甲基苯丙胺（methamphetamine，METH），俗称冰毒。长期使用能够导致多脏器功能衰竭，短期大剂量使用可导致吸食者猝死^[1-2]。神经系统是METH作用的经典靶组织，METH吸食后，通常表现出兴奋、偏执和暴力倾向等多种明显的行为异常^[3]。目前，众多研究集中于甲基苯丙胺的神经毒性，包括神经细胞凋亡、小胶质细胞和星形胶质细胞活化及血脑屏障的破坏等^[4-6]。研究显示METH能够诱导神经元细胞发生凋亡^[7]。此外，METH亦能够诱导神经系统发生自噬^[1-8]。

METH的心脏毒性作用包括心率加快和血压升高，可能导致心血管功能衰竭，甚至猝死。Leung等^[4]报道，甲基苯丙胺暴露能够明显促进心肌细胞发生凋亡。研究显示，自噬过程与多种细胞损伤有关。作为一种常见的生理、病理机制，自噬能降解损伤的细胞器及蛋白，在应激条件下提供能量，尤其在饥饿(氨基酸和营养剥夺)、缺氧和代谢压力下，自噬将被激活。自噬过程是由一组进化上高度保守的自噬相关性蛋白(ATGs)调节，该过程中自噬体及相关蛋白表达量会发生明显变化^[9]。因此推测METH在引起心肌细胞发生损伤的过程中，自噬程序也同时被激活。

在本研究借助小鼠心肌组织及心肌细胞系METH的染毒模型，观察和阐述METH对心脏自噬程序的诱导作用，以期为探讨METH暴露引起的心脏毒性的机制提供依据。

健康雄性SPF级6周龄C57小鼠60只，体质量（18±2）g（南京医科大学动物实验基地提供）。心肌细胞系H9C2（上海中乔新舟生物科技有限公司）。DMEM/ F-12培养基（Gibco, 美国），RIPA蛋白裂解液，cocktail蛋白酶抑制剂，BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific, 美国）。METH(中国食品药品检定研究所)。WB抗体：p62，Beclin-1, LC3B，GAPDH，β-actin（Cell Signaling Technology，美国)。山羊抗小鼠二抗，山羊抗兔二抗，LC3红色荧光二抗（Alexa Fluor^® 488）（上海翊圣生物科技有限公司）。三硝基苯-多聚甲醛-戊二醛联合固定剂（PAPG液），METH溶液均由20 mg METH粉剂溶解于1 077 μL双蒸水配置而成。

健康雄性C57Bl/6J小鼠，SPF级，5~6周龄，体质量（18±2）g，由南京医科大学动物实验中心提供(动物实验伦理证号：20110521)。所有小鼠都饲养于光/暗周期为12 h/12 h，环境温度(22±2)℃，相对湿度40%~70%的条件下，自由获得饲料和饮水。适应性饲养1周后，利用随机数字表将60只小鼠随机(随机数字法)分为3组（每组20只）。为了探究甲基苯丙胺短期过量摄入致死的可能原因，根据已有的研究设置：3 d组模拟人类急性染毒模型（小鼠给予腹腔注射单次剂量15 mg/kg的METH溶液，2次/d，连续3 d）；7 d组模拟人类亚急性染毒模型（腹腔注射单次剂量相同的METH溶液，2次/d，连续7 d），已知生理盐水对于自噬的激活并无影响，为了与造模组小鼠造成的多次刺激保持操作一致。参考文献^[18]中的对照处理方法，选择单一对照组连续7 d在相同时间点给予腹腔注射0.9%生理盐水。各组分别在最后一次注射后的24 h，解剖小鼠，获取心脏组织，-80℃冰箱保存备后续实验使用。

心肌细胞系（H9C2），购自上海中乔新舟生物科技有限公司。细胞在37℃、5% CO₂条件下，采用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）培养3 d收获，第1天细胞培养至铺满80%到90%按1:3比例传代；第2天细胞约铺满皿底60%加入METH干预；加药后24 h，第3天收获细胞提取总蛋白。

体内实验：RIPA裂解小鼠心脏组织，超声匀浆，离心取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，5×上样缓冲液定容稀释，100℃煮5 min，后-20℃冰箱保存样本，动物组织蛋白上样量为50 μg蛋白。体外实验：RIPA裂解，离心取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，5×上样缓冲液定容稀释，100℃煮5 min，后-20℃冰箱保存样本，细胞蛋白上样量为20 μg蛋白。体内外实验均采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离不同相对分子质量蛋白，后用湿转法将蛋白转至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用脱脂牛奶按1:1 000稀释一抗在4℃冰箱封闭摇晃过夜。TBST溶液洗膜，后孵育二抗稀释液，室温下封闭2 h。TBST洗膜后运用化学发光（ECL）仪器（Bio-rad, 美国）进行胶片曝光显影，利用Image J定量统计对应条带的强度。

将心肌细胞种植于培养皿中，细胞贴壁后，根据不同分组处理细胞；予-20℃甲醇室温固定；免疫染色封闭液室温封闭1 h；加入稀释一抗（兔抗LC3B多克隆抗体1:200稀释），4℃孵育过夜；加入稀释二抗（山羊抗兔IgG1:1 000稀释），室温避光孵育1 h；弃二抗；DAPI室温避光孵育3 min，抗荧光淬灭封片剂封片；激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM710）下拍片。

细胞培养至80%时，用胰蛋白酶溶液将贴壁细胞处理后，1 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，再次加入PBS溶液重悬细胞。此步骤重复两遍。最后一次离心后，使细胞在离心管底部形成松散的团块，沿离心管管壁缓慢加入固定液，保存完善后送入电镜室（JEOL-1010）观察。

所有数据均以均数±标准差（Mean±SD）表示。利用SPSS19.0进行统计分析，多组定量资料比较采用one-way ANOVA（单因素方差分析）检验，两组之间数据比较采用LSD-t检验，所有柱状统计图均采用Prism 5.01版绘制。以P < 0.05为差异具有统计学意义。所有实验均通过3次重复的独立实验验证。

利用Western blot法检测小鼠心肌组织中自噬相关蛋白表达量变化。图 1A为动物实验结果，与对照组相比，METH处理组无论3 d组或7 d组均发现心肌细胞的自噬相关蛋白p62，Beclin-1和LC3的表达明显增高，说明METH增加了心肌细胞的自噬活性。与METH3 d组比较，METH7 d组中p62和LC3蛋白表达水平明显增高，而Beclin-1蛋白表达量差异无统计学意义。图 1B-D为1A的统计结果，差异具有统计学意义（n=20，P < 0.05）。

A-D：Western blot检测p62，Beclin-1，LC3，β-Actin的表达变化及统计图； 与对照组比较，aP < 0.05；METH7 d组与METH3 d组比较，bP < 0.05，cP < 0.01 图 1 Western blot检测METH暴露后小鼠心肌组织中自噬相关蛋白表达变化 Fig 1 Western blot was used to detect the expression of autophagy-related protein in myocardium of mice exposed to METH

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基于动物实验结果，进一步观察METH暴露对H9C2心脏细胞系自噬可能存在的影响。用Western blot和免疫荧光法对自噬相关蛋白表达量变化进行检测发现，H9C2细胞与300 mmol/mL、600 mmol/mL和900 mmol/mL的METH干预24 h后，细胞中自噬相关蛋白p62，Beclin-1和LC3的表达同样明显增高（图 2A-D），且各蛋白表达量与METH剂量有相关性（图 2B-D），差异具有统计学意义（n=3，P < 0.05）。图 2E示，900mmol/mL剂量METH干预H9C2细胞系后，与对照组相比，红色荧光显著增强，LC3蛋白表达明显增多。

A-D：Western blot检测p62，Beclin-1，LC3，β-Actin的表达变化及统计图；E:免疫荧光法检测LC3蛋白表达变化；与对照组比较，aP < 0.05 图 2 透射电子显微镜观察冰毒干预后，H9C2细胞中自噬体数目的变化 Fig 2 The number of autophagosome in H9C2 cells was observed by transmission electron microscopy (TEM)

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为了进一步观察METH对H9C2细胞系自噬程序的影响，通过电子显微镜下直接观察细胞形态学改变。如图 3所示，与对照组相比，900 mmol/mL浓度的METH干预后，H9C2细胞皱缩明显，细胞核内染色质浓缩，自噬体数量明显增加。

A：8 000倍镜下细胞形态。B：将A图中红色矩形标记区域放大至30 000倍镜的细胞形态，典型自噬体采用星形标记。 图 3 透射电子显微镜观察冰毒干预后，H9C2细胞中自噬体数目的变化 Fig 3 The number of autophagosome in H9C2 cells was observed by transmission electron microscopy (TEM)

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甲基苯丙胺中毒最常见的是神经精神异常的表现，但有研究显示，对100例METH中毒后死亡患者进行法医学鉴定，其中有68%的患者直接死因为METH所导致的心脏毒性，病理检验表现为心肌纤维肥大、轻微、中度到重度动脉粥样硬化和点状变性或坏死^[19]。已有研究表明，过度激活机体的自噬程序，是METH发挥毒理作用的重要方式^[11]。自噬作用是机体高度保守的降解过程，可分为：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种不同类型。其中目前对巨自噬的研究最为深入，而巨自噬的发生是由一组进化上高度保守的自噬相关性蛋白（ATGs）调节，通过形成胞质内双层膜囊泡的方式，将胞质内的物质转移到溶酶体中降解，是决定细胞生存或者死亡的重要调控者^[13]。

目前已有研究显示，在神经系统中METH可以通过激活κ阿片受体上调Beclin-1和LC3两个重要的自噬标志蛋白^{[14, 17]}。在自噬分子机制通路中Beclin-1位于LC3的上游，Beclin-1可与一些蛋白结合以复合物的形式存在，当自噬程序被激活，Beclin-1从复合物形态解聚转化为游离形态，调控自噬下游启动过程。LC3包括LC3-I和LC3-Ⅱ，前者是可溶性的，后者结合于自噬结构膜上。LC3-Ⅱ的表达与自噬结构的形成呈现正相关性。研究者常用LC3-Ⅱ蛋白作为自噬体的标志物，观察细胞的自噬活动^{[7, 15]}。为了探究甲基苯丙胺短期过量摄入致死的原因，本研究建立模拟人类甲基苯丙胺急性中毒和亚急性中毒的动物模型。通过Western blot法检测了心肌组织和心肌细胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达，继而判断METH干预后细胞中自噬活动变化，发现与对照组相比，METH组中Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白的表达明显增多，且亚急性动物模型的自噬蛋白LC3和p62表达水平均较急性中毒模型有明显提高，提示随着METH暴露时间的延长可能导致心肌细胞自噬流受阻，LC3蛋白在心肌细胞中逐渐累积；为进一步验证上述结果，将细胞中的LC3蛋白用红色荧光标记，通过比较对照组和METH组细胞中红色荧光强度的变化来判断LC3表达变化。结果显示，与对照组相比，METH组中被红色荧光标记的LC3表达明显增多，提示METH可激活心肌细胞中的自噬过程。另有研究表明，METH可以诱导泛素化蛋白质形成不溶性聚合物^[14]，而且这种不溶性聚合物的累积伴随p62蛋白质的增加。p62是一种选择性自噬受体蛋白，可降解泛素化底物，在自噬通路分子机制和自噬底物之间起调节作用，同时反映自噬通路的通畅性^[15]。本文在动物实验和细胞实验中，从蛋白水平发现METH同样可以诱导心肌细胞中的p62蛋白表达增多。随着对自噬研究的深入，有研究发现自噬是对机体有保护作用的生物程序；但也有研究显示自噬能通过激活凋亡程序导致机体损伤^[16-17]。本研究射电镜在8千倍和3万倍视野下观察细胞形态变化，发现甲基苯丙胺能够明显增加心肌细胞中的自噬体数量，且METH组细胞中出现细胞皱缩明显，细胞核内染色质浓缩的现象。