中华急诊医学杂志  2019, Vol. 28 Issue (7): 851-854   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.07.010
MCC950对脓毒症相关性脑病小鼠认知功能的影响
张晶云1 , 范云霞1 , 傅群2 , 吴晶2 , 周志强2 , 李国民3     
1 江苏大学附属金坛医院麻醉科,常州 213200;
2 南京医科大学附属金陵临床医学院麻醉科 210002;
3 江苏大学附属金坛医院重症医学科,常州 213200
摘要: 目的 观察Nod样受体蛋白3 (Nod-like receptor protein 3, NLRP3)抑制剂MCC950对脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)小鼠认知功能的影响。方法 成年雄性C57BL/6小鼠90只,采用随机数字法随机分为3组:假手术组(Sham组, 20只)、脓毒症组(CLP组, 35只)和脓毒症+ MCC950组(MCC950组, 35只)。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症小鼠SAE模型。根据分组于术前30 min及术后第1、2、4、6天腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)或MCC950 (10 mg/kg)。术后第7天各组取6只小鼠,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠海马组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)和IL-18的含量,以及免疫组织化学法检测CA1区NLRP3阳性细胞数,余下小鼠术后第14天行旷场实验及条件恐惧性实验。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q法,以P < 0.05为差异有统计学意义。结果 MCC950组与CLP组相比,小鼠情景实验僵直时间明显延长[(137±21)s vs (84±15) s, P=0.013],海马组织中NLRP3、IL-1β及IL-18蛋白含量明显降低(P < 0.01),海马CA1区每平方毫米区域NLRP3阳性细胞数明显减少[(23±5)个vs(74±13)个, P < 0.01];各组ASC蛋白含量及旷场实验结果差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 MCC950可以明显改善SAE小鼠的认知功能,其机制可能与抑制海马组织中NLRP3炎症小体的激活及下游炎症因子IL-1β及IL-18的释放有关。
关键词: 脓毒症相关性脑病    认知功能    神经炎症    NLRP3炎症小体    白细胞介素-1β    白细胞介素-18    
Effects of MCC950 on cognitive function in a mouse model of sepsis-associated encephalopathy
Zhang Jingyun1 , Fan Yunxia1 , Fu Qun2 , Wu Jing2 , Zhou Zhiqiang2 , Li Guomin3     
1 Department of Anesthesiology, Jintan Hospital, Jiangsu University, Changzhou 213200, China;
2 Department of Anesthesiology, Jinling Clinical Medical College of Nanjing Medical University, Nanjing 210002, China;
3 Department of Anesthesiology and Intensive Care Unit, Jintan Hospital, Jiangsu University, Changzhou 213200, China
Abstract: Objective To investigate the effects of Nod-like receptor protein 3 inhibitor MCC950 on cognitive function in a mouse model of sepsis-associated encephalopathy (SAE). Methods Ninety adult male C57BL/6 mice were randomly (random number) divided into three groups: the sham + saline group (n=20, sham group), CLP + saline group (n=35, CLP group), and CLP + MCC950 group (n=35, MCC950 group). SAE mouse model was established by cecal ligation and puncture (CLP) surgery. Saline (10 mL/kg) or MCC950 (10 mg/kg) was intraperitoneally injected 30 min before surgery and on day 1, 2, 4 and 6 after surgery according the grouping. Seven days after surgery, six mice were taken from each group. Western blot was used to detect the hippocampal content of NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein (ASC), interleukin-1β (IL-1β) and IL-18. The number of NLRP3-positive cells in CA1 region were detected by immunohistochemical analysis. The remaining mice in each group were used for open field and fear conditioning tests 14 days after surgery. One-way analysis of variance was used for inter-group comparison, and SNK-q test was used for pairwise comparison. A P value < 0.05 was considered statistically significant. Results Compared the MCC950 group with the CLP group, the freezing time of context test was significantly increased [(137±21) s vs (84±15) s, P=0.013], the hippocampal content of NLRP3, IL-1β and IL-18 were significantly reduced (P < 0.01), and the number of NLRP3-immunoreactive cells per mm2 in CA region were significantly decreased (23±5 vs 74±13, P < 0.01). There was no significant changes in protein level of ASC and results of open field tests (P > 0.05). Conclusions MCC950 administration can improve cognitive function in a mouse model of SAE, which is probably due to the inhibition of NLRP3 inflammasome and downstream inflammatory cytokines IL-1β and IL-18.
Key words: Sepsis-associated encephalopathy    Cognitive function    Neuroinflammation    NLRP3 inflammasome    Interleukin-1β    Interleukin-18    

脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)是脓毒症中枢神经系统并发症,患者常伴随长期的认知功能损伤及精神障碍[1-4]。SAE可能与神经系统炎症有关[1, 2, 5],笔者前期研究发现脓毒症可引起小鼠海马组织中NLRP3小体的激活并引起下游炎症因子的释放,推测NLRP3信号通路可能是SAE重要的病理生理学机制之一[6]。MCC950是新近发现的NLRP3特异性抑制剂,研究表明在炎症性疾病或神经退行性疾病中,MCC950具有明显的脑保护作用[7-8]。本研究观察MCC950对脓毒症相关性脑病小鼠认知功能的影响,探讨其可能机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

成年雄性C57BL/6小鼠90只,由常州卡文斯实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK (苏) 2011-0003,体质量28~32 g。小鼠自由进食水,昼夜节律为12 h,环境湿度维持在50%左右。

1.2 主要材料和试剂

实验所用材料和试剂包括2%戊巴比妥钠(Sigma公司,美国)、MCC950(上海强耀生物科技有限公司,中国)、NLRP3抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司,中国)、ASC抗体(Santa Cruz Biotechnology公司,美国)、IL-1β抗体(Santa Cruz Biotechnology公司,美国)、IL-18抗体(Santa Cruz Biotechnology公司,美国)、β-actin抗体(Bioworld公司, 美国)。辣根过氧化物酶偶联兔或羊抗鼠二抗、ECL显影液、BCA蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验方法 1.3.1 SAE模型建立

小鼠SAE模型建立采用盲肠结扎穿孔法(CLP)[6]。小鼠随机(随机数字法)分为3组:假手术组(Sham组, 20只)、脓毒症组(CLP组, 35只)和脓毒症+ MCC950组(MCC950组, 35只)。术前禁食12 h,2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。CLP组和MCC950组小鼠沿腹正中线行1 cm长的切口,游离肠系膜和盲肠远端,并以5-0丝线环形结扎盲肠根部,于结扎端22号针头贯通穿刺2次,挤出粪便少许,还纳肠段并依次缝合腹膜和皮肤。Sham组仅行剖腹、游离盲肠、关腹手术。术后立即皮下注射生理盐水30 mL/kg,补充术中液体丢失。依据分组于术前30 min及术后第1、2、4、6天腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)或MCC950 (10 mg/kg)[9]

1.3.2 Western Blot检测NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18的含量

术后第7天各组取6只小鼠处死,取出两侧大脑组织,一侧提取新鲜海马组织并用磷酸缓冲液清洗后,加入裂解缓冲液匀浆裂解组织,离心取上样,加热5 min使蛋白变性,凝胶电泳分离。转膜,5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。加入封闭液和一抗抗体NLRP3(1:1 000)、ASC (1:100)、IL-1β (1:1 000)和IL-18 (1:1 000)室温孵育2 h,洗涤后加入二抗室温孵育1 h,脱色、底物显色反应、显影。采用Image J软件检测NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18的含量。

1.3.3 免疫组织化学检测NLRP3阳性细胞数

取小鼠另一侧大脑,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。标本切片后将切片用二甲苯浸泡两次,各10 min。在不同浓度的乙醇中(100%、95%、85%、70%)分别浸泡5 min进行水化。清洗3次后在抗原修复缓冲液中进行抗原修复。3% H2O2-甲醇溶液处理切片15 min灭活酶。清洗3次并加入一抗NLRP 3抗体37℃湿盒孵育2 h。再次清洗3次后加入增强剂50 μL,室温湿盒孵育20 min。清洗并加入辣根过氧化物酶标记二抗50 μL,室温孵育30 min。苏木精染液复染10 min后封片。棕黄色细胞为NLRP 3阳性细胞,显微镜下观察CA1阳性细胞的数目。

1.3.4 旷场实验

立方形敞箱(40 cm×40 cm×40 cm),底面均分为3×3方格。术后第14天将小鼠从中央格放入观察箱内探索5 min,由图像自动监视系统(XR-XZ301,上海欣软信息科技有限公司,上海)追踪其探索路程、中央格停留时间、穿越格数、后肢直立次数、理毛次数及粪便粒数。室内隔音,每次测试后用75%酒精彻底清洁敞箱,避免前只小鼠残留气味影响实验结果。

1.3.5 条件恐惧性实验

旷场实验2 h后,将小鼠放入75%酒精擦拭的实验箱(30 cm×30 cm×45 cm)中适应180 s后,接受声音和足底电击刺激(声音,30 s,65 dB,3 000 Hz;电击,3 s,0.75 mA),继续停留30 s后放回原饲养笼。训练结束24 h后进行场景和声音实验。场景实验将小鼠放入相同的环境中390 s,记录第2个300 s内僵直时间。声音实验将小鼠放不同的环境中390 s,第2个180 s时给予相同声音刺激而无电击,记录僵直时间。训练和测试阶段由图像自动监视系统(XR-XC404,上海欣软信息科技有限公司,上海)追踪小鼠僵直反应时间。每次实验结束后用75%酒精擦拭场地,避免前只小鼠残留气味影响实验结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 行为学实验结果

旷场实验中三组小鼠总探索路程及中央格停留时间差异无统计学意义(P > 0.05),表明各组小鼠运动能力无明显差别;与Sham组比较,CLP组小鼠情景实验僵直时间明显缩短[(84±15) s vs (145 ±24) s, P=0.002];与CLP组相比,MCC950组小鼠情景实验僵直时间明显延长[(137±21) s vs (84±15) s, P=0.013];三组之间声音实验差异无统计学意义(P > 0.05), 见表 1

表 1 旷场实验和条件性恐惧实验结果(Mean±SD) Table 1 Results of open field and fear conditioning tests (Mean±SD)
组别 例数 总探索路程(cm) 中央格停留时间(s) 24 h场景实验(s) 24 h声音实验(s)
Sham组 14 1 207±253 10.7±1.3 145±24 83±15
CLP组 12 1 019±224 9.1±1.1 84±15a 73±11
MCC950组 19 1 045±238 9.4±1.3 137±21b 80±12
F 0.194 1 0.480 6 7.726 0 0.343 6
P 0.824 5 0.622 7 0.001 8 0.712 3
注:与Sham组相比,aP < 0.05;与CLP组相比,bP < 0.05
2.2 NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18蛋白含量

与Sham组相比,CLP组小鼠海马组织中NLRP3、IL-1β及IL-18含量(%)增高(213±39、182±20、171±23,均P < 0.01);与CLP组相比,MCC950组小鼠NLRP3、IL-1β及IL-18含量明显降低(P < 0.01);各组ASC含量差异无统计学意义(P > 0.05),见图 1, 表 2

图 1 小鼠海马组织NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18蛋白表达 Fig 1 Western blot results of NLRP3, ASC, IL-1β and IL-18 expressions in mouse hippocampus

表 2 NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18蛋白表达相对定量分析(n=6, Mean±SD) Table 2 Relative quantitative analysis of protein levels of NLRP3, ASC, IL-1β and IL-18 (n =6, Mean±SD)
组别 NLRP3 (%) ASC (%) IL-1β(%) IL-18 (%)
Sham组 100 100 100 100
CLP组 213±39a 111±10 182±20a 171±23a
MCC950组 121±17b 104±11 114±10b 113±8b
F 15.81 0.780 29.92 17.93
P < 0.01 0.484 < 0.01 < 0.01
注:与Sham组相比,aP < 0.05;与CLP组相比,bP < 0.05
2.3 NLRP3阳性细胞表达情况

与Sham组相比,CLP组小鼠海马CA1区每平方毫米区域NLRP3阳性细胞数明显增多(74±13 vs 16±3, P < 0.01),见图 2 (黄褐色或棕黄色细胞为NLRP3阳性细胞);与CLP组相比,MCC950组小鼠海马CA1区每平方毫米区域NLRP3阳性细胞数明显减少(23±5 vs 74±13, P < 0.01)。

图 2 各组CA1区NLRP3表达(免疫组化染色) Fig 2 Immunohistochemical staining results of NLRP3 expression in CA1 region of each group
3 讨论

SAE指缺乏中枢神经系统感染的临床或实验室证据,由全身炎性反应引起的弥散性脑功能障碍。SAE患者常伴随认知功能损伤和精神障碍,其机制尚不完全清楚,可能与内皮细胞激活、血脑屏障损伤、氧化应激损伤、神经炎症及凋亡等有关[5, 10]。CLP诱导的脓毒症动物模型常用于SAE的实验研究[11]。本研究通过建立小鼠CLP模型发现,CLP可引起小鼠情景实验中僵直时间明显减少,情景实验主要反映海马依赖的学习记忆功能,此结果表明脓毒症可引起小鼠海马依赖的认知功能损伤。

NLRP3是炎症小体家族中研究最广泛的炎症小体,NLRP3通过激活半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)并进一步引起炎症因子IL-1β和IL-18的释放而引起炎症损伤,是诸多炎症疾病和神经退行性疾病等发病的重要原因[12-13]。本研究观察到SAE小鼠海马组织中NLRP3蛋白表达升高,阳性细胞数增加,炎症因子IL-1β和IL-18水平升高,表明CLP可以引起NLRP3炎症小体的激活并下游炎症因子的释放,引起神经炎症反应。与笔者前期研究结果相似[6],本研究进一步表明NLRP3炎症小体激活所致神经炎症可能是SAE重要的病理生理学机制。

MCC950是近年来发现的小分子特异性的NLRP3抑制剂[8-9],具有自由透过血脑屏障的特点。近年来越来越多的研究表明MCC950在诸多神经系统疾病(如缺血性、炎症及退行性疾病)中具有明显的神经保护作用。Zhai等[13]发现腹腔注射MCC950 (10 mg/kg)可明显降低糖尿病模型小鼠海马组织中NLRP3和IL-1β的表达,改善糖尿病所致认知功能的损伤。本研究结果亦发现腹腔注射MCC950(10 mg/kg)可抑制CLP小鼠海马组织中NLRP3炎症小体及炎症因子IL-1β和IL-18的表达,具有明显的抗炎作用。此外,给予MCC950可延长小鼠情景实验的僵直时间,表明MCC950具有明显的认知功能保护作用。ASC是NLRP3炎症小体形成过程中重要的衔接蛋白,NLRP3激活时募集ASC蛋白并进一步连接caspase-1以形成NLRP3炎症小体[9]。本研究中三组ASC表达无统计学差异,可能与其他蛋白(如蛋白激酶D等)亦参与NLRP3炎症小体的形成有关[14],同时进一步表明MCC950是NLRP3特异性抑制剂,其抗炎脑保护作用与其抑制NLRP3炎症小体激活有关。

综上所述,本研究观察到MCC950显著改善SAE小鼠的认知功能功能,这可能与抑制海马中枢NLRP3炎症小体及下游炎症因子的表达有关。

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