图 3 Gpr174对CLP小鼠血清中炎症介质和抗炎介质表达的影响 Fig 3 Ablation of Gpr174 alleviated the pro-inflammatory cytokines induced by CLP
3 讨论

本研究发现GPR174遗传变异与汉族人群脓毒症的遗传易感性显著相关。有关GPR174基因变异与疾病遗传易感性的关联研究报道较少,目前仅报道与Graves’病和自身免疫性Addison’s病有关[5-6]。既然GPR174基因遗传变异与脓毒症和自身免疫性相关疾病的遗传易感性有关,那么GPR174是否通过影响机体的免疫应答反应,其功能和作用机制如何。进一步研究发现,脓毒症患者早期,外周血清中炎症介质IL-6和TNF-α的浓度与rs3827440基因型具有一定的相关性,GPR174基因变异可能通过影响mRNA的表达调控炎症介质的生成,这与Chu等研究的结果一致[5]

免疫调节系统的失平衡在脓毒症的发病机制中起到重要的作用。机体在遭受到外源性和内源性的致病因素后,诱发免疫反应,以清除内源性和外源性的致病因素,适度的炎症反应的生成对机体起到保护作用。但如果免疫系统持续激活,引起过量炎症介质的持续合成和释放,诱发全身炎症反应综合征,导致多器官功能障碍[7-8]。GPRs是细胞内外信号转导的重要蛋白,当膜外的配体作用于GPRs后,受体的构象发生改变,启动下游的信号传递,调控T细胞和B细胞的分化、成熟和活化,参与免疫系统的调节[9-11]。GPR174基因位于人类X染色体长臂1区(Xq21.1),主要表达在免疫器官和细胞,强烈提示GPR174与免疫功能的相关性,目前关于GPR174功能的研究相对较少。

GPR174曾被认为是孤儿受体,溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)是GPR174的配体,体内外实验发现,LysoPS具有多种生物学功能,如介导肥大细胞脱颗粒,促进神经突触的生长,抑制T淋巴细胞的增殖,促进巨噬细胞清除凋亡细胞等[12]。在过表达Gpr174的CHO细胞株中,LysoPS通过Gαs蛋白,改变细胞的形态,抑制细胞的增殖,增加胞内ERK的磷酸化水平[9]。Gpr174可以负向调控Treg细胞的功能,在Gpr174敲除小鼠中,Treg细胞对Th1细胞的抑制作用增强,对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型起保护作用[9]。LysoPS可以抑制CD4+ T细胞产生IL-2,但不影响Gpr174敲除小鼠的CD4+ T细胞产生IL-2,上述2项研究提示,Gpr174在CD4+ T细胞分化和功能上的作用[11-12]。近期,本课题组研究发现Gpr174敲除小鼠Treg细胞的数量增加、抑制分子CTLA-4和IL-10表达增加,可以明显诱导巨噬细胞向M2极化,抑制巨噬细胞的活化,从而减轻炎症反应[13]。另外,Gpr174缺失导致成熟B细胞在LPS刺激后活化增强、向浆细胞的分化能力增强和抗体的分泌增加,有利于病原微生物的清除[14]。Zhao等[15]发现GPR174通过与CCL21等作用调节B细胞的聚集和T细胞的分化,从而发挥体液和细胞免疫作用,并具有性别差异。LysoPS其他受体(GPR34和P2Y10)也与免疫功能有关。有研究发现GPR34参与ERK的磷酸化,在神经免疫和细菌感染中发挥了免疫调控作用,LysoPS与P2Y10结合后,可能通过Gα12/13介导的信号通路抑制T细胞的增殖。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突

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