中华急诊医学杂志  2019, Vol. 28 Issue (2): 131-134   DOI: 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.02.001
自噬在脓毒症免疫反应中的潜在作用与意义
张卉1 , 冯永文2 , 姚咏明1     
1 解放军总医院第四医学中心创伤研究中心,北京 100048;
2 深圳市第二人民医院重症医学科,518035

脓毒症是机体对感染反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。迄今为止,脓毒症仍是ICU的首要死亡原因[1]。除了传统的液体复苏、抗感染处理、对症支持疗法外,脓毒症尚无行之有效的治疗方法。近年来的资料提示,脓毒症病情进展过程中,机体出现免疫反应失调,持续的免疫抑制状态易引发二次感染,最终导致多器官功能障碍。脓毒症时免疫系统的显著特征是,促炎细胞因子和抗炎细胞因子分泌失衡,同时伴有大量免疫细胞的缺失,由此造成免疫反应低下,诱发免疫抑制现象[2]。最近研究发现,脓毒症时免疫细胞中出现明显的自噬(autophagy)活化现象,同时自噬过程的动态变化参与调节免疫反应,其活化程度与脓毒症的预后密切相关。

1 脓毒症时自噬的活化

细胞自噬是真核生物对细胞内物质进行周转的重要过程。自噬能清除不正常构型的蛋白质、受损和多余的细胞器。这些“异物”被双层膜结构包裹形成自噬体,送入溶酶体中进行降解并得以循环利用。在饥饿、衰老、新生儿发育等过程中,自噬在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。在机体受到病原菌侵袭时,各器官细胞中的自噬还可能参与细胞内的抗原识别和消化过程[3]

在脓毒症早期,多器官细胞中即可观察到自噬体形成增多,自噬相关蛋白表达增强,表明自噬过程被活化。动物实验证实,盲肠结扎穿孔(CLP)术后6 h,多个器官中自噬标志蛋白LC3表达开始明显上调。病原菌感染时,损伤相关分子模式(DAMP)和病原相关分子模式(PAMP)通过Toll样受体(TLR)4或TLR9激活核因子(NF)-κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路,直接调控自噬相关蛋白的表达,或通过Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTORC)通路激活自噬[4]。自噬是一个动态过程,在不同器官细胞,和脓毒症不同时期,自噬相关蛋白的表达形态不尽相同,例如,小肠上皮细胞中LC3的表达在CLP术后8 h达峰值,而在肾组织中LC3在6 h和36 h呈现双峰表达[5]。这可能与各器官对感染的反应时间及自我调节能力相关。但可以肯定的是,自噬在脓毒症状态下对靶器官细胞发挥重要保护效应。

除了在靶器官细胞中调节代谢,维持线粒体、内质网稳态作用,自噬对免疫反应的调控也是影响脓毒症预后的重要因素。

2 自噬对免疫反应的影响

脓毒症时,机体免疫紊乱表现在多个方面,包括天然免疫系统和获得性免疫系统功能障碍。天然免疫系统主要由中性粒细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞(DCs)组成,不仅可以直接吞噬清除病原菌,还能通过分泌多种细胞因子调节免疫反应,激活获得性免疫系统。获得性免疫系统主要由T、B淋巴细胞构成,活化的淋巴细胞大量增殖,并分泌细胞因子和抗体。研究发现自噬在多种免疫细胞中均具有重要调控作用,自噬相关蛋白缺陷小鼠对病原菌清除能力明显下降,更易出现免疫功能障碍。

2.1 自噬对天然免疫系统的影响 2.1.1 中性粒细胞

中性粒细胞具有吞噬清除病原菌的作用,并在炎症部位形成中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)捕杀病原菌,控制感染播散。中性粒细胞的趋化和激活需要多种细胞因子和趋化因子参与。低剂量内毒素可以通过TLRs途径促进细胞因子释放,介导中性粒细胞的迁移活化。在严重感染或大量内毒素刺激时,机体往往产生过量的细胞因子和趋化因子,如较高水平的肿瘤坏死因子(TNF)-α具有抑制趋化因子(CXC)受体CXCR1和CXCR2表达的作用,中性粒细胞的迁移能力反而受到抑制[6]。因此,严重脓毒症时中性粒细胞迁移能力下降,更易造成组织器官损伤。

有资料显示,脓毒症时磷酸化酶PTEN活化,通过激活下游Akt/mTOR信号途径介导自噬的发生。自噬促进中性粒细胞脱颗粒,诱导NETs的形成。其中自噬和氧自由基(ROS)间的相互调节发挥重要作用。NADPH氧化还原酶缺乏的患者,中性粒细胞生成NETs的能力有限。利用mTOR抑制剂可以观察到,自噬被有效激活的同时NETs形成明显。而使Atg5表达沉默可显著阻断NETs的形成[7]。自噬也参与调控中性粒细胞的趋化和浸润能力。动物实验证实,诱导自噬后中性粒细胞浸润减少,肺损伤减轻,动物生存率提高。反之,在自噬关键调节蛋白Atg4敲除小鼠中,脓毒症所致肺损伤情况更加严重,动物病死率明显增加。自噬还可能通过TLRs信号通路调控炎性细胞因子的表达,进而影响中性粒细胞的迁移能力[8]。此外,细胞内自噬和凋亡过程之间存在着微妙的平衡和相互制约关系。自噬活化时凋亡减少,这也是中性粒细胞数目稳定的关键因素[9]

2.1.2 单核-巨噬细胞

单核-巨噬细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,构成人体抵御病原菌侵袭的第一道防线。机体受到外源性病原菌侵袭时,或自身组织损伤时所释放的DAMP和PAMP激活单核-巨噬细胞,发挥其吞噬作用以清除病原菌,并且分泌促炎细胞因子,如TNF-α等。目前的观点认为,脓毒症病理过程中促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的平衡是决定机体免疫状态、影响预后的关键所在。脓毒症初期单核-巨噬细胞过度活化,促炎细胞因子大量分泌是影响预后不良的因素。随病情进展,抗炎细胞因子水平明显升高,抑制单核-巨噬细胞功能,清除病原菌和分泌促炎细胞因子的能力下降,以致机体呈现免疫抑制状态,易于遭受二次感染,导致器官功能障碍甚至死亡。因此,体内单核-巨噬细胞的适度活化对脓毒症预后具有重要意义。

吞入细胞内的抗原片断不仅能够直接激活自噬,还可通过NF-κB等信号通路活化[10]。反之,自噬亦可影响单核-巨噬细胞功能。在脓毒症病程进展中,自噬随免疫反应的变化也呈现不同的活化状态,以维持细胞稳态,调节机体免疫应答。例如,在脓毒症早期机体处于过度炎症反应阶段,巨噬细胞中自噬活性受抑,伴有大量促炎细胞因子分泌。此时,如果激活自噬可以抑制促炎细胞因子过度分泌,维持炎症反应的平衡。研究证实,自噬通过调控NF-κB通路和炎症小体形成,调节细胞因子的产生,发挥其抗炎效应。当机体处于免疫抑制状态时,如果活化自噬则增强单核-巨噬细胞的吞噬活性。据报道,自噬活性与脓毒症动物的生存率呈正相关[11]。但也有动物实验观察到,利用喹诺酮抑制自噬后,NF-κB通路活化、晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1(HMGB1)分泌受到抑制,小鼠生存率反而提高[12]。由此推测,自噬对NF-κB信号通路的调节呈双向性,而NF-κB亦可通过mTOR或调控自噬相关蛋白表达,反馈性调节自噬活性。自噬与NF-κB通路间的相互作用十分复杂,在疾病的不同阶段,甚至不同病原菌感染都可以表现出不同的活化作用。许多研究提示,脓毒症病理生理过程中,自噬具有保护单核-巨噬细胞功能的作用。在充分了解自噬活化特点的基础上,以自噬活性为靶点的治疗手段可能有助于调控机体免疫反应状态。

2.1.3 树突状细胞

DCs是重要的抗原提呈细胞,具有连接天然免疫系统和获得性免疫系统的作用。在病原微生物侵袭后,天然DCs通过吞噬识别不同的病原微生物,继而成熟活化并表达多种表面分子,包括CD40、CD80、CD86和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ等。成熟DCs进一步与T淋巴细胞结合,通过表面分子的作用促进其增殖和分化。脓毒症发生后,DCs数目和功能均发生明显变化。动物实验证实,CLP后12 h脾脏和肠系膜淋巴结中的DCs明显减少。同样,在严重脓毒症患者体内观察到类似现象,外周血DCs与健康人相比数目明显下降[13]。DCs功能障碍主要表现在两个方面,表面分子表达水平降低和细胞因子分泌水平下降,这是导致T淋巴细胞增殖和功能异常的重要原因,是脓毒症免疫功能紊乱的关键因素之一。有资料显示,内毒素注射后48 h,小鼠脾脏DCs表达CD80、CD86和MHC Ⅱ水平即显著降低,同时细胞因子白介素(IL)-12和TNF-α水平也下降,其抗原提呈能力明显减弱。与之相似,脓毒症患者外周血DCs表面人类白细胞抗原(HLA)-DR和CD86表达也降低[14]。目前HLA-DR水平已经成为评价患者免疫状态和预后的重要指标,IL-12等由DCs分泌的细胞因子,通过间接方式影响T淋巴细胞的增殖分化和功能。此外,DCs表达共抑制分子——程序性死亡分子(PD)-1,在脓毒症时其表达水平增加,通过直接作用抑制T淋巴细胞免疫效应。

自噬对DCs的成熟和功能具有重要影响。首先,自噬对DCs表达MHC Ⅱ分子发挥调节作用。免疫荧光染色发现,由单核细胞诱导分化的DCs中,自噬体与MHC Ⅱ分子相互融合,促进其提呈至细胞表面[15]。饥饿条件下或使用雷帕霉素,自噬可以被激活,此时DCs表达MHC Ⅱ增多。经雷帕霉素处理的DCs免疫小鼠后,T淋巴细胞的激活更加明显[16]。而在Atg16、Atg7或Beclin-1等自噬关键蛋白缺失的条件下,自噬过程受到抑制,DCs促进T淋巴细胞活化功能受到影响[17]。不同自噬相关蛋白缺失对DCs免疫功能的影响也有所差异,例如,Beclin-1缺失时MHC Ⅱ和促炎细胞因子表达降低,导致T淋巴细胞向辅助性T细胞(Th)2漂移;Atg16L沉默后DCs会产生大量氧自由基,并影响抗原提呈能力;在器官移植后,Atg16L可以抑制T淋巴细胞引起的同种异体排斥反应[18]。虽然,有关脓毒症状态下自噬对DCs的确切影响尚不清楚,但基于以上资料分析,笔者认为自噬在调节DCs功能中可能具有潜在作用和意义。

2.2 自噬对获得性免疫系统的影响

T淋巴细胞是构成获得性免疫系统的重要细胞之一,根据其分泌细胞因子不同,可以为成多个亚群:Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)。脓毒症时Th细胞大量凋亡,出现功能障碍,并且与预后密切相关。临床研究证实,脓毒症死亡患者体内出现大量凋亡的CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞。除此以外,Th细胞的分化障碍也是导致免疫功能异常的重要因素。Th1细胞主要分泌IL-1β、TNF-α和干扰素(IFN)-γ,具有重要的促炎效应;Th2细胞则分泌抑制性细胞因子IL-4、IL-5和IL-10,发挥抗炎效应。脓毒症时Th细胞具有向免疫抑制性Th2型细胞分化的趋势,其中Treg的作用不容忽视。Treg通过表达叉头翼状螺旋转录因子(Foxp)3、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4等表面分子直接作用于Th细胞,或者通过分泌IL-10和转化生长因子(TGF)-β等间接促进Th细胞向Th2型分化。研究证实,适当减少Treg的数目,有利于脓毒症时Th1细胞增殖分化,维持正常的免疫反应[19]

诸多研究表明,T淋巴细胞中自噬具有保护其功能的重要作用。Atg7敲除小鼠在脓毒症后出现大量T淋巴细胞凋亡,病死率也明显增加[20]。生理条件下,抑制自噬过程后T淋巴细胞凋亡相关蛋白BCL2L11和抑制性分子PD-1表达上调;而激活自噬则抑制细胞凋亡,自噬与凋亡间存在着精密的相互调节作用,直接影响细胞的存亡。在T淋巴细胞中,自噬可能是通过NF-κB信号通路影响凋亡,有研究发现增强NF-κB活性能阻止T淋巴细胞的凋亡,降低脓毒症小鼠的病死率[21]。自噬还可以影响T淋巴细胞分泌细胞因子的能力。例如,抑制自噬后T淋巴细胞分泌抗炎细胞因子增多(包括IL-10),从而反馈性促进T淋巴细胞向Th2漂移[22]。在Atg16敲除小鼠中,同样观察到大量增殖的Th2细胞。反之,激活自噬可能通过影响细胞的代谢,进而阻止T淋巴细胞向Th2分化[23]

除此之外,自噬同样可以影响Treg的存亡和功能。在Atg7或Atg5敲除的Treg细胞中发现,Foxp3表达明显减弱,凋亡细胞增多,这可能由于自噬受到抑制后T细胞受体(TCR)/mTORC1信号通路过度活化所致。体外实验显示,由TCR激活的mTORC1是调节Treg功能和存亡的关键信号分子,抑制mTORC1后Treg的凋亡显著增加[24]。炎症反应中,Notch1通过与Beclin-1、Atg4结合也可以影响Treg的凋亡。研究提示,脓毒症时自噬参与了Treg功能的调节过程,以此为靶点的治疗可能通过抑制亢进的Treg功能,维持正常T淋巴细胞的增殖分化,从而有助于调整免疫紊乱状态。

3 问题与展望

脓毒症状态下,自噬对免疫细胞应答的确切影响和临床意义亟待澄清。由于脓毒症病理生理过程非常复杂,不同阶段多种免疫细胞功能呈现动态变化;且自噬本身也是一个动态改变过程,没有单一的标记物可以全面反映完整的自噬过程,因此很难描绘脓毒症时免疫系统自噬的整体变化规律与精确调控机制。但是基于大量在自身免疫疾病、感染性疾病和肿瘤方面的研究结果,笔者认为,自噬在免疫细胞稳态和功能调节中可能发挥至关重要的作用。在今后深入研究的基础上,明确脓毒症不同时期自噬变化的特点和意义,并以此为靶点进行适当干预,可能是维持细胞稳态、调节免疫反应、防止免疫紊乱的潜在临床治疗策略。同时,开发更加特异高效的自噬调节手段和药物,也是脓毒症研究的重要方向之一。

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