2020, Vol. 29
2 武汉市普仁医院神经内科，武汉 430080;
3 武汉大学中南医院重症医学科，武汉 430071;
4 解放军总医院第四医学中心创伤研究中心，北京 100048
2 Neurology Department, Wuhan Puren Hospital, Hubei 430080, China;
3 Department of Critical Medicine, Central South Hospital of Wuhan University, Hubei 430071, China;
4 Trauma Research Center, Fourth Medical Center of the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
脓毒症最新的定义是机体对感染反应失调所致危及生命的器官功能障碍，是目前急危重症医学领域面临的重要临床问题[1]。脓毒症因其预后差、治疗费用高以及医疗资源消耗大等问题，已经成为人类健康的重要危害之一[2]。调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）是一类具有免疫负向调控作用的T淋巴细胞亚群，在维持机体免疫反应平衡中具有重要地位，是脓毒症细胞免疫抑制的重要影响因素[3]。白细胞介素（interleukin, IL）-37是IL-1家族的成员，研究发现其可以下调天然免疫和获得性免疫应答，在多种炎症疾病中发挥抗炎作用[4]。沉默人外周血Treg中IL-37表达明显下调Treg的免疫抑制效应[5]，但其具体作用机制尚不清楚。本研究以IL-37为研究对象，观察脓毒症状态下IL-37对Treg免疫功能的影响及机制，为明确IL-37能否作为脓毒症的一个潜在治疗靶标提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，6~8周，体质量22~24 g（北京华阜康生物科技有限公司，中国）。别藻蓝蛋白（allophycocyanin, APC）标记的抗小鼠细胞毒性T细胞相关抗原（cytotoxic T cell-associated antigen, CTLA）4抗体、藻红蛋白/青色素染料7（phycoerythrin/Cy7 tandem conjugates, PE-Cy7）标记的抗小鼠叉头翼状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor p3, Foxp3）抗体购自美国eBioscience公司；小鼠调节性T细胞磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司；小鼠IL-10和转化生长因子（transforming growth factor, TGF）-β ELISA检测试剂盒购自中国吉泰生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）购自美国Sigma公司；自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ、Beclin1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；雷帕霉素（Rapamycin, Rap）、3-Methyladenine（3-MA）均购自美国Selleck公司。
1.2 小鼠脾脏细胞分离与Treg分离与鉴定脱颈处死小鼠后取脾，研磨制成脾脏细胞悬液，按比例加至淋巴细胞分离液上，密度梯度离心后收集单个核细胞，按照说明书分离提纯脾脏Treg。Treg纯度鉴定：细胞标记CD4+和CD25+后采用流式细胞术检测其纯度（本实验所提取Treg纯度在97%左右）。
1.3 流式细胞仪检测Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达收集各组细胞离心定量，每管加入2.5 μl APC标记的CTLA-4抗体，4℃避光孵育30 min。每管加入500 μl破膜剂，避光过夜。加入1 mL破膜缓冲液离心后弃上清液，重悬后加入2.5 μl PE-Cy7标记的Foxp3抗体，避光孵育30 min，PBS洗涤离心后弃上清液，定量200 μl，上机检测。
1.4 ELISA法检测细胞因子分泌水平收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒附带说明书步骤检测细胞培养上清液中TGF-β、IL-10含量。
1.5 透射电镜观察自噬小体的形成及数目收集Treg，2.5%戊二醛4℃固定48 h，制作电镜标本，上机观察细胞自噬小体形成及数目。
1.6 Western blot检测自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ及Beclin1表达收集细胞后，PBS洗涤细胞2次，采用RIPA细胞裂解液提取蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，配制12%分离胶和4%浓缩胶，上样、电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭4 h，分别加入LC3I/Ⅱ和Beclin1抗体（1：1 000），4℃孵育过夜，洗涤后羊抗兔二抗室温孵育2 h，ECL化学发光显影，曝光成像。
1.7 脓毒症小鼠模型制作采用盲肠结扎穿孔术（CLP）构建小鼠脓毒症模型。术前小鼠禁食12 h，5%水合氯醛麻醉后仰卧位固定，碘伏消毒腹部皮肤，开腹暴露盲肠，结扎1/2长度盲肠，使用针头于盲肠结扎段1/2处贯穿盲肠一次，并挤出少许肠内容物，关腹后皮下注射1 mL生理盐水进行补液。假伤组小鼠仅开腹暴露盲肠后缝合。
1.8 统计学方法采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 脓毒症时IL-37对Treg功能的影响与正常对照（Normal）组比较，LPS刺激Treg细胞48 h和72 h，其Foxp3和CTLA-4表达均明显上调（P＜0.05）。LPS协同IL-37刺激Treg后，Foxp3和CTLA-4表达较同时间点LPS组显著增加（P＜0.01），表明LPS刺激下Treg功能增强，而协同IL-37作用能进一步促进Treg负性调节作用（表 1和表 2）。
| 组别 | 24 h | 48 h | 72 h | F值 | P值 |
| Normal组 | 1958±47 | 1879±81 | 1902±103a | 1.508 | 0.253 |
| LPS组 | 1726±51 | 2269±74 | 2581±40b | 345.43 | ＜0.01 |
| IL-37组 | 2137±38 | 2164±29 | 2171±43 | 1.396 | 0.278 |
| LPS+IL-37组 | 2648±34 | 2806±31 | 3005±33 | 185.919 | ＜0.01 |
| F值 | 491.484 | 258.431 | 366.989 | ||
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ||
| 注：72 h IL-37组与Normal组比较, aP＜0.01；72 h LPS+IL-37组与LPS组比较, bP＜0.01 | |||||
| 组别 | 24 h | 48 h | 72 h | F值 | P值 |
| Normal组 | 1135±73 | 1142±53 | 1025±34a | 8.385 | ＜0.01 |
| LPS组 | 1264±38 | 1394±61 | 1478±43b | 29.822 | ＜0.01 |
| IL-37组 | 1346±39 | 1193±59 | 1335±70 | 13.151 | ＜0.01 |
| LPS+IL-37组 | 1421±47 | 1497±102 | 1743±131 | 17.242 | ＜0.01 |
| F值 | 34.081 | 32.828 | 86.135 | ||
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ||
| 注：72 h IL-37组与Normal组比较, aP＜0.01；72 h LPS+IL-37组与LPS组比较, bP＜0.01 | |||||
IL-37刺激体外培养Treg（100 ng/mL，24 h），检测Treg中自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达发现，LPS刺激下Treg自噬活性明显增强（P＜0.01）；与Normal组比较，IL-37刺激后Treg内自噬活性增加（P＜0.05，图 1）。透射电镜结果显示：IL-37刺激Treg后自噬小体的形成明显增多，表明IL-37可以上调Treg内自噬活性（图 2）。
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| A：LC3I/Ⅱ和Beclin1蛋白条带；B：LC3I/Ⅱ和Beclin1表达统计结果。LC3I/Ⅱ蛋白：LPS组与Normal组比较, bP＜0.01；IL-37组与Normal组比较, aP＜0.05；Beclin1蛋白：LPS组与Normal组比较, bP＜0.01；IL-37组与Normal组比较, bP＜0.01 图 1 Western blot检测Treg自噬相关蛋白表达 Fig 1 Expressions of autophagy-associated proteins in Treg by Western blot |
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| 图 2 透射电镜观察Treg中自噬小体形成 Fig 2 Formation of autophagosomes in Treg under transmission electron microscopy |
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本组实验中，在LPS协同IL-37刺激72 h后Treg功能改变最明显时，予以3-MA和雷帕霉素调节自噬活性。与LPS+IL-37组比较，给予3-MA刺激Treg后（5 mmoL，24 h）Foxp3和CTLA-4表达均明显下调（P＜0.01）；而给予雷帕霉素（30 μmmoL，24 h）处理后，Foxp3和CTLA-4表达较LPS+IL-37组出现不同程度地增强（P＜0.01），提示自噬参与了脓毒症时IL-37调节Treg免疫功能的过程（表 3）。
| 组别 | Foxp3 | CTLA-4 |
| Normal组 | 1902±81 | 1156±53 |
| LPS组 | 2719±57 | 1527±105 |
| IL-37组 | 2534±93 | 1305±80 |
| IL-37+LPS组 | 2891±114ab | 1861±121cd |
| LPS+3-MA+IL-37组 | 1762±31 | 1049±65 |
| LPS+3MA组 | 1685±96 | 1038±73 |
| LPS+雷帕霉素+IL-37组 | 3124±131 | 2109±89 |
| LPS+雷帕霉素组 | 2937±67 | 2148±96 |
| F值 | 250.888 | 166.275 |
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| 注：Foxp3: LPS+3-MA+IL-37组和LPS+IL-37组比较, aP＜0.01；LPS+雷帕霉素+IL-37组和LPS+IL-37组比较, bP＜0.01；CTLA-4：LPS+3-MA+IL-37组和LPS+IL-37组比较, cP＜0.01；LPS+雷帕霉素+IL-37组和LPS+IL-37组比较, dP＜0.01 | ||
在LPS暴露下予以IL-37刺激Treg，发现Treg培养上清液中TGF-β1分泌水平显著增加（P＜0.05），而3-MA+LPS+IL-37组TGF-β1水平较LPS+IL-37组明显下降（P＜0.01），与LPS+IL-37组比较，雷帕霉素+LPS+IL-37组TGF-β1表达明显升高（P＜0.01，图 3A）。与LPS+IL-37组比较，仅3-MA+LPS+IL-37组IL-10水平出现下降（P＜0.05），而雷帕霉素+LPS+IL-37组IL-10分泌水平与LPS+IL-37组比较并差异无统计学意义（P > 0.05），表明IL-37以自噬依赖的途径调节Treg分泌功能（图 3B）。
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A：各组Treg培养上清液中TGF-β1水平改变；B：各组Treg培养上清液中IL-10表达情况 TGF-β1：LPS+IL-37组与LPS组比较, aP＜0.05；3-MA+IL-37+LPS组与IL-37+LPS组比较, bP＜0.01；雷帕霉素+IL-37+LPS与IL-37+LPS组比较, bP＜0.01；IL-10：3-MA+IL-37+LPS组与IL-37+LPS组比较, aP＜0.05 图 3 IL-37对Treg中IL-10及TGF-β1分泌量的影响 Fig 3 Effect of IL-37 on IL-10 and TGF-β1 levels in Treg |
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分别在盲肠结扎穿孔术前2 h、术中、术后2 h予以小鼠腹腔注射IL-37（1 μg/只），每组20只小鼠，术后连续观察并记录小鼠8 d存活情况。结果显示：假伤组小鼠8 d生存率100%，脓毒症组小鼠生存率25%，予以IL-37后脓毒症小鼠生存率明显改善：术前2 h给药组生存率60%、术中给药组生存率50%、术后给药组生存率45%，其中术前2 h给药组脓毒症小鼠存活率改善最为明显（P＜0.01），提示IL-37预处理对脓毒症小鼠具有保护作用。
3 讨论IL-37是IL-1家族新成员，其在肿瘤、自身免疫性疾病以及感染性疾病中具有明显的免疫抑制和抗炎效应[6]，然而，IL-37在脓毒症病理过程中的可能免疫效应和作用机制尚不清楚。本研究发现，腹腔注射IL-37可以对脓毒症小鼠发挥保护作用，提高动物生存率。在LPS暴露下，IL-37能通过增加Foxp3和CTLA-4表达以及促进TGF-β分泌的方式增强Treg免疫负性调节功能。此外，IL-37刺激导致Treg的细胞内自噬小体形成显著增加，其自噬活性明显增强，提示自噬通路参与了IL-37调节Treg免疫功能的过程。在脓毒症状态下，Treg发挥了至关重要的作用，有研究证实Treg缺陷动物会导致脓毒症时IL-6表达水平明显增高及死亡率显著[7]，表明Treg在维持机体免疫反应平衡中具有重要地位，而IL-37能通过影响Treg免疫功能，有望成为改善脓毒症生存及预后的潜在治疗途径。
在肝肿瘤细胞中观察到IL-37可以诱导自噬发生，进而改变肿瘤细胞生存状态[8]。自噬是真核生物一种普遍存在的自我保护机制，目前认为它是维持细胞内稳态平衡、减轻细胞损伤和死亡的重要内源性保护机制，在脓毒症的免疫反应中发挥重要调节作用[9]。IL-37刺激Treg后，细胞自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ和Beclin1的表达均出现明显上升，LC3I/Ⅱ是自噬标志性蛋白，而Beclin1则是经典自噬途径的关键蛋白之一，提示IL-37激活Treg自噬可能是通过经典的自噬通路。据报道，IL-37可以抑制肺成纤维细胞mTOR表达[10]，mTOR是PI3K/AKT信号转导的下游信号分子，可抑制自噬的发生，表明IL-37不仅可以作用自噬本身的关键蛋白，还能参与自噬上游PI3K/AKT-mTOR信号通路的调节，进而影响自噬活性。本组资料中，应用自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素处理Treg后发现，3-MA能逆转IL-37对Treg功能活性的促进作用，而雷帕霉素则进一步增强IL-37对Treg功能的影响。业已明确，自噬和凋亡之间存在明显的相关性，在多数情况下，适当自噬可以拮抗凋亡的发生[9]。LPS暴露下后期Treg自身状态较差，细胞大量死亡，而IL-37可以增加Treg自噬活性，改善Treg的细胞内稳态，抵抗凋亡发生，提示IL-37可能对脓毒症具有明显的保护效用。
前期研究证实，脓毒症患者外周血中IL-37表达显著上调[5]。本研究进一步证实IL-37对脓毒症小鼠起到明显保护作用，主要与其增强Treg免疫抑制功能，进而限制脓毒症早期过度炎症反应密切相关。目前IL-37的临床应用尚处于起步阶段，在炎症性疾病中，IL-37与疾病发展呈负相关，例如在慢性肝炎患者中，IL-37的表达增加会加重肝脏损伤，而给予治疗改善肝脏损伤后，外周血IL-37含量明显降低。本研究显示，IL-37可通过经典的自噬途径调节Treg免疫活性，表明自噬是IL-37调节Treg功能的重要细胞内机制。临床广泛应用于治疗结核杆菌感染的药物大多都具有一定的自噬调节效应，例如异烟肼和吡嗪酰胺均可促进自噬的活性。下一步研究需深入探讨自噬在IL-37调节Treg免疫功能的确切分子机制，为IL-37在脓毒症治疗的应用以及精准治疗的实现提供理论依据。
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