心力衰竭是高血压、缺血性心肌病和心瓣膜病等许多心血管疾病终末期的临床表现^[1]。随着人口老龄化，心力衰竭的发病率和病死率逐年上升。目前心力衰竭病理生理机制研究表明有多种分子，多种基因参与心力衰竭的发生发展。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在细胞应对缺氧反应时具有重要调节作用^[2]。常氧下，HIF-1α能够被脯氨酰羟化酶2(PHD2)羟基化^{[3, 4]}，这导致了HIF-1α降解加速。缺氧时，PHD2含量降低，这使得HIF-1α水解过程被抑制，进而在细胞中蓄积。蓄积的HIF-1α在核内可与HIF-1β形成二聚体，促进对减轻缺氧损伤的基因的转录，，包括血管生成、重塑，糖酵解和铁的转运，细胞增殖等^[5]。近年来，许多研究都表现出PHD2/HIF-1α通路在心血管疾病中的重要作用，但是，PHD2/HIF-1α通路是否参与心肌梗死后心衰的发生，以及β-AR是否参与对该通路的调节目前仍不清楚。因此，本研究使用制备的心梗后心衰模型，探讨β-AR调控PHD2/HIF-1α与心梗后心衰发生的关系，从而在心肌梗死后心衰发生的临床预防与治疗方面提供新的方向。

兔抗PHD2(DF6285)、兔抗HIF-1α(AF1009)、β-actin(AF7018)为中国Affinity公司; 酶标仪、HRP标记二抗、ECL试剂盒为中国biosharp公司; 化学发光成像仪为中国Tanon公司; Trizo、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自中国TIANGEN公司; 引物购自中国RIBOBIO公司)，超微量蛋白核酸测定仪为中国Thermo Fisher公司。

成年雄性SD大鼠，体质量约200 g。术前禁食后，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉(用量为0.3 ml/100 g)，固定大鼠四肢并行气管插管，于胸骨左缘三、四肋间消毒、逐层打开胸腔，找到心脏并打开心包膜，结扎冠脉左前降支起始处，逐层缝合胸腔并抽出其中气体，待大鼠清醒并反应良好后放回房笼中继续饲养。手术前后有心电图评估心肌缺血情况。

取雄性SD大鼠15只，分别随机(随机数字法)分为3个组，每组5只。假手术组(sham组)：只打开胸腔不结扎冠脉+常规喂养，模型组(model组)：结扎冠脉+常规喂养，普萘洛尔组(Propranolol组)：结扎冠脉+常规喂养。四周后，常规喂养的同时，Propranolol组给与普萘洛尔[6 mg/(kg·d)]进行灌胃，其余两组予以同等剂量生理盐水灌胃。灌胃时间为8周，通过超声心动图监测心脏射血分数(EF值)评估心功能。而后处死大鼠并取出心脏，用于后续实验。本研究中使用的所有动物实验方案均已获得皖南医学院弋矶山医院伦理委员会批准，并符合活体动物使用指南。

各组取心肌组织剪碎、裂解，提取蛋白后BCA法检测浓度。调整好加样量行凝胶电泳，NC膜转膜后剪取目的条带，BSA室温封闭2 h，将条带分别放入对应一抗(兔抗PHD2、兔抗HIF-1α、兔抗β-actin)内，4℃冰箱内摇床孵育14 h，洗膜(40 min)后室温孵育二抗(抗兔)1 h，再次洗膜(50 min)后用ECL法进行显影，imageJ软件测量各组蛋白条带的灰度值，然后进行统计学分析。

各组取50mg心肌组织剪碎，逐步加入试剂提取总RNA，检测总RNA的浓度及纯度，在gDNA去除以及反转录体系中两步法合成cDNA模板，按说明书配制荧光定量预混试剂，以GAPDH为内参，在核酸定量检测系统中扩增目的基因，导出数据，计算2^-ΔΔCT值。引物序列：HIF-1α Forward 5’-GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3’, Reverse 5’-TTCTGTTT-GTTGAAGGGAG-3’; PHD2 Ferward 5’-CAGTCCGTCCGTCTGGC-3’, Reverse 5’-CCTCCCCAGATGCTCCTGAA-3’; GAPDH Forward 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’, Reverse 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’.

以SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差(Mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

心电图结果显示：同结扎前比较，冠状动脉结扎后的心电图ST段明显抬高，表示结扎后发生了心肌梗死(图 1)。手术后12周，通过心脏超声心动图结果可以看出：model组EF值(61.10±2.78)%比sham组EF值(79.45±2.86)%明显降低(P＜0.05，图 2);而Propranolol处理后EF值(67.33±2.66)%对比model组则明显上升(P＜0.05，图 2)。

A:手术前心电图示ST段正常; B:手术后心电图示ST段明显抬高 图 1 心电图显示心肌缺血情况 Fig 1 ECG show myocardial ischemia

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A：sham组超声心动图。B：model组超声心动图。C：Propranolol组超声心动图。D：各组心脏EF值差异。与sham组比较aP＜0.05;与model组比较bP＜0.05 图 2 超声心动图评价心功能 Fig 2 Echocardiographic evaluation of cardiac function

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结果表明(图 3)：与sham组相比，model组PHD2在mRNA水平上表达量明显下降(P＜0.05)，同时细胞内PHD2蛋白的含量也显著减少(P＜0.05)。而用Propranolol处理后，PHD2在mRNA和蛋白水平上的表达较model组有所上升(P＜0.05)。

A：qPCR检测PHD2 mRNA表达量的改变。B：WesternBlot检测PHD2蛋白表达量的改变。与sham组比较aP＜0.05;与model组比较bP＜0.05 图 3 PHD2的mRNA及蛋白表达 Fig 3 The mRNA and protein expression of PHD2

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心肌梗死后心衰发生时(图 4)，HIF-1α的mRNA以及蛋白的表达量较sham组显著上升，(P＜0.05);用Propranolol处理后，与model组相比HIF-1α的mRNA和蛋白含量则变低(P＜0.05)。

A：qPCR检测HIF-1α mRNA表达量的改变。B：WesternBlot检测HIF-1α蛋白表达量的改变。与sham组比较aP＜0.05;与model组比较bP＜0.05 图 4 HIF-1α的mRNA及蛋白表达 Fig 4 The mRNA and protein expression of HIF-1α

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心肌梗死发生12周后，大鼠左心室功能(EF值)明显减退，随着心输出量的减少，包括心肌细胞在内的体内细胞都会处于缺氧状态。有研究表明^[7]，HIF-1α可以调节细胞内与转录有关的基因，在心肌梗死等心肌缺血缺氧性疾病中作用显著。在缺氧背景下，HIF-1α可以促进包括血管生成在内的有关的基因的表达，从而参与了由缺氧所引起的血管再生的整个过程^[8]。例如，通过使VEGF表达上调，进而导致了血管内皮细胞的增值和迁移，并能够促进血管间的相互吻合从而导致血管网的生成^[9]。有研究证实^{[7, 10]}，在心肌发生缺血缺氧时，心肌细胞内的HIF-1α由于分解受到抑制而在细胞内蓄积。而在本研究中，心肌梗死后心衰发生时HIF-1α的含量显著上升，也证实了上述结果。

PHD作为参与低氧应激的因子，在心血管疾病中同样具有重要作用。PHD的短时间抑制能够使IL-10、SDF-1、2-酮戊二酸等的含量增加^[11]，从而引起血管的再生，增加心脏血供^[12];改善心肌供能^[13]。PHD四种亚基中以PHD2作用最为重要。而PHD2的诸多作用可能与其参与调节HIF-1α的分解有关。Marti和Kunze^[14]提出，HIF-1α的稳定性增强与PHD2活性的降低有很大关系，这导致与糖酵解有关的酶的活性增加，进而提高了神经元在缺血条件下的耐受性。有研究显示^[15]，敲除PHD2使TR-α与NCOR2相互作用加强，引起PLN基因的转录被抑制，PLN表达的降低能够引起CaMKⅡ持续激活，并最终导致心功能不全。这与长期β肾上腺受体激活引起的心力衰竭^[16]，有着类似的作用。本实验发现，在心肌梗死后心衰发生过程中，心肌细胞内PHD2的含量明显降低。然而，在使用β-AR阻滞剂普萘洛尔干预后，PHD2的含量上升，并且受损的心功能也有所改善。这表明PHD2/HIF-1α通路参与心肌梗死后心衰发生，同时β-AR对该通路具有重要的调节作用。