脓毒症是机体对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能损伤^[1]，是ICU患者死亡的主要原因之一^[2]。据流行病学调查统计，全球每年脓毒症发患者数达1 900万，占总人口的0.3%，因脓毒症死亡的人数高达530万，其中我国死于脓毒症的患者人数约100万^[3]。虽然，随着脓毒症救治策略如早期抗生素的合理应用、容量治疗以及器官功能等集束化救治策略的不断改进，其救治成功率得到了明显改善，但目前仍未找到有效的靶向分子治疗策略应用于临床救治^[4-5]。因此，如何早期预警和诊断脓毒症并及时给予治疗对脓毒症的临床救治显得尤为重要。

脓毒症是由遗传因素和环境因素共同作用的多基因疾病，致病因素多样，发病机制复杂^[6]。研究显示，脓毒症的发病在不同地区、不用种族之间存在着明显的个体化差异，遗传变异尤其是基因多态性参与并影响了脓毒症的发生发展和预后^[7]。因此，脓毒症的高危遗传标记是脓毒症早期预警系统的重要组分之一。表观遗传（epigenetics）作为一种介导遗传和环境相互作用的重要途径，参与了多种疾病的病理生理过程^[8]。作为表观遗传调控的重要分子DNA去甲基化酶10-11位转位蛋白2（ten-eleven translocation 2, TET2），能够催化5甲基胞嘧啶（5 methyl-cytosine, 5mC）形成5羟甲基胞嘧啶（5 hydroxymethyl-cytosine，5hmC），在DNA去甲基化调控中扮演着重要角色^[9]。研究表明，TET2在炎症/感染和脓毒症的免疫应答过程中发挥重要作用^[10-12]。

TET2基因的多个突变位点与造血系统相关的多种恶性肿瘤的发生发展密切相关^[13]。TET2 SNP rs7679673已被证实是前列腺癌的高危遗传标记^[14-15]。TET2的基因突变与炎症反应的免疫调控也有着密切相关性^[11-12]。然而，TET2基因的遗传变异是否参与脓毒症的病理生理过程尚有待研究。因此，本文选取TET2基因中具有较高最小等位基因频率、且与基因功能可能相关的5个SNPs位点（rs6839705、rs7670522、rs7679673、rs7698522和rs10010325），在脓毒症患者和对照患者中进行基因分型，探讨TET2基因的这些SNPs与脓毒症易感性和预后的相关性。

脓毒症患者根据美国脓毒症诊断标准^[1]纳入，排除标准为孕妇及年龄小于18岁、患有免疫缺陷、骨髓移植术后接受过免疫抑制剂治疗、8周内接受过化疗、急性中毒等患者。入院后24 h内诊断为脓毒症或者临床高度怀疑为脓毒症的患者99例，记录入选者的急性生理与慢性健康评估评分Ⅱ（APACHE Ⅱ）以及脓毒症相关器官衰减评分（SOFA）。根据住院后28 d转归的不同将患者分为存活组（56例）和死亡组（43例）。纳入对照组为外科大手术后未发生脓毒症的患者107例。本研究经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。其中脓毒症患者的基本临床资料, 见表 1。

用2%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝管采集脓毒症患者和对照组患者外周血各2 mL，使用全血DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国QIAGEN公司），严格按照说明书提取样本基因组DNA。

根据现有的遗传关联和流行病学研究报道以及NCBI网站SNP database数据库筛选具有较高最小等位基因频率的遗传变异，最终确认与TET2基因功能可能密切相关的5个SNPs位点rs6839705、rs7670522、rs7679673、rs7698522和rs10010325作为研究对象，其中rs7679673位于TET2基因的5’端区域，其余4个SNPs位点均位于TET2基因的内含子区域。

采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术进行检测，通过NCBI网站的GeneBank基因库中查找突变位点的全长序列，应用primer 3.0在线设计和合成PCR引物（表 2）以及TaqMan探针（表 3）。

TaqMan实时PCR具体方法如下：将引物和TaqMan-MGB探针加入PCR反应体系中，对包含TET2基因多态性位点的DNA片段进行扩增，其扩增反应体系包括：50 ng基因组DNA，1.5 mmol氯化镁，0.5 mmol的上、下游引物，200 mmoldNTP，1 × PCR缓冲液，200 nmol探针，1U热启动Taq聚合酶，适量无菌去离子水（DEPC水），终体积为50 µL。PCR扩增条件为：95℃预变性10 min; 95℃变性20 s、56℃退火15 s，72℃延伸20 s，共进行35次循环; 之后72℃再延伸10 min。在LightCycler480荧光定量PCR仪上（Roche公司，德国）完成扩增。

获得的实验数据用遗传分析法计算其分布频率，应用SPSS 24.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，计数资料用百分率表示; 各组间等位基因和基因型频率组间差异分析采用χ²检验和Fisher精确检验，P < 0.05即为差异有统计学意义。若有显著性差异，基因型和等位基因的风险概率以相对风险度（OR）和95%可信区间（95% CI）表示; 并由此分析TET2基因5个SNPs位点与脓毒症的易感性和预后是否存在相关性。

99例脓毒症患者年龄（59.11±17.14）岁，男性64例（64.6%），女性35例（35.4%），APACHE Ⅱ评分为（20.2 ± 8.2），SOFA评分为（8.4 ± 3.5），住院28 d存活患者56例（56.6%）。对照组与脓毒症患者性别构成、年龄差异均无统计学意义（P > 0.05）。

本研究的所有对象均采用TaqMan实时定量荧光PCR技术获取基因分型结果。

首先，经过遗传学分析TET2基因5’ UTR区域rs7679673的基因型（AA、AC、CC）和等位基因（A、C），以及内含子区域的4个SNPs：rs6839705基因型（AA、AC、CC）和等位基因（A、C）、rs7670522基因型（AA、AC、CC）和等位基因（A、C）、rs7698522基因型（TT、TC、CC）和等位基因（T、C），rs10010325基因型（AA、AC、CC）和等位基因（A、C），在脓毒症组和对照组患者中的分布频率，显示在脓毒症组与对照组之间5个SNPs位点的基因型和等位基因的分布频率均差异无统计学意义（P > 0.05），见表 4。进一步对脓毒症患者中存活组与死亡组之间5个SNPs位点基因型和等位基因分布频率进行统计分析，显示两组间亦差异无统计学意义（P > 0.05），见表 5。

寻找高敏感性、特异性的生物标志物对脓毒症的早期诊断预警、并及时指导治疗至关重要。遗传变异在脓毒症的发生发展及预后的过程中发挥着十分重要的作用^[7]。单核苷酸多态性作为一种最常见的遗传变异，已有大量的研究证实，其与脓毒症发生发展及预后密切相关，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）的基因多态性TNF NCOI的等位基因TNFB2会促使TNF-大量表达，从而影响脓毒症的病理过程和预后^[16];IL-1受体拮抗剂IL-1ra的数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）与脓毒症患者的器官功能损害的易感性密切相关，其等位基因IL-1raA2是诱发器官功能损害的高危遗传标志; IL-1受体相关激酶1（IRAK1）1595C位点的基因多态性与脓毒症的病理生理过程也存在密切相关性。这些研究表明，脓毒症候选基因的单核苷酸多态性是脓毒症发生发展的重要遗传标志。

TET2作为一种重要的表观遗传修饰酶，在抗感染炎症免疫应答及炎症消退过程中发挥着重要的调控作用^[11]。病原微生物入侵机体后，TET2在炎症免疫活化中被显著诱导上升，通过Adar1抑制Socs3基因mRNA上5-mC的表达水平，从而抑制Socs3的活化，促进脓毒症感染诱导的免疫细胞分化扩增和免疫应答^[11-12]。在脓毒症感染早期，TET2的缺失可降低免疫细胞的大量动员，从而避免“炎症因子风暴”诱发的脏器功能损伤^[12]。而在炎症晚期，TET2反馈性地抑制炎症因子的转录和分泌，从而促进炎症反应的消退^[12]。这些研究表明，TET2是参与脓毒症发病过程的重要候选基因。

TET2基因的遗传变异与多种疾病密切相关。在骨髓异常增生综合征患者中，染色体4q24区域TET2基因发生异常突变，有接近26%的患者携带TET2基因编码区的缺失、错义或无义突变; 在造血系统相关的多种恶性肿瘤中TET2也存在多个位点的突变，如急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）患者，TET2基因外显子中的多个SNPs位点与患者的发病密切相关; TET2基因5’ UTR区域SNP rs7679673与前列腺癌的发生发展密切相关^[14-15]，在中国汉族人群中rs7679673的等位基因A突变为C将使罹患前列腺癌的风险显著升高。

本研究中TET基因的5个SNP位点的基因型和等位基因频率在脓毒症组与对照组中并无差异，而且在脓毒症死亡患者与存活患者中亦无差异，由此推断与脓毒症易感性和预后均无相关性。其可能原因分析如下：第一，脓毒症的发生发展受多种因素和多个基因的影响，而且同一基因也涉及多个SNP位点，本研究仅选取了TET2基因的5个SNP位点进行探究，而目前对于TET2基因的许多SNPs的功能的认识并不深入，所研究的SNPs可能并不是脓毒症的主要致病因素，一些重要的SNPs可能被遗漏; 第二，所研究的位点可能与其邻近位点存在连锁不平衡，从而影响TET2对炎症反应的调控作用; 另外，已有证据表明，一些已经报道的与脓毒症发病机制密切相关的基因多态性位点并不是功能性位点，而真正起作用的某些等位基因由于与相邻遗传位点缺乏连锁不平衡而尚未被发现^[17];第三，等位基因在不同地区不同种族中的分布也是不同的，而本研究仅纳入汉族人群作为研究对象，而且纳入病例数较少，并不能真实反映这5个SNP位点对脓毒症易感性和预后的影响。因此，需要进一步筛选TET2的多个SNP位点，并进一步扩大样本量，尽可能在单一病因导致的脓毒症患者中，采用多种遗传分析模式和多变量分析方法进行系统分析，才能更客观地明确TET2基因的单核苷酸多态性在脓毒症发生发展和预后中的作用。