百草枯是一种有机杂环类非选择性的除草剂,目前在我国的农村地区使用非常广泛,近年来随着百草枯的大规模应用,人畜发生中毒的事件时有发生,人畜一旦误服,病死率高达90%[1]。研究显示当人畜发生百草枯中毒时,机体内的多种脏器会发生不同程度受损[2]。Ren等[3]发现在肺中浓度最高,可直接导致人畜发生呼吸困难,急性肺水肿等现象,目前的临床对症处理效果极差,偶有存活的患者,但普遍存在肺间质纤维化,且患者的预后很差。全身炎症反应综合征是百草枯中毒的最为常见的并发症,是通向机体内多个脏器发生功能衰竭综合征的转折点,在此过程中往往伴随着大量的细胞凋亡[4],提示炎症应激反应和细胞凋亡作用可能参与了百草枯中毒过程。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteine aspartic acid protease)是细胞凋亡的重要传导通路,Caspase-3作为细胞凋亡途径中最为重要的执行因子之一,其表达水平间接反映了细胞的凋亡状况[5]。本研究通过观察血必净对百草枯中毒大鼠肺组织中Caspase-3表达以及血浆中炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平的影响,探讨百草枯中毒引起的急性肺损伤的可能作用机制,现报道如下。
1 材料与方法 1.1 动物及分组50只健康SD大鼠购于成都达硕实验动物有限公司,体重160~240 g,随机(随机数字法)编号分为5组,即正常组(Control),百草枯中毒组(Paraquat),低剂量血必净组(LD),中剂量血必净组(MD),高剂量血必净组(HD),每组10只。
1.2 试剂耗材血必净购于上海研谨生物科技有限公司,百草枯溶液购于英国先正达有限公司,氯化硝基四氮唑兰(NBT)购于上海浩然生物技术有限公司,Caspase-3兔多克隆抗体购于上海信裕生物科技有限公司,SABC法免疫组化染色检测试剂盒购于上海三抒生物科技有限公司,一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒升级装购于江苏凯基生物技术股份有限公司,炎症因子TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒均购于上海康朗生物科技有限公司。
1.3 动物造模及干预百草枯中毒组,低剂量血必净组,中剂量血必净组和高剂量血必净组的SD大鼠一次性灌胃25 mg/kg的百草枯溶液,共计1 mL,建立百草枯中毒大鼠动物模型,正常组的SD大鼠给予同等剂量的生理盐水灌胃。低剂量血必净组,中剂量血必净组和高剂量血必净组大鼠在灌胃后3 h进行腹腔注射血必净溶液,浓度分别为14 μmol/kg,28 μmol/kg,56 μmol/kg,1 mL,正常组和中毒组大鼠给予同等剂量的生理盐水腹腔注射。密切观察实验动物的饮食、精神、行为、呼吸等一般情况以及存活情况。
1.4 取材和制备样本在中毒24 h后麻醉实验动物,腹部碘消毒后分离腹主动脉,抽取主动脉血抗凝处理,4℃下2 000 r/min离心5 min,收集上层血清置于EP管,分为两份,一份采用ELISA法检测TNF-α、IL-6水平,一份置于-80℃下保存备用。处死实验动物,打开胸腔,取右肺洗净后置于福尔马林溶液中固定,石蜡包埋后切片,免疫组化检测Caspase-3表达以及TUNEL法检测细胞凋亡。
1.5 ELISA法检测TNF-α、IL-6水平严格参照ELISA试剂盒中的操作说明进行实验。在室温中平衡各试剂,设置对照,加酶结合物,孵育0.5 h,清洗拍干,重复操作5次,加两种显色剂混匀孵育,并加终止液,450 nm波长测量吸光度值,绘制标准曲线,计算出血清中TNF-α、IL-6的含量。
1.6 免疫组化法染色按照试剂盒中的操作说明进行免疫组化检测。将右肺组织块进行石蜡包埋处理,石蜡切片脱蜡,水化,PBS冲洗。阻断15 min,室温下10%血清封闭非特异性背景15 min,加入一抗(Caspase-3单克隆抗体),4℃冰箱过夜。取出后PBS冲洗,加入生物素标记的二抗,室温孵育半小时后冲洗。链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液室温孵育半小时后再次冲洗,DAB显色后冲洗,复染封片,观察。在光学显微镜下观察发现Caspase-3阳性细胞的胞质呈现出棕褐色或者棕黄色状态,每张切片取3个视野,图像分析软件分析每张切片的灰度值,取均值作为该组阳性细胞平均灰度值。
1.7 TUNEL法检测细胞凋亡严格参照一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒操作步骤进行实验,用二甲苯和梯度酒精浸泡清洗,室温条件下蛋白酶K孵育后清洗干燥,加50μL TNNEL液,室温暗湿盒孵育1 h后清洗,加50μL转化型-POD,暗湿盒中孵育0.5 h,清洗后加100μL DAB底物,室温孵育10 min后清洗,复染后脱水,二甲苯透明并封片荧光显微镜观察。正常细胞呈淡绿色荧光,凋亡细胞呈黄绿色荧光,取5个视野拍照,每张照片中计算100个细胞中TUNEL染色阳性细胞数,进而计算凋亡指数(apoptotic index, AI)。
1.8 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)来表示,两组间和多组间的统计分析分别使用成组t检验和单因素方差分析,以P < 0.05为统计检验标准。
2 结果 2.1 五组大鼠血浆中TNF-α、IL-6水平百草枯中毒组大鼠血浆中TNF-α、IL-6水平较对照组大鼠明显上升,对于差异有统计学意义(P < 0.01),经过不同剂量的血必净给药,血浆中TNF-α、IL-6水平逐渐降低,但仍然高于对照组中的水平,差异有统计学意义(P < 0.01),且经过血必净治疗后,血浆中TNF-α、IL-6水平与百草枯中毒组相比明显下降,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 1。
2.2 五组大鼠肺组织中Caspase-3蛋白表达与对照组相比较,百草枯中毒组大鼠肺组织中Caspase-3蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P < 0.01),经过血必净治疗后,表达逐渐降低,但仍然显著高于对照组(P < 0.05),不同剂量血必净治疗后肺组织中Caspase-3蛋白表达明显低于百草枯中毒组,差异有统计学意义(P < 0.05),见图 2。
2.3 五组大鼠肺组织细胞凋亡指数正常大鼠肺组织中细胞凋亡水平很低,在百草枯中毒后,大鼠肺组织中细胞凋亡迅速增加,在经过不同剂量血必净治疗后凋亡指数明显下降,但仍然高于对照组,差明有统计学意义(P < 0.01),与百草枯中毒组相比,中等剂量和高剂量组的细胞凋亡指数明显降低(P < 0.05),见图 3。
2.4 五组大鼠肺组织细胞凋亡染色图对照组中含有极少量的细胞发生凋亡,在百草枯中毒组中存在大量的细胞凋亡(绿色荧光较强),但在经过不同剂量血必净治疗后,荧光强度有下降的趋势,见图 4。
3 讨论当发生百草枯中毒时,机体内的多个脏器会受到损伤,尤以肺脏的损伤最为严重。百草枯在肺组织中的浓度在最高时约为其在血浆中的90倍,通常会导致全身性的炎症反应[6]。目前已经发现这类型的炎症反应综合征是各种致病因素触发机体产生过度炎症的一种临床过程,其中包含了炎性介质的释放过程,同时机体还会产生抗炎症反应与致炎症反应两种系统发生失衡作用,一旦发生了过度炎症反应的持续恶化,将引发患者包括急性肺损伤等在内的器官衰竭[7]。通过不同的方法获得的百草枯中毒动物模型均发现血浆中的多种炎症细胞因子含量上升,并且与之后发生的动物模型器官功能损伤衰竭以及死亡密切相关[8]。Tang等[9]报道称百草枯中毒的大鼠血浆中肿瘤坏死因子-α的表达水平明显升高。Li等[10]则发现百草枯中毒的患者血浆中IL-6表达水平发生异常上升,但与患者的血流动力学障碍没有必然的关联性。近年来通过研究发现将发生百草枯中毒患者的血清提取出来,并用于培养大鼠的肾小管上皮细胞,肿瘤坏死因子-α基因的转录水平及受体-1的表达状态显著升高,Caspase-3的活性升高,且肿瘤坏死因子-α蛋白的表达也异常升高,肾小管上皮细胞发生凋亡,且数量逐渐增高[11]。张炜等[12]发现在百草枯中毒时,急性肺损伤表达升高的各类型炎性细胞因子(TNF-α,IL-1等)会进入血液循环。本研究结果显示百草枯中毒大鼠血浆中炎症因子TNF-α和IL-6的表达含量显著升高,且与正常组相比升高明显(P < 0.01)。本文结果显示这一结果与上述报道的实验结果相一致。
TNF-α是炎症调控网络的核心因子之一,是炎症反应最先产生的因子,也是产生正反馈效应的重要递质。IL-6是调节炎症反应和免疫功能的多功能细胞因子。两者均可以通过不同的途径激活Caspase家族的蛋白质,最终都可以使得Caspase-3蛋白被激活。Caspase-3是细胞发生凋亡作用信号途径最为重要的执行因子之一,其表达状态常被用来间接的反应细胞的凋亡水平。在本研究中发现百草枯中毒大鼠肺组织中Caspase-3蛋白表达水平和细胞凋亡率均明显高于正常大鼠肺组织,而且在经过不同浓度的血必净治疗后,Caspase-3蛋白表达水平和细胞凋亡率均逐渐降低,但仍然高于正常组的水平,对比差异有统计学意义(P < 0.05)。Chang等[13]报道称在发生百草枯中毒的早期阶段,肾组织中产生了大量的氧自由基,可以作为NF-κB激活的启动因子。因此笔者推测在发生百草枯中毒时,首先产生了大量的炎症细胞因子(TNF-α、IL-6等),这些炎症因子可以进一步激活NF-κB的活性,而有活性的NF-κB是细胞凋亡信号途径Caspase-3的启动因子,最终使得急性肺损伤组织的细胞发生凋亡作用。本文研究显示,与正常组比较,其他各组肺组织细胞凋亡、凋亡指数及细胞凋亡基因Caspase-3蛋白显著增加(P < 0.01)。再次证实百草枯可能通过炎症反应激活激活Caspase家族的蛋白质表达导致肺组织细胞凋亡。
有资料显示血必净注射液可以有效缓解组织受损,调节炎症因子,进而提高患者存活率[14-15]。蔡锋泉等[16]发现血必净可以对抗内毒素及与发病有关的多种炎症介质的作用,拮抗多种炎症因子的释放,增强HLA-DR的表达,使的患者的免疫功能得到一定程度的恢复。El-Boghdady等[17]报道称血必净注射液可以抑制百草枯中毒动物血清中TGF-β1的表达水平,降低纤维母细胞发生迁移和活化作用,并能有效的抑制胶原蛋白产生,保护肺组织结构。Harchegani等[18]研究显示血必净可以有效降低肺损伤动物血浆中HGF、KGF的表达,缓解肺脏的炎症反应,对肺组织产生有效的保护作用。本研究结果表明在百草枯中毒大鼠肺损伤过程中TNF-α、IL-6和Caspase-3发生了重要的作用,血必净能够明显降低百草枯中毒组大鼠血浆中炎症细胞因子水平,对于急性肺损伤组织细胞Caspase-3蛋白的表达也具有较为显著的抑制作用,降低细胞凋亡率,缓解中毒大鼠的肺组织损伤。提示抑制炎症细胞因子(TNF-α和IL-6)表达和Caspase-3的激活可能是临床治疗百草枯中毒的一个新思路。
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