中华急诊医学杂志  2019, Vol. 28 Issue (3): 350-355   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.03.014
脓毒性休克患者肠道微生态变化临床研究
万有栋1 , 朱瑞雪2 , 潘新亭1 , 吕韶燕1 , 赵连兴1 , 吴自谦1     
1 青岛大学附属医院急诊重症监护室 266000;
2 郑州市中心医院超声医学科 450000
摘要: 目的 对比脓毒性休克患者与健康志愿者的肠道菌群, 以明确ICU脓毒性休克患者肠道菌群组成特点。方法 采用前瞻性研究方法, 选择2015年6月至2016年2月郑州大学第一附属医院重症医学科收治的脓毒性休克患者及同期健康志愿者肠道粪便样本各15例, 提取菌群DNA进行16S rDNA基因测序, 评估肠道菌群组成对临床预后影响, 采用香农-威纳指数评估菌群多样性。结果 对比健康志愿者, 脓毒性休克患者肠道菌群组成变化较大, 变形菌门比例变化较为显著, 健康志愿者平均相对比例为3.53%, 脓毒性休克患者为23.71%, 差异有统计学意义(P=0.000 6);梭杆菌比例也相对增高, 健康志愿者平均相对比例为0.12%, 脓毒性休克患者为1.27%, 但差异无统计学意义(P=0.059)。脓毒性休克患者肠道菌群种类较多, 本研究鉴别出29种, 每个患者肠道菌群组成具有高度个体化。分析肠道菌群组成与临床结局之间关系发现, 健康志愿者与脓毒性休克患者香农-威纳指数差异无统计学意义(P=0.12), 且服用益生菌、使用肠内营养均不能降低院内病死率(P=0.59, P=0.58)。结论 脓毒性休克患者肠道菌群组成特点为种群多样性、个体化程度均较高, 但也有单个菌属过度繁殖的现象。肠道菌群组成与临床结局之间关系需要大样本研究进一步探索。
关键词: 肠道菌群     脓毒性休克     预后     16S rDNA    
Clinical investigation of intestinal microbiota in septic shock patients
Wan Youdong1 , Zhu Ruixue2 , Pan Xinting1 , Lyu Shaoyan1 , Zhao Lianxing1 , Wu Ziqian1     
1 Department of Emergency ICU, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China;
2 Department of Ultrasonography, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450000, China
Abstract: Objective To compare the intestinal microbiota of septic shock patients and healthy subjects, and study the composition of the intestinal microbiota and its effect on septic shock patients in the intensive care unit (ICU). Methods A total of 15 stool samples were prospectively collected from septic shock patients admitted to the ICU in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University between June 2015 and February 2016, while 15 samples from healthy subjects served as controls. Bacterial DNA was submitted for 16S rDNA gene sequencing. The association between gut microbiota composition and clinical parameters was evaluated. Shannon index was used to assess the bacterial diversity. Results Compared with the healthy subjects, the composition of intestinal microbiota in septic shock patients changed significantly. The abundance of Proteobacteria and Fusobacteria were significantly higher in septic shock patients than in healthy subjects (23.71% vs 3.53%, P=0.000 6; 1.27% vs 0.12%, P=0.059, respectively). In this study, 29 species were identified, and the composition of intestinal microbiota in each patient was highly individualized. There was no significant difference in Shannon index between septic shock patients and healthy subjects (P=0.12). Conclusions The composition of intestinal microbiota in septic shock patients was characterized by high diversity and individualization, but there was the phenomenon of overproduction of single bacteria genus. The relationship between the composition of intestinal microbiota and clinical outcomes requires further exploration by large sample studies.
Key words: Intestinal microbiota     Septic shock     Prognosis     16S rDNA    

最新的脓毒症定义认为脓毒症是宿主对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。脓毒性休克指脓毒症患者尽管经过充分的液体复苏仍存在持续的低血压,需要使用升压药物维持平均动脉压65 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上,血乳酸2 mmol/L以上,病死率高达40%~70%[1]。关于脓毒症治疗的新药物研究较多,但多数药物被证明无效,如活化蛋白C、肝素等,新的有效的治疗措施亟待研究[2-4]

肠道菌群被称为高度活跃的另一大“人体器官”,为脓毒症的治疗提供了新的可能的靶点[5]。目前研究表明,肠道菌群结构及多样性改变与众多炎症及代谢疾病的发生发展密切相关,如糖尿病、肥胖、肝硬化[5-7]。按三域系统方法进行分类,对于健康志愿者的肠道菌群门类,菌群主要是由厚壁菌门与拟杆菌门组成,约占89%~98%[8]。而对于ICU患者,肠道菌群特点为低种群多样性,关键共生菌减少及个别菌群过度繁殖[9]。研究表明,肠道菌群改变可能与肠内营养、抑酸剂使用、抗生素、机械通气的应用有关[10]。然而,关于ICU患者肠道菌群组成的研究样本量均较小[9, 11],且国内外尚无专门针对脓毒性休克患者的研究。因此本研究采用16S rDNA技术对肠道菌群进行基因测序,明确肠道菌群组成特点,并探索其与临床结局的关系,以期为脓毒性休克的治疗提供新的思路。

1 资料与方法 1.1 一般资料

本研究为前瞻性观察性研究。连续入选2015年6月至2016年2月郑州大学第一附属医院重症医学科的脓毒性休克患者作为实验组。对照组为同期15例健康成年志愿者,要求一年内未服用抗生素且无吸烟史。

1.2 实验方法及分组

纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)脓毒性休克符合2012年拯救脓毒症运动指南委员会的诊断标准[1]。所有患者给予充分液体复苏后,平均动脉压仍≤65 mmHg。记录患者基本资料包括身高、体质量、APACHEⅡ评分、粪便收集时间、肠内营养及益生菌制剂使用、病死率等,因抗菌药物可对肠道菌群产生显著影响,详细记录患者抗生素使用种类。

排除标准:预期生存期 < 24 h患者,恶性肿瘤晚期患者。

本研究计划书已经过伦理委员会审批,符合伦理学相关要求,并获得患者家属的知情同意。

1.3 肠道菌群分析

新鲜大便样本收集后立刻转移入-80 ℃冰箱存储,采用Lankelma等[12]研究描述的方法进行16S rDNA基因测序分析。采用使用者手册里标明的方法进行DNA提取[13],按照标准化方案构建菌群文库[14]。使用每个样品的16S rDNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增构建文库,然后在Illumina MiSeq平台上测序。采用QIIME及Mothur软件进行数据分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料呈正态分布、方差齐用成组t检验;非正态分布、方差不齐用秩和检验。计数资料用百分率表示,率的比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。采用QIIME软件计算α多样性,选择具有代表性的香农-威纳指数代表α多样性,依据每个样本菌群组成及β多样性数据绘制相似性树,采用GraphPad Prism软件进行图片绘制。

2 结果 2.1 一般临床资料

本研究共收集15例ICU脓毒性休克患者(平均年龄59岁,80%男性),及15例健康志愿者(平均年龄55岁,80%男性),患者基本特征见表 1。患者基础疾病包括重症胰腺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、重症肺炎、重症肝炎等。主要感染源包括肺部感染(67%)及腹腔感染(27%);主要探究治疗方法包括应用肠内营养(73%)及益生菌(53%)。7例(46%)患者使用超过3种抗微生物药物。2例患者血培养阳性,分别为迪氏副拟杆菌和大肠杆菌。8例(53%)患者痰培养结果阳性,主要为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌。

表 1 纳入患者基本特征表 Table 1 Characteristics of all included patients
患者编号 年龄(岁)/性别 主要基础疾病 APACHE Ⅱ评分 感染源 是否使用肠内营养 是否使用益生菌 抗细菌药物 抗真菌药物 血培养结果 痰培养结果 是否腹泻 是否院内死亡
1 75/男 重症急性胰腺炎 20 肺、腹腔 碳青霉烯类 大肠杆菌 阴性
2 35/男 肠道感染 21 腹腔 碳青霉烯类,替考拉宁 阴性 阴性
3 47/男 重症肝炎 23 万古霉素,替加环素 氟康唑 阴性 鲍曼不动杆菌
4 56/女 免疫血小板减少性紫癜 18 碳青霉烯类,左氧氟沙星利奈唑胺 伏立康唑,卡泊芬净 阴性 阴性
5 51/男 重症肺炎 19 头孢哌酮舒巴坦,碳青霉烯类 阴性 阴性
6 69/男 慢性阻塞性肺疾病急性加重 20 碳青霉烯类 伏立康唑 阴性 阴性
7 89/男 颌下脓肿 21 皮肤软组织 碳青霉烯类,奥硝唑,利奈唑胺 阴性 阴性
8 63/男 重症肺炎 21 莫西沙星 阴性 绿脓杆菌
9 68/男 重症肺炎 22 米诺环素,左氧氟沙星,利奈唑胺 阴性 肺炎克雷伯菌, 鲍曼不动杆菌
10 61/男 重症肺炎 20 哌拉西林 伏立康唑 阴性 肺炎克雷伯菌鲍曼不动杆菌, 白色念珠菌
11 53/男 消化道穿孔 22 腹腔 美洛西林,万古霉素,左氧氟沙星,奥硝唑 迪氏副拟杆菌 阴性
12 51/女 多脏器衰竭 19 复方新诺明 伏立康唑 阴性 绿脓杆菌,白色念珠菌
13 46/男 主动脉夹层 15 碳青霉烯类,左氧氟沙星,美洛西林 阴性 肺炎克雷伯菌,鲍曼不动杆菌
14 64/女 重症肝炎 29 腹腔 万古霉素,碳青霉烯类 阴性 鲍曼不动杆菌
15 64/女 消化道穿孔 20 腹腔 碳青霉烯类,替考拉宁 氟康唑,卡泊芬净 阴性 肺炎克雷伯菌
2.2 肠道菌群组成特点

肠道菌群的生物分类学遵循三域系统方法进行分类:域、界、门、纲、目、科、属、种。本研究从门及属类次进行描述。对于健康志愿者,肠道菌群组成的门类主要为拟杆菌门和厚壁菌门(图 1),平均相对占比分别为49.85%和43.54%。变形菌门平均相对占比3.53%,柔壁菌门仅在4例健康志愿者中发现,平均相对占比为2.3%。而脓毒性休克患者肠道菌群组成与健康志愿者明显不同。尽管拟杆菌门和厚壁菌门仍然是主要细菌,但平均相对占比均下降,两者比例分别为42.38%与30.27%。变形菌门比例明显升高,在脓毒性休克患者中比例为23.71%与健康志愿者(3.53%)比较,差异有统计学意义(P=0.000 6)。梭杆菌门比例也异常增高,比例为1.27%,但对比健康志愿者,差异无统计学意义(P=0.59)。7号患者变形菌门细菌过度繁殖,占比高达94%,最终院内死亡。

每个色柱代表 1名志愿者或患者,Relative abundance:相对丰富度。菌群中英文对照名如下:p__Acidobacteria酸杆菌门,p__Actinobacteria放线菌门,p__Armatimonadetes装甲菌门,p__Bacteroidetes拟杆菌门,p__Chlorobi绿菌门,p__Chloroflexi绿弯菌门,p__Cyanobacteria蓝细菌门,p__Elusimicrobia迷踪菌门,p__Euryarchaeota广古菌门,p__Firmicutes厚壁菌门,p__Fusobacteria梭杆菌门,p__Gemmatimonadetes芽单胞菌门,p__Latescibacteria黏胶球形菌门,p__Lentisphaerae黏胶球形菌门,p__Nitrospirae硝化螺旋菌门,p__Planctomycetes浮霉菌门,p__Proteobacteria变形菌门,p__SHA-109尚无正式译名,p__SM2F11尚无正式译名,p__Saccharibacteria酸杆菌门,p__Spirochaetae螺旋体门,p__Synergistetes互养菌门,p__TA06p__Tenericutes柔壁菌门,p__Verrucomicrobia疣微菌门,p__Unclassified无法分类 图 1 脓毒性休克患者及志愿者肠道菌群门层次分布图 Fig 1 The composition of bacterial microbial at the phylum level in septic shock patients and healthy subjects

在属层次,脓毒症休克组的肠道菌群组成个体差异更加明显。在属层次,本研究共鉴别出29种细菌,仍有较多菌群种类目前技术尚无法进行分类。具体菌群分布见图 2。15例患者未见任意两个患者菌群组成完全相同,具有高度个体化。本研究观察到2号、6号、9号患者的菌群分布中出现单细菌过度繁殖现象,单个细菌的比例在3个患者中均 > 80%,而在健康志愿者中未发现该现象,说明部分脓毒症休克患者肠道菌群稳态被严重破坏。

每个色柱代表 1名志愿者或患者,Relative abundance:相对丰富度,“H”代表志愿者,“P”代表患者,菌群中英文对照名如下:
g_[Eubacterium]_coprostanoligenes_group产粪甾醇真细菌,g_Alistipes另枝菌属,g_Alloprevotella普雷沃菌属,g_Bacteroides脆弱拟杆菌属,g_Christensenellaceae_R-7_group克里斯滕森菌属,g_Collinsella柯林斯菌属,g_Dialister小类杆菌属,g_Enterococcus肠球菌属,g_Escherichia-Shigella大肠杆菌志贺菌属,g_Faecalibacterium普氏粪杆菌属,g_Hungatella甲烷细菌属,g_Intestinimonas肠单胞菌属,g_Klebsiella克雷白杆菌属,g_Lachnoclostridium毛螺梭菌属,g_Lachnospira毛螺旋菌属,g_Megamonas巨单胞菌属,g_Megasphaera巨球型菌属,g_Odoribacter紫单胞杆菌属,g_Parabacteroides副杆菌属,g_Phascolarctobacterium考拉杆菌属,g_Prevotella_2二路普菌属,g_Prevotella_9九路普菌属,g_Pseudobutyrivibrio假丁酸弧菌属,g_Pyramidobacter锥形杆菌属,g_Romboutsia尚无正式译名,g_Ruminococcaceae_UCG-002瘤胃菌科琥珀酸弧菌属002g_Ruminococcaceae_UCG-014瘤胃菌科琥珀酸弧菌属014g_Ruminococcus_2瘤胃菌科属,g_Subdoligranulum罕见小球菌属,g_Unclassified无法分类,g_Uncultured无法培养,g_Uncultured_bacterium无法培养细菌,g_Veillonella韦荣球菌属
图 2 脓毒性休克患者及志愿者肠道菌群属层次分布图 Fig 2 The composition of bacterial microbial at the genus level in septic shock patients and healthy subjects
2.3 肠道菌群特征与患者临床结果关系

对两组菌群特征进行分析发现,两者菌群多样性(香农-威纳指数)差异无统计学意义(P=0.12)。初步分析应用肠内营养、服用益生菌制剂与病死率关系,发现使用肠内营养、服用益生菌制剂不能降低病死率(P=0.59,P=0.58)。对肠道菌群进行β多样性分析,依据每个样本菌群组成及多样性数据绘制相似性树,发现脓毒性休克患者组菌群体具有高度相似性,与健康志愿者明显不同(图 3)。

“H”代表志愿者,“P”代表患者。菌群中英文对照名如下:p__Acidobacteria酸杆菌门,p__Actinobacteria放线菌门,p__Bacteroidetes拟杆菌门,p__Chloroflexi绿弯菌门,p__Firmicutes厚壁菌门,p__Fusobacteria梭杆菌门,p__Proteobacteria变形菌门,p__Synergistetes互养菌门,p__Tenericutes柔壁菌门,p__Verrucomicrobia疣微菌门,p__Others其他菌群 图 3 肠道菌群分类相似性树 Fig 3 Similarity tree of intestinal microbiota classification
3 讨论

本研究发现脓毒性休克患者的肠道菌群结构与健康志愿者不同。脓毒性休克患者虽然细菌多样性与健康志愿者差异无统计学意义,但部分患者出现变形菌门和梭杆菌门过度繁殖现象。此外,本研究发现益生菌和肠内营养的使用对病死率无明显影响,不同脓毒性休克患者肠道菌群具有高度相似性,本研究发现脓毒性休克患者肠道菌群的主要特征如下:(1)细菌菌群多样性与健康志愿者无差异;(2)拟杆菌门和厚壁菌门为肠道主要菌群,但两者比例较健康志愿者均下降,且部分患者有1~2种少见菌过度繁殖;(3)肠道菌群组成具有高度个体化的特点。

肠道菌群对多种疾病的作用及机制是目前研究的热点,目前研究主要集中在糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、肝病、炎症性肠病。但关于脓毒症及脓毒性休克患者肠道菌群组成特点及对预后的影响目前研究仍较少。Lankelma等[9]收集34例ICU患者的肠道粪便,进行菌群分析,发现半数患者肠道菌群多样性下降,且患者肠道菌群多样性与患者预后无关。该研究中多数健康人香农-威纳指数 > 4,而本研究中多数健康人香农-威纳指数 < 4。这可能与东西方饮食习惯、人种不同有关。本研究发现脓毒性休克患者肠道菌群结构与健康志愿者不同,且个别菌属过度繁殖的现象与Lankelma等[12]的研究结果一致。Ojima等[11]分别收集ICU患者入院后1~2 d, 2~4 d, 5~8 d及7~10 d的粪便进行菌群分析,以观测菌群的动态演变,研究发现拟杆菌门和厚壁菌门比例出现动态下降,但该研究仅纳入12例患者。Kozich等[14]纳入14例ICU患者,发现肠道内的微生物环境可导致肠道菌群出现共生或致病的模式。然而所有研究样本量均较小,且均为观察性研究。既往研究曾经对肠道多种生物标志物进行分析,以明确其与临床结果的关系,目前已经进行的研究包括:香农-威纳指数,厚壁菌门/拟杆菌门比率,革兰阳性菌/阴性菌比率[9, 15]。但目前尚无一致结论。

本研究对肠道菌群在属层次进行分析,发现肠道菌群不论在健康志愿者或脓毒症休克患者中均具有高度特异性、个体化,某种程度上类似于人类指纹。目前研究表明ICU患者肠道菌群受肠内营养、抑酸药物、抗生素、机械通气等多种因素影响[10, 16]。本研究发现肠内营养、益生菌的使用对病死率无影响,但本研究为观察性研究,且研究样本量较小,因此其对临床结果的影响需要进一步研究。

本研究采用16S rDNA测序技术对脓毒性休克患者肠道菌群结构与临床预后关系的研究,既往研究多笼统针对ICU患者,并未对单一疾病进行研究,结果较难适用于临床[9, 11, 17]。然而本研究尚有不足之处,一是研究纳入样本量较小,而且每个患者仅收集一次大便样本,无法动态观测菌群演变。二是粪便样本为患者排泄物,可能无法完全反映肠道表面上皮黏膜的菌群结构。

综上所述,本研究表明肠道菌群具有过度个体化,但不同脓毒性休克患者具有高度相似性,特征为种群多样性较高,偶有单细菌种属过度繁殖的现象。

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