新型抑制性细胞因子白介素-35(interleukin 35,IL-35)是最新发现的一种由调节性T细胞(regulatory cells,Treg)特异性产生的白介素12(interleukin 12,IL-12)细胞因子家族新成员, IL-35可扩增Treg细胞数量,诱导产生一种新型Foxp3-Treg——iTR35细胞并促进辅助性T细胞1(Thelper cells 1,Th1)分化,还可以抑制效应性T细胞产生和抑制辅助性T细胞17(Thelper cells 17,Th17)分化,在自身免疫性疾病、病毒感染和真菌感染中发挥着重要作用。IL-35不但对炎症初始阶段有作用,在急性感染期,IL-35通过扩增Treg细胞来清除病原体,也能通过抑制Th17细胞分化来阻止过度的自身免疫反应;对慢性感染阶段同样有效,它是通过IL-35的抑制作用来阻止机体的免疫损伤[1]。脓毒症是宿主对感染的反应失调而致的危及生命的器官功能障碍[2]。
目前对于脓毒症的免疫功能状态认为,早期的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)导致组织和器官的损伤,随着病程时间的延长和疾病程度的加重,患者出现了代偿性抗炎症反应综合征(compensated anti-inflammatory response Syndrome,CARS),并且引起了一系列问题:如继发感染或免疫功能麻痹等。因此,IL-35作为继转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和IL-10之后出现的新抗炎因子,有望成为治疗感染性疾病,尤其是脓毒症及其MODS的靶点。本研究初步阐明新型抑制性细胞因子IL-35在脓毒症合并MODS患者的表达水平,以及其与调节性T细胞及其他炎症因子的相关性,探讨IL-35在脓毒症发生、发展中的可能机制。
1 资料与方法 1.1 一般资料采用前瞻性研究,入选2016年1月至2017年1月福建省立医院收治的脓毒症并MODS患者进行研究,病例组入选标准:①年龄≥18岁;②符合2016年中国脓毒症指南制定的脓毒症诊断标准;③SOFA评分较基线上升≥2分。排除标准:① < 18岁;②6个月内使用过影响免疫功能的药物;自身免疫性疾病;急性心脑血管疾病;慢性肾功能衰竭;血液系统疾病;恶性肿瘤或免疫缺陷疾病等。病例组中男12例,女10例,年龄(66.45±3.83)岁;感染部位:呼吸系统9例,消化系统6例,泌尿系统4例,皮肤软组织1例,其他部位2例;SOFA评分2~6分9例,7~12分11例,13~18分2例,> 19分0例。另选同期本院非感染性正常体检人员20例作为对照组,其中男11例,女9例,年龄(65.75±2.99)岁。该项研究已获福省立医院伦理委员会批准,所有患者及其家属均行告知并签署同意书。
1.2 病例分组根据研究组入选时病情的转归分为存活组(n=14)和死亡组(n=8),及健康志愿者(对照组,n=20)作为对照。
1.3 仪器与试剂全波长酶标仪(美国Thermo公司),紫外分光光度仪(美国Thermo公司), IL-10、IL-4、IL-17、INF-γ及TGF-β等酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德公司产品。CD4、CD25、FOXP3等抗体均购于BD Biosciences。
1.4 标本采集所有患者及对照组在入住本院后即进行急性生理与慢性健康状况(APACHEⅡ)评分及序贯器官衰竭评估(SOFA),并立即抽取10 mL外周静脉血,室温静置20 min后置于离心机中离心30 min,离心速率为3 500 r/min(离心半径7.5 cm),取血清至EP管后保存于-80℃冰箱以备检验使用。同时留取样本,检测CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞表达水平。抽取健康志愿者10 mL外周静脉血,离心后置于-80℃冰箱保存。
1.5 指标检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-35、IL10、IL-4、IL-17、INF-γ及TGF-β,按照说明书进行操作,使用分光光度计进行分析并根据标准曲线计算各指标浓度。采用流式细胞术分析CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞表达水平:用含1%胎牛血清的PBS对淋巴细胞进行洗涤(BSA;Gibco;Thermo Fisher Scientific);与PerCP偶联的抗CD4, PerCP偶联的CD25及FITC偶联的抗CD25在4℃孵育20 min(抗体均购于BD Biosciences);对细胞进行固定,然后再次洗涤并封闭;接着使用PE偶联的抗FOXP3对细胞进行染色60 min,而后上机(FACSCalibur flow cytometer, BD Biosciences);使用FlowJo(version 7.6.1)对数据进行分析。
1.6 统计学方法本研究采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用均数±方差(Mean±SD)表示计量数据。对于方差齐的数据,使用单因素方差分析对各组间的差异进行比较。对于方差不齐的数据,则采用秩和检验进行组间比较。采用线性相关分析对两个连续变量进行Spearman相关分析研究。计数资料的比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况比较脓毒症并MODS组与对照组性别、年龄比较,均差异无统计学意义(P > 0.05)。此外,入组标准已排除基础疾病和近期所用其他药物,故此三组基线指标相对一致,具有可比性,见表 1。
组别 | 例数 | 男性/例(%) | 年龄/岁(Mean±SD) |
研究组 | 22 | 12(54.5)a | 66.45±3.83b |
对照组 | 20 | 11(55.0) | 65.75±2.99 |
注:与对照组性别比较,aP > 0.05;与对照组年龄比较,bP > 0.05 |
在脓毒症并MODS的第1天开始IL-35水平逐步升高,尤其是在第7天的时候升高较前明显(表 2,图 1A)。而且脓毒症并MODS的IL-35水平与非感染患者是有差别的,具有统计学意义(图 1B)。上述结果表明IL-35参与了脓毒症并MODS的病程。
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 37.80±6.76 | 65.94±11.03 | 267.46±83.65ab |
对照组 | 20 | 26.39±18.58 | 26.57±18.68 | 26.58±18.88 |
注:研究组三个时间点的比较,aP < 0.01;个时间点上与对照组的比较,bP < 0.05 |
为探讨IL-35与CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的相关性,首先分析脓毒症并MODS患者的Treg细胞表达情况。结果显示,在脓毒症并MODS患者中,CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞数量增加,尤其在第4天增加明显,如表 3和图 2A。
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 2.09±0.32 | 6.77±0.56 | 4.28±0.44ab |
对照组 | 20 | 0.22±0.10 | 0.25±0.11 | 0.21±0.12 |
注:研究组的各时间点上比较,aP < 0.01;各时间点上与对照组的比较,bP < 0.05 |
对研究组患者第1天样本的IL-35(37.80±6.76)ng/L和CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞水平(2.09±0.32)%进行相关性分析,发现IL-35的表达与Treg细胞呈正相关(r=0.60,P < 0.05)。
2.4 IL-35与其他细胞因子相关性分析在脓毒症并MODS患者中,IL-10、IL-4、IL-17、INF-γ及TGF-β等细胞因子的表达水平随着时间的延长逐渐增高,第7天的表达量水平明显高于第1天及第4天,如表 4~8。
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 1.24±1.33 | 1.17±1.41 | 2.83±2.15ab |
对照组 | 20 | 0.24±.12 | 0.25±0.12 | 0.25±0.12 |
注:研究组的各时间点上比较,aP=0.02;各时间点上与对照组的比较,bP < 0.01 |
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 21.56±22.95 | 19.03±25.23 | 45.63±33.43ab |
对照组 | 20 | 2.57±2.38 | 2.58±2.38 | 2.58±2.38 |
注:研究组的各时间点上比较,aP=0.02;各时间点上与对照组的比较,bP < 0.01 |
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 69.44±70.04 | 63.48±78.56 | 154.43±103.80ab |
对照组 | 20 | 14.25±14.01 | 18.00±14.01 | 20.99±14.05 |
注:研究组的各时间点上比较,aP=0.001;各时间点上与对照组比较,bP < 0.01 |
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 8.64±8.76 | 7.43±10.18 | 18.91±15.82ab |
对照组 | 20 | 1.46±1.70 | 1.46±1.70 | 1.47±1.70 |
注:研究组的各时间点上比较,aP < 0.01;各时间点上与对照组比较,bP < 0.01 |
组别 | 例数 | 第1天 | 第4天 | 第7天 |
研究组 | 22 | 232.99±286.94 | 222.07±358.75 | 503.70±487.35ab |
对照组 | 20 | 21.65±21.64 | 21.73±21.64 | 21.73±21.64 |
注:研究组的各时间点上比较,aP=0.006;各时间点上与对照组比较,bP < 0.01 |
对研究组患者第7天的样本进行分析,发现IL-35与IL-10相关系数r=0.38,P=0.08;与IL-4相关系数r=0.34,P=0.12;与IL-17相关系数r=0.40,P=0.06;与INF-γ相关系数r=0.47,P=0.03;与TGF-β相关系数r=0.45,P=0.04。上述结果表明,在脓毒症并MODS患者中IL-35细胞因子的表达水平与INF-γ、TGF-β细胞因子呈正相关,而与IL-10、IL4、IL-17等细胞因子的表达无明显关系。
2.5 IL-35指标水平的预后诊断价值分析为了研究IL-35在MODS患者中的对疾病的转归是否具有预测价值,根据患者入院后28d生存结局,将22例患者分存活组(n=14)和死亡组(n=8)。结果表明,死亡组患者的IL-35水平明显低于存活组,且差异有统计学意义(P < 0.05),表明IL-35水平越高表明患者预后则相对较好.见表 9及图 3A。将存活组和死亡组患者的IL-35水平进行ROC曲线分析,得ROC曲线,如图 3B。曲线下面积AUC=0.78(P=0.03), 提示该指标的预测价值较好, 有一定的实践意义。对研究组患者IL-35与APACHE-Ⅱ评分(8.18±3.97)进行相关性分析,同样发现IL-35与APACHE-Ⅱ评分呈负相关(r=-0.78,P < 0.01)。
如本实验结果所示,与健康对照组相比,脓毒症并有多器官功能不全的患者随着炎症的进展,促炎因子INF-γ表达水平也随之增高,与此同时抗炎因子IL-35,以及IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因子也随之增高。这些变化的细胞因子存在一定的关系;IL-35细胞因子的表达水平与INF-γ、TGF-β细胞因子呈正相关,而与IL-10、IL4、IL-17等细胞因子的表达无明显关系。这些提示这些炎症因子一起参与的脓毒症并脏器功能不全的发生过程,起到了一定的促进与调节作用。MODS的病理进程一般分为两个阶段,即早期及晚期。在早期,过度表达的炎症调节因子导致白细胞激活,增加内皮细胞的渗透性及多形核中性粒细胞的黏附和迁移。在脾脏、肝脏及血中的炎症因子制造了第一轮细胞因子风暴[3-4],如实验中所示的INF-γ表达情况。当初始感染或者生理损伤一旦促发白细胞及单核细胞释放促炎因子(包括IL-1β,INF-γ),循环的细胞因子可激活内皮细胞,并且促进内皮细胞性白细胞黏附因子1(endothelial-leukocyte adhesion molecule-1,ELAM-1)的表达,及血管细胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达[5-7]。这些因子可增加T细胞、单核细胞及多形核中性粒细胞的对内皮细胞的黏附性。淋巴细胞的激活可产生活性氧及其他炎症因子的释放,包括细胞因子,前列腺素类、白细胞三烯及蛋白酶。细胞因子,淋巴细胞产生的ROS、及细胞毒性T细胞可以促发急性炎症反应,并诱导内皮损伤[8]。不同器官对内皮损伤的耐受也不尽相同。在晚期病理阶段,存在于各细胞间的固有炎症细胞在实质损伤的阶段都发挥了重要的作用。激活的淋巴细胞、分泌的细胞因子、固有炎症细胞促发并放大了胞间隙的炎症反应。在富含淋巴细胞及巨噬细胞的器官中,高浓度的细胞因子增加淋巴细胞的浸润[9]。在被激活后,多形核淋巴细胞和巨噬细胞可产生ROS,其对细胞实质的损伤起重要作用。有一些报道也表明,在淋巴细胞缺少症的患者中也存在器官功能紊乱,其可能原因是某些细胞因子浓度的提高直接导致了实质的损害[10]。进入血循环的细胞因子可通过激活远隔器官的固有炎症细胞从而导致损伤[11]。因此,在脓毒症的发病过程中机体并非处于一成不变的免疫激活状态,负向调控(negative regulation)机制在脓毒症的发生与发展中也发挥着重要作用[12-14]。
IL-35作为最新发现的免疫抑制细胞因子,具有两大生物学功能:①抑制Thl7细胞的发育、增殖,抑制IFN-γ、IL-17分泌。本研究中也发现IFN-γ随着病程的延长,表达量也增高,与IL-35成正相关性,可能与Thl7细胞的分化受其他因素的调控有关,如:分化过程中的IL-23等相关细胞因子及途径与信号通路[15-17],仍有待进一步深入研究。②可诱导Treg大量产生,这种Treg细胞不依赖Foxp3,它可分泌大量的IL-35,又具有天然型调节T细胞(CD4+CD25+Treg)的免疫调节功能,把这种T细胞又称为诱导型Treg(iTR35)。与传统意义上的T淋巴细胞相比,活化的iTR35显著上调IL-35分子两个亚基EBl3和IL-12A的表达,并不需要IL-10和TGF-β参与。这发现与本研究结果相一致,在脓毒症并多器官功能不全的病程中,随着疾病的发展,CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞表达量增加,尤其在第4天增加明显,与IL-35的表达水平呈正相关。IL-35的表达水平与TGF-β正相关,均具有统计学意义。这与活化的Treg细胞能够分泌TGF-β因子,后者又是诱导Treg细胞活化有关。然而,本研究发现研究组的IL-35与IL-4、IL-10、IL-17等细胞因子无明显相关,可能原因在于IL-35对于全身炎症反应的影响与其他细胞因子网络的作用机制并不相同,还有另一种原因可能为IL-35可在自身或者IL-10等因子作用下通过正反馈调节产生更多的IL-35,而其他因子并未出现类似的正反馈调节,正反馈调节作用可能影响了IL-35与其他细胞因子的相关性。
本研究还显示脓毒症病程第1及第4天的患者血清IL-35水平变化并不明显,而在第7天出现急剧升高。有研究表明,IL-35由CD4+CD25+FOXP3+Tregs细胞直接分泌[18]。还有研究显示,由IL-35诱导的iTr35细胞也能够分泌IL-35[19]。同时本研究发现,研究组的CD4+CD25+FOXP3+Tregs细胞在第4天比例增加,并在第7天仍保持一个较高的水平,与IL-35在第4~7天的急剧增加相吻合。根据患者生存结局可看出死亡组IL-35水平明显低于存活组,且其水平与APACHE Ⅱ评分成负相关。已有大量研究显示脓毒症患者APACHEⅡ评分越高,预后越差,由此可以推断IL-35水平与APACHEⅡ评分一样能反映脓毒症患者的预后。并且从ROC曲线图可知曲线下面积AUC=0.78(P < 0.05), 提示该指标的预测价值较好。
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