脓毒症(sepsis)是机体对于病原体感染而发生的全身炎症反应综合征,进一步发展可导致脓毒性休克(septic shock)、多脏器功能不全(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等,是ICU危重症患者主要死亡原因之一[1]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)最初被发现是一种DNA结合蛋白,是介导感染、创伤时炎症反应的细胞因子之一。研究表明,HMGB1作为重要的晚期炎症因子,在脓毒症发病的过程中,可活化血管内皮细胞,破坏内皮细胞屏障,导致组织器官水肿[2]。此外,脓毒症发病过程中,T淋巴细胞增殖能力下降,数目减少,出现了以白介素(IL)-4和IL-10生成增加为特征的Th2型免疫反应,最终导致机体免疫抑制状态,亦是脓毒症发生和发展的重要因素[3]。普通肝素(unfractionated heparin, UFH)是一种临床上常用的氨基葡聚糖,除其具有强大的抗凝功能外,还具有改善炎症的作用[4],但至今其机制不完全明确。本研究旨在探讨HMGB1对人脐静脉内皮细胞屏障通透性的影响,以及普通肝素对HMGB1介导的内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5下调的保护作用。
1 材料与方法 1.1 主要仪器及材料人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVECs)株,购于南京凯基生物科技发展有限公司。0.25%胰蛋白及DMEM培养液购于Gibco公司。肝素钠购于中国南京新百药业有限公司。人重组HMGB1(recombinant human high-mobility group box 1, rhHMGB1)购于美国Proteintech公司。Transwell聚碳脂膜购于Costar公司;兔抗人Claudin-5抗体购于Abcam公司;DAPI标记的山羊抗兔IgG购于北京中山金桥公司;BCA蛋白定量试剂盒及细胞蛋白抽提试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 内皮细胞培养与分组将经胰酶消化后的人脐静脉内皮细胞加入3~5 mL含有10%胎牛血清DMEM完全培养液(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)中,置于细胞培养箱中培养(5%CO2、37 ℃),约2~3 d后铺满,细胞传代,待细胞铺满至80%用于实验。细胞分成4组(n=3):空白对照组(加入等量PBS)、rhHMGB1处理组(100 ng/mL)、普通肝素对照组(UFH 10 U/mL)、rhHMGB1+普通肝素处理组(100 ng/mL rhHMGB1 + UFH 10 U/mL)。
1.2.2 细胞存活率的检测将内皮细胞接种于96孔培养板中(浓度为1×104个/孔),置孵箱24 h后内皮细胞呈单层生长,加入不同浓度的rhHMGB1(分别为0、10、50、100、150 ng/mL)处理,继续孵育24 h。每孔加入20 μL MTT并培养4 h后,加入DMSO(二甲基亚砜)150 mL,充分振荡10 min,利用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度值(A)。
1.2.3 内皮细胞屏障通透性的测定人脐静脉血管内皮细胞种植于24孔Transwell上层小室,每孔按1×105个细胞密度种植,加入DMEM液100 μL,同时下室中加入600 μL的DMEM,培养24 h,待细胞生长融合成单层内皮细胞后,更换无血清DMEM 4 h后再进行通透性研究。随机将24孔细胞分组,每组为3孔,分别给与上述处理因素,同时加入含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖FD 40,将细胞培养4~5 min后,抽取下室200 μL培养液做为基础值。分别处理3 h,6 h,12 h及24 h后,抽取下室200 μL培养液,经荧光分光光度计(测定波长520 nm、激发波长492 nm)测定FD40荧光强度。FD40的荧光强度为各组实验测量值与其基础值的差值,每组实验重复3次,并取其平均数。
1.2.4 Claudin-5免疫荧光染色细胞贴壁生长至对数生长期,内皮细胞经0.25%胰蛋白酶消化,将细胞悬液(1×105个/孔)接种于盖玻片上。至细胞贴壁融合至80%后,予不含胎牛血清的DMEM液培养24 h,待细胞同步化后,分别给予前述不同处理因素,继续培养24 h;4%多聚甲醛固定30 min,1%BSA室温下封闭1 h,加入兔抗人Claudin-5抗体;室温孵育1 h,PBS浸洗3次,加入DAPI标记的山羊抗兔IgG,室温下避光孵育1 h;再次用PBS洗3次;50%甘油封片照相。
1.2.5 Western-blot检测Claudin-5表达细胞分组培养同前,给予相应处理后提取蛋白,BCA蛋白定量法测定蛋白浓度,调整各标本至相同的蛋白浓度。蛋白变性后经SDS-PAGE电泳,转印于PVDF膜上;5%BSA中4 ℃封闭过夜;加入兔抗人Claudin-5抗体(1:200),放入4 ℃冰箱孵育过夜;加入DAPI标记山羊抗兔IgG(1:100),室温下2 h后显色,应用Image J图像分析软件测定每条蛋白电泳带的灰度值。
1.3 统计学方法使用SPSS 22.0进行统计学分析;计量资料用均数±标准差(x±s)表示。两样本组间比较采用t检验,多样本组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 人脐静脉血管内皮细胞的形态观察正常人脐静脉血管内皮细胞边界清楚,细胞间相互连接紧密,排列紧密,似鹅卵石或铺路石样,胞质丰富,无伪足及突起(图 1A);经rhHMGB1(100 ng/mL)处理24 h后,内皮细胞于光镜下观察形态无明显改变(图 1B)。
2.2 不同浓度rhHMGB1处理后内皮细胞存活率变化与空白对照组比较,不同浓度的rhHMGB1处理血管内皮细胞24 h后,内皮细胞的存活率均无显著影响(P > 0.05),见表 1。
组别 | A490 (x±s) | P值 |
空白对照组 | 0.253±0.006 | |
rhHMGB1:10 ng/mL | 0.233±0.002 | > 0.05 |
rhHMGB1:50 ng/mL | 0.263±0.003 | > 0.05 |
rhHMGB1:100 ng/mL | 0.229±0.002 | > 0.05 |
rhHMGB1:150 ng/mL | 0.233±0.008 | > 0.05 |
经rhHMGB1(100 ng/mL)处理3 h、6 h,内皮细胞屏障通透性无明显变化(P > 0.05);但随着rhHMGB1处理时间延长,内皮细胞屏障通透性开始明显增高,并随着时间的增加而增加,其中第12 h及24 h与空白对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。普通肝素与rhHMGB1共同孵育内皮细胞后,12 h及24 h内皮细胞屏障通透性均低于rhHMGB1处理组(P < 0.05),见表 2。
组别 | FD40荧光强度(x±s) | |||
3 h | 6 h | 12 h | 24 h | |
空白对照组 | 4.42±0.43 | 5.30±0.51 | 5.99±0.41 | 6.35±0.40 |
rhHMGB1处理组 | 4.49±0.39 | 6.04±0.40 | 10.56±0.80a | 11.08±0.14a |
普通肝素对照组 | 4.22±0.28 | 5.31±0.39 | 6.86±0.64ab | 7.40±0.37ab |
普通肝素+ rhHMGB1处理组 | 4.24±0.31 | 5.19±0.06 | 8.83±0.66ab | 9.13±0.23ab |
注:与空白对照组比较,aP < 0.05;与rhHMGB1处理组比较,bP < 0.05 |
正常情况下,Claudin-5存在于血管内皮细胞周边,分布清晰、连续;经100 ng/mL rhHMGB1处理24 h后,Claudin-5在细胞周边分布模糊、断裂状,细胞间出现明显裂隙,边缘模糊,表明细胞间连接中断;给予普通肝素和rhHMGB1共同处理后,Claudin-5的荧光强度较rhHMGB1处理组明显增强,Claudin-5细胞间断裂减少,见图 2。
2.5 Western Blot检测Claudin-5表达如图 3所示,经rhHMGB1处理后,Claudin-5蛋白表达较肝素组及PBS对照组减少。经普通肝素处理后,Claudin-5表达较rhHMGB1处理组有所增加。
3 讨论血管内皮细胞在维持血管张力、水电解质平衡、细胞转运、凝血功能等方面具有重要作用[5],血管内皮细胞连接主要有缝隙连接、黏合体、紧密连接、粘附连接等4种连接方式[6]。脓毒症时,内皮细胞释放大量的HMGB1,可激活内皮细胞中的核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)并促进其核易位,导致炎症介质大量释放,可导致内皮细胞活化,内皮细胞骨架肌动蛋白重组,紧密连接蛋白和粘附连接蛋白等表达和分布发生改变,引发血管通透性增加[7-8]。研究表明HMGB1与内皮细胞表面受体,如糖基化终末产物受体(RAGE)、Toll样受体等结合,参与炎症反应[6-8]。因此在脓毒症治疗方面,抑制HMGB1活性,改善血管内皮细胞屏障完整性具有重要意义[9-10]。研究表明HMGB1的氨基末端有与普通肝素结合的共同序列[11-12],普通肝素可通过抑制HMGB1与RAGE的相互作用,促进内皮细胞形成及血管再生[13-15]。
本研究采用Transwell法测定内皮细胞屏障通透性,经rhHMGB1(100 ng/mL)分别处理细胞3 h、6 h,内皮细胞屏障通透性无明显变化(P > 0.05);但随着rhHMGB1处理时间延长,内皮细胞屏障通透性开始明显增高,并随着时间的增加而增加,其中第12 h及24 h与空白对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。而普通肝素与rhHMGB1共同孵育内皮细胞12 h及24 h后,内皮细胞屏障通透性均低于rhHMGB1处理组(P < 0.05),研究证实了内皮细胞在rhHMGB1刺激下,细胞屏障通透性有所增加,而普通肝素与rhHMGB1共同孵育,可改善内皮细胞屏障通透性。内皮细胞间紧密连接蛋白表达和分布的改变,可影响内皮细胞屏障通透性,内皮细胞之间的紧密连接,调节血管内外物质的交换,防止血管内血液和其他成分的外漏[16]。紧密连接蛋白Claudin-5具有氨基和羧基末端的跨膜蛋白[17];炎症反应时,内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5表达和分布的改变,可影响内皮细胞屏障的通透性[18]。本研究显示,应用免疫荧光法测定Claudin-5的分布与表达,对照组紧密连接蛋白Claudin-5完整,线条清晰;经rhHMGB1(100 ng/mL)处理后,Claudin-5明显断开,荧光强度明显减弱;而经普通肝素和rhHMGB1共同孵育后,Claudin-5荧光强度较HMGB1处理组明显增强,线条更加连续,清晰。应用Western-blot法检测Claudin-5蛋白表达,实验结果表明经rhHMGB1处理后,Claudin-5蛋白表达较对照组减少;而经普通肝素和rhHMGB1共同处理后,细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5表达较rhHMGB1处理组有所增加。
综上所述,本研究结果表明,HMGB1可通过介导内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5的分布异常和表达下降,增加内皮细胞屏障通透性;普通肝素可改善HMGB1介导的内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5的表达和分布,改善内皮细胞屏障通透性。
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