2 浙江大学急救医学研究所, 杭州 310009;
3 浙江省温岭市第一人民医院急诊科 317500;
4 浙江省宁波大学医学院附属余姚市人民医院急诊科 315400
2 Institute of Emergency Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China;
3 Department of Emergency Medicine, the First People's Hospital of Wenling, Wenling 317500, China;
4 Department of Emergency Medicine, Yuyao People's Hospital, Medical School of Ningbo University, Yuyao 315400, China
复苏后心功能障碍可表现为低心排出量综合征、恶性心律失常与再发室颤等, 已是心脏骤停(cardiac arrest, CA)患者复苏后早期死亡的首要原因[1-2]。亚低温(therapeutic hypothermia, TH)是心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)指南推荐的器官保护方法, 已被证实能减轻复苏后心肌损伤、功能障碍及减少心律失常事件[3-4]。但TH产生复苏后心肌保护的机制及优化其保护效应的途径, 有待探讨。研究显示, 钙调蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ)作为多种心脏疾病防治的重要靶点, 同样参与复苏后心功能障碍的发生[5-6]。自噬作为细胞死亡调控的重要方式之一, 已有研究认为参与复苏后心肌损伤的过程[7]。本研究拟利用猪CPR模型探讨TH对复苏后心肌CaMKⅡ与自噬水平的影响, 为明确TH保护机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物来源及分组国产雄性白猪20头, 体质量33~40 kg, 购自上海甲干生物科技有限公司[合格证号SCXK(沪)2015-0005]。本研究动物实验流程符合实验动物福利和伦理要求。采用随机数字表法分为如下三组:假手术(sham, S)组(n=4)、CPR组(n=8)与TH组(n=8)。S组仅进行动物准备, CPR组和TH组制备猪CPR模型。复苏成功后, TH组经体表冰毯将体温降至33 ℃并维持至复苏后24 h, 再以1 ℃/h复温5 h; S组和CPR组利用冰毯维持37.5~38.5 ℃正常体温。
1.2 主要仪器设备和实验试剂主要仪器设备:SynoVent E5呼吸机和BeneView T6监护仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司), E Series除颤监护仪(美国ZOLL公司), Blanketrol Ⅲ冰毯仪(美国CSZ公司), PiCCO容量监测仪(德国PULSION公司), Swan-Ganz导管(美国EDWARDS公司), ETCO2/SPO2监测仪(上海三埃弗公司), 长直喉镜(美国Welch Allyn公司), 全自动血气分析仪(美国Instrumentation Laboratory公司), 全自动生化分析仪(美国Beckman公司)。
实验试剂:2 mL:0.1 g盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司), 25 g戊巴比妥钠粉剂(美国Merck公司), 2 mL:0.1 mg枸橼酸芬太尼注射液(宜昌人福医药有限公司), 心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I, cTnI)ELISA试剂盒(上海美轩生物科技有限公司), CaMKⅡ、自噬标志蛋白微管相关轻链蛋白3Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)与p62一抗工作液(美国Abcam公司)。
1.3 动物准备实验前动物禁食12 h。实验时氯胺酮20 mg/kg肌注诱导麻醉, 再经耳缘静脉注射戊巴比妥钠30 mg/kg全身麻醉, 继以戊巴比妥钠8 mg/(kg·h)与芬太尼2 μg/(kg·h)静脉泵入维持麻醉。长直喉镜辅助气管插管, 连接ETCO2/SPO2监测仪与呼吸机, 后者参数为潮气量12 mL/kg、峰流速40 L/min和FiO2 21%, 并调节呼吸频率维持呼气末二氧化碳分压(PETCO2)范围在35~40 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)。肢体Ⅱ导联心电图与脉氧饱和度监测。手术暴露右股动静脉, 植入Swan-Ganz导管监测胸主动脉血压、右心房压、核心温度及采集血标本。手术暴露左股动脉与右颈内静脉, 植入PiCCO监测仪动静脉端导管, 用于评估心功能状态。手术暴露右颈外静脉, 置入诱颤电极, 用于诱导室颤。
1.4 实验模型经右心室电极释放1 mA交流电诱导室颤, 成功标准为室颤心律伴动脉压显著下降、搏动波消失。然后停止机械通气, 无干预观察8 min。再进行30:2人工胸外按压和球囊辅助通气, 应用除颤监护仪反馈CPR质量、以确保按压深度5~6 cm与频率100~120次/min。复苏2.5 min时, 注射肾上腺素20 μg/kg, 此后每3 min重复1次。复苏5 min时, 予以150 J双向波电除颤1次, 判断自主循环情况, 其恢复标准为室上性自主心律伴平均动脉压>50 mmHg持续5 min以上[8]。若自主循环未恢复, 重启CPR 2 min后电除颤1次。重复该流程至复苏成功或重复5次后仍未恢复自主循环, 视为复苏失败。所有恢复的动物继续行机械通气并监测至复苏后30 h。
1.5 观察指标动态监测血流动力学、PETCO2、体温的变化。记录CPR期间的冠脉灌注压及最终的复苏成功率、复苏时间、除颤次数、肾上腺素用量等情况。于CA前及复苏后6、12、24和30 h时, 利用PiCCO监测仪测定每搏输出量(stroke volume, SV)和全心射血分数(global ejection fraction, GEF)的变化。同时采集血标本, 应用全自动血气分析仪检测动脉血气分析, ELISA法检测血清cTnI浓度, 全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB, CK-MB)活性。于复苏后30 h时, 动物实施安乐死, 获取左室心尖心肌组织, 应用Western blot法检测CaMKⅡ、LC3Ⅱ和p62的表达水平, 步骤如下:⑴取100 mg心肌组织加入到组织裂解液中裂解, 在4℃、10 000 g条件下离心10 min, 吸取上清液测蛋白浓度; ⑵取等量蛋白质进行SDS-PAGE蛋白电泳, 转移至PVDF膜上, 置于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h, 加入CaMKⅡ一抗(1:500)、LC3Ⅱ一抗(1:1 000)及p62一抗(1:1 000)在4℃冰箱中孵育过夜, 再用山羊抗兔二抗室温孵育1 h; ⑶以GAPDH为内参, 在ECL下显影后拍照, 采用Image J软件测蛋白条带灰度值, 以目的蛋白与GAPDH的灰度比值反映目的蛋白的表达水平。
1.6 统计学方法使用SPSS 18.0进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示, 两组间比较采用LSD-t检验, 三组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni事后检验。计数资料比较采用Fisher精确检验法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组动物的一般情况三组动物的体质量、PETCO2、心率、血压、血乳酸、体温等基线特征, 组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表 1。
组别 | 体质量(kg) | PETCO2(mmHg) | 心率(次/min) | 平均动脉压(mm Hg) | 乳酸(mmol/L) | 体温(℃) |
S组 | 35.0±1.6 | 39.0±1.2 | 106±3 | 120±9 | 1.2±0.8 | 38.0±0.4 |
CPR组 | 36.1±1.9 | 40.1±2.9 | 109±11 | 119±13 | 1.2±0.4 | 38.0±0.3 |
TH组 | 35.5±2.4 | 38.6±2.6 | 105±9 | 115±13 | 1.3±0.4 | 37.8±0.2 |
F值 | 0.429 | 0.702 | 0.317 | 0.358 | 0.146 | 0.891 |
P值 | 0.658 | 0.511 | 0.733 | 0.704 | 0.865 | 0.431 |
注:PETCO2, 呼气末二氧化碳分压; S, 假手术组; CPR, 心肺复苏; TH, 治疗性亚低温 |
CPR组与TH组在CPR期间, 冠脉灌注压呈先上升、后下降的变化趋势, 组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。两组动物均复苏成功7头, 组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。两组动物的复苏时间、除颤次数和肾上腺素用量等指标, 组间比较差异亦无统计学意义(均P>0.05)。见表 2。
组别 | 冠脉灌注压(mmHg) | 复苏成功率 | 复苏时间(min) | 除颤次数 | 肾上腺素用量(mg) | ||||
1 min | 2 min | 3 min | 4 min | 5 min | |||||
CPR组 | 17.1±3.1 | 21.4±2.9 | 27.5±2.8 | 36.8±3.7 | 25.4±3.0 | 7/8 | 6.8±3.5 | 1.8±1.4 | 1.35±1.02 |
TH组 | 17.5±2.7 | 21.6±2.4 | 28.5±4.9 | 38.3±4.5 | 26.9±6.2 | 7/8 | 6.3±3.5 | 1.5±1.4 | 1.05±0.99 |
t值 | 0.260 | 0.187 | 0.500 | 0.729 | 0.612 | — | -0.286 | -0.357 | -0.585 |
P值 | 0.799 | 0.854 | 0.625 | 0.478 | 0.551 | 1.000 | 0.779 | 0.727 | 0.568 |
注:CPR, 心肺复苏; TH, 治疗性亚低温 |
与S组相比, CPR组和TH组复苏后出现心功能障碍与心肌损伤, 表现为SV和GEF值明显降低、血清cTnI浓度和CK-MB活性显著增加, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。与CPR组相比, TH组在复苏6 h后SV和GEF值明显升高、在复苏后12 h后血清cTnI浓度和CK-MB活性显著减少, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表 3~4。
组别 | SV(mL) | GEF(%) | |||||||||
BL | PR 6 h | PR 12 h | PR 24 h | PR 30 h | BL | PR 6 h | PR 12 h | PR 24 h | PR 30 h | ||
S组 | 48.8±1.9 | 47.5±2.1 | 49.3±1.3 | 46.5±3.7 | 46.5±4.7 | 31.3±1.3 | 30.3±2.2 | 29.5±1.7 | 29.5±1.3 | 29.8±2.8 | |
CPR组 | 47.9±7.8 | 25.0±6.9a | 26.7±5.1a | 28.8±3.3a | 29.2±5.2a | 29.9±3.8 | 17.1±2.7a | 18.7±1.9a | 19.3±2.3a | 21.0±1.7a | |
TH组 | 48.7±5.2 | 31.9±3.3ab | 34.6±3.7ab | 35.7±3.2ab | 36.7±3.3ab | 31.9±2.4 | 19.9±1.8ab | 21.6±1.8ab | 23.0±2.4ab | 23.7±1.7ab | |
F值 | 0.046 | 26.571 | 39.149 | 33.094 | 18.692 | 0.859 | 43.521 | 44.095 | 26.247 | 28.090 | |
P值 | 0.955 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.444 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
注:SV, 每搏输出量; GEF, 全心射血分数; BL, 基线值; PR, 复苏后; S组, 假手术组; CPR组, 心肺复苏组; TH组, 治疗性亚低温组。与S组比较, aP<0.05;与CPR组比较, bP<0.05 |
组别 | cTnI(pg/mL) | CK-MB(U/L) | |||||||||
BL | PR 6 h | PR 12 h | PR 24 h | PR 30 h | BL | PR 6 h | PR 12 h | PR 24 h | PR 30 h | ||
S组 | 165±22 | 212±45 | 216±26 | 207±41 | 209±39 | 216±23 | 231±44 | 227±31 | 227±39 | 231±24 | |
CPR组 | 160±14 | 605±50a | 564±51a | 534±38a | 476±55a | 215±49 | 909±248a | 803±164a | 693±96a | 633±91a | |
TH组 | 171±9 | 555±42a | 466±56ab | 427±60ab | 375±46ab | 225±49 | 760±153a | 652±76ab | 557±54ab | 480±77ab | |
F值 | 0.960 | 102.236 | 63.796 | 53.429 | 37.164 | 0.105 | 17.618 | 32.404 | 54.696 | 34.716 | |
P值 | 0.405 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.901 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
注:cTnI, 心肌肌钙蛋白; CK-MB, 肌酸激酶同工酶; BL, 基线值; PR, 复苏后; S组, 假手术组; CPR组, 心肺复苏组; TH组, 治疗性亚低温组。与S组比较, aP<0.05;与CPR组比较, bP<0.05 |
与S组相比, CPR组和TH组复苏后心肌CaMKⅡ和自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达明显增加、p62表达明显减少, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。与CPR组相比, TH组复苏后心肌CaMKⅡ和自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达明显减少、p62表达明显增加, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表 5。
组别 | CaMK Ⅱ | LC3 Ⅱ | p62 |
S组 | 0.39±0.05 | 0.35±0.07 | 0.86±0.08 |
CPR组 | 0.73±0.06a | 0.69±0.09a | 0.40±0.07a |
TH组 | 0.58±0.05ab | 0.50±0.07ab | 0.68±0.14ab |
F值 | 49.391 | 23.671 | 27.971 |
P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注:CaMK Ⅱ, 钙调蛋白激酶Ⅱ; LC3 Ⅱ, 微管相关轻链蛋白3 Ⅱ; S组, 假手术组; CPR组, 心肺复苏组; TH组, 治疗性亚低温组。与S组比较, aP<0.05;与CPR组比较, bP<0.05 |
自2002年《新英格兰医学杂志》上发表的两项临床研究表明, TH能改善CA患者的神经功能预后与存活[9-10]。随后, 系列研究证实TH对CA复苏后的多器官功能障碍均具有保护作用, 其临床应用已在CPR指南中得到明确推荐[11]。在心肌保护方面, Lu等[3]在大鼠CPR模型中发现TH既能改善复苏后心功能状态, 还能减轻心肌损伤。Piktel等[4]利用犬CPR模型研究发现TH能改善心电信号传导、复极异常而降低心律失常事件。Meybohm等[12]利用猪CPR模型还发现TH能降低复苏后心肌炎症细胞浸润与促炎介质表达、减轻心肌细胞凋亡等。Lee等[13]同样制作猪CPR模型发现TH减轻复苏后心肌细胞凋亡的机制可能与增加生存素表达、减少XAF1与caspase-3表达等有关。本研究试图探讨CA复苏后TH心肌保护的新机制, 首先建立猪CPR模型, 发现与CPR组相比, TH明显提高复苏6 h后SV和GEF值, 显著降低复苏12 h后cTnI和CK-MB血清水平, 这提示该模型成功地再现了复苏后TH的心肌保护作用。
钙/钙调蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族, 包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型, 是细胞内钙的重要生理靶点与调节细胞内钙稳态的关键信号。研究证实, CaMKⅡ在心脏中含量最多, 参与心肌缺血-再灌注损伤、心律失常及心力衰竭等多种心脏疾病的信号转导过程, 是防治心血管疾病的潜在重要靶点[5]。在缺血-再灌注方面, Ling等[14]利用小鼠模型发现CaMKⅡ激活后促进核转录因子-κB(NF-κB)表达增加, 加强心肌组织炎症反应与细胞凋亡, 最终导致心肌梗死面积增大及功能障碍。Singh等[15]同样制作小鼠心肌缺血-再灌注损伤模型, 发现CaMKⅡ还能通过增加补体因子B表达而促进心肌梗死后不良事件的发生。在CPR领域, Woods等[6]研究报道CA复苏能激活CaMKⅡ信号, 应用药物抑制CaMKⅡ活性能减轻复苏后心功能障碍。本研究结果显示, 与S组比较, CPR组和TH组在CA复苏后观察到心功能障碍的同时检测到心肌CaMKⅡ表达上调, 提示复苏后心功能障碍的发生可能与CaMKⅡ活化有关。在进行TH干预后, 发现复苏后心功能障碍的改善伴有心肌CaMKⅡ的表达下调, 因而提示复苏后TH的心肌保护作用可能与抑制CaMKⅡ激活有关。
通常, 适度自噬是促细胞存活的程序, 能吞噬降解损伤的细胞内组分, 为细胞提供代谢底物和能量, 以帮助细胞度过压力应激和能量匮乏状态。然而, 特定条件所致的自噬不足或过度, 将主动降解细胞存活必需成分或者非选择性降解细胞组分而导致细胞程序性死亡[16-17]。在小鼠心肌缺血-再灌注损伤模型中, Huang等[18]研究发现心肌细胞自噬过度的现象, 应用自噬抑制剂能缩小心肌梗死面积与改善心功能状态。在CPR领域, Lu等[7]研究显示大鼠CA复苏后同样存在心肌细胞自噬过度, 应用药物抑制自噬过程后, 心肌细胞自噬与凋亡程度同时减轻。本研究结果显示, 与S组比较, CPR组和TH组在CA复苏后心肌LC3Ⅱ表达上调与p62表达下调, 提示复苏后心肌自噬水平增加, 其可能与复苏后心功能障碍有关。在进行TH干预后, 结果显示TH组复苏后心肌LC3Ⅱ表达下调与p62表达上调, 同时伴有复苏后心功能障碍的改善, 因而提示TH产生的复苏后心肌保护作用可能与细胞自噬水平的减轻有关。
综上所述, TH能减轻猪CPR后心功能障碍与心肌损伤, 其机制可能与下调心肌CaMKⅡ表达、减轻心肌细胞自噬等有关。本研究结果将为临床围绕CaMKⅡ与细胞自噬开展CA复苏后心功能障碍的防治及TH心肌保护策略的优化提供基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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