脑白质病变(white matter lesions, WML),又被称为脑白质高信号(white matter hyperintensities, WMH)或脑白质疏松(leukoaraiosis, LA),是一种非特异性的大脑白质病变,头颅磁共振(MRI)表现为T1加权像低信号,T2加权和FLAIR序列高信号,包括脑室旁白质病变(periventricular white matter lesions, PVWML)和深部白质病变(deep white matter lesions,DWML)。随着磁共振的广泛应用,WML在老年人群中的发生率日益增加,与老年人群的运动障碍、痴呆、卒中和抑郁的发生相关[1-2]。年龄和高血压是目前普遍认可的WML的危险因素,有研究表明遗传因素在WML发病中也发挥重要作用[3-4]。
伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominant arteripathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy, CADASIL)是一种遗传性脑小血管病,由NOTCH3基因突变所致[5],常累及小的穿通动脉,影像学表现为复发性中风和脑白质病变[6]。老年人群WML的影像学表现与CADASIL相似,所以笔者推测NOTCH3也可能与老年人群的WML相关。目前有研究报道单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)与WML的相关性[7-8]。但是NOTCH3基因多态性与WML相关性的研究不多,因此,本研究对NOTCH3基因多态位点rs1043994与WML的相关性进行研究。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2015年1月至2017年1月于温州医学大学附属第一医院门诊健康体检的老年人337例,其中男性188例,女性149例,年龄(60.0±5.2)岁。所有受试者均行头颅MRI检查。纳入标准:(1)年龄≥50岁;(2)能配合进行头颅MRI检查者;(3)理解相关研究并同意留取血标本进行SNP检测。
排除标准:(1)既往有神经系统疾病如脑血管病、颅内感染、痴呆、外伤;(2)有精神病病史;(3)患有严重疾病如肝肾功能损害、心脏病、肿瘤等疾病。本研究经温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准,所有受试者均提供书面知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 收集临床资料收集所有研究对象的基本资料,包括一般资料、现病史、既往病史(高血压、糖尿病、高脂血症)、用药史和吸烟史,所有受试者于清晨空腹抽取外周静脉血5 mL,EDTA抗凝以备DNA提取。同时抽取外周静脉血完成血糖、血脂、同型半胱氨酸(Hcy)、尿酸等生化检查。
运用简易智能精神状态量表(MMSE)评估认知功能,包括定向力、记忆力、注意力和计算力、语言能力,共30项,每项记1分,共30分。
1.2.2 多态性分析取EDTA抗凝的外周静脉血5 mL,常规酚-氯仿法提取基因组DNA。通过软件Primer3设计NOTCH3基因rs1043994序列的引物,正向引物5’-GATGGACGCTTCCTCTGCT-3',反向引物5'-CAATTCTGACCCTCAAACC C-3'。引物由上海生工股份有限公司合成。PCR(PTC-100,Applied Biosystems公司,美国)反应体系:1.0 µL DNA(50 ng/µL),正、反向引物各0.5 µL(100 ng/µL),dNTPs 0.4 µL(10 mmol/L),PCR缓冲液2 µL,0.5 µL Taq DNA酶(5 U/µL), 15.1 µL PCR H2O(去离子水),反应体系共20 µL。PCR反应条件如下:95 ℃预变性15 min;95 ℃变性1 min,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,30个循环;72 ℃充分延伸10 min。扩增产物376 bp。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,验证与目的片段一致后4 ℃保存。应用限制性内切酶ApLI(NEB有限公司,北京,中国)对PCR产物进行酶切,限制性内切酶片断长度多态性分析有三种基因型:AA型仅有188 bp片断,GG型仅有376 bp片断,AG型有188 bp、376 bp两个片断,1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,紫外凝胶成像系统观察基因型。
1.2.3 神经影像学检查采用德国西门子公司生产的1.5 T MRI扫描仪,常规横断面头颅扫描,包括T1WI(TR/TE: 2 000/7 ms)、T2WI(TR/TE: 4 200/97 ms)和FLAIR序列(TR/TE: 8 000/107 ms,反转时间: 2 000 ms),DWI(TR/ TE: 3 133 ms/89 ms, b = 0/500/1 000)、ADC(TR 3 133 ms, TE 89 ms),层厚5 mm。
所有入组者均行头颅MRI检查,根据检查结果,分为WML组和正常对照组。WML影像学表现为皮质下半卵圆区或侧脑室旁对称分布的T1加权等或低信号、T2加权和FLAIR像高信号,排除多发性梗死或者因多发性硬化、中毒、代谢性因素等导致的WML。WML严重程度的分级方法采用Fazekas分级法[9],根据WML在T2加权像的部位及严重程度进行分级,分为两大类四个等级:脑室旁病变(PVWML):0级=无病变;1级=侧脑室前脚帽状病变或侧脑室旁线状病变;2级=侧脑室旁带状病变;3级=脑室旁不规则病变,进入深部白质区。深部白质病变(DWML):0级=无病变;1级=点状病变;2级=早期融合病变;3级=大片融合病变。本研究将PVWML评分及DWML评分相加为WML总分。
1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计数资料以百分率表示,计数资料组间比较采用χ2检验。服从正态分布的计量资料以(x±s)表示,组间比较采用成组t检验;偏态分布资料以中位数(四分位数)[M(P25, P75)]表示,采用Wilcoxon秩和U检验。采用多因素Logistic回归分析WML的危险因素。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基线资料的比较WML组(n=172)和对照组(n=165)相比较,两组之间性别、受教育程度、糖尿病、高血脂、吸烟、尿酸、Hcy差异无统计学意义(P > 0.05)。而组间年龄、高血压差异有统计学意义(P < 0.05),WML组较对照组年龄更大,高血压的比例更高。两组间MMSE评分差异有统计学意义(P < 0.01)(表 1),进一步将WML组分为PVWML组和DWML组比较,两组间MMSE评分比较差异无统计学意义(t=0.941, P=0.349)。
指标 | WML组(n=172) | 对照组(n=165) | 检验值 | P值 |
年龄(岁)a | 61.7±4.8 | 58.2±5.0 | t=-6.540 | < 0.01 |
男性(例, %) | 90(54.5) | 98(57.0) | χ2=0.202 | 0.662 |
教育程度(年)b | 5.0(3.0, 7.75) | 6.0(3.0, 8.0) | Z=-0.781 | 0.435 |
MMSE(分)b | 28(27, 29) | 26(25, 27) | Z=-9.307 | < 0.01 |
高血压(例, %) | 92(53.5) | 59(35.8) | χ2=10.706 | 0.001 |
糖尿病(例, %) | 22(12.8) | 23(13.9) | χ2=0.096 | 0.873 |
高脂血症(例, %) | 21(12.2) | 24(14.5) | χ2=0.397 | 0.631 |
吸烟(例, %) | 67(39.0) | 61(37.0) | χ2=0.141 | 0.737 |
尿酸(µmol/L)a | 295.1±83.8 | 310.9±79.9 | t=1.773 | 0.077 |
Hcy(µmol/L)b | 12(9, 14) | 12(10, 14) | Z=-0.519 | 0.604 |
注:a为x±s, b为M(P25,P75) |
经Hardy-Weinberg遗传平衡检验表明,WML组和对照组rs1043994基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。两组间rs1043994的基因型频率以及等位基因频率分布差异有统计学意义(P < 0.05),见表 2。
组别 | 基因型 | 等位基因 | ||||
AA | AG | GG | A | G | ||
WML组 | 22(12.8) | 51(29.7) | 99(57.5) | 95(27.6) | 249(72.4) | |
对照组 | 13(7.9) | 35(21.2) | 117(70.9) | 61(19.9) | 246(80.1) | |
χ2值 | 6.648 | 5.343 | ||||
P值 | 0.036 | 0.021 |
进行WML相关因素的Logistic回归分析,将AA基因型、年龄、性别、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、尿酸、Hcy加入Logistic回归模型,结果提示年龄(OR=1.151, 95%CI: 1.096~1.209, P=0.001)、高血压(OR=1.934, 95%CI: 1.157~3.233, P=0.012)和AA基因型(OR=2.512, 95%CI:1.161~5.433, P=0.019)是WML的危险因素(P < 0.05),见表 3。与非AA型(AG/GG)个体相比,AA型个体患WML的风险是前者的2.512倍。
变量 | 偏回归系数 | 标准误 | Wald值 | P值 | OR值 | 95% CI |
性别 | -0.292 | 0.336 | 0.754 | 0.385 | 0.747 | 0.387~1.443 |
年龄 | 0.141 | 0.025 | 31.446 | 0.001 | 1.151 | 1.096~1.209 |
高血压 | 0.659 | 0.262 | 6.323 | 0.012 | 1.934 | 1.157~3.233 |
糖尿病 | 0.163 | 0.363 | 0.200 | 0.654 | 1.177 | 0.577~2.399 |
高血脂 | 0.158 | 0.372 | 0.181 | 0.671 | 1.171 | 0.565~2.427 |
吸烟 | -0.153 | 0.339 | 0.203 | 0.652 | 0.858 | 0.441~1.669 |
尿酸 | -0.003 | 0.001 | 3.049 | 0.081 | 0.997 | 0.995~1.000 |
Hcy | 0.027 | 0.031 | 0.769 | 0.381 | 1.028 | 0.967~1.093 |
基因型AA | 0.921 | 0.394 | 5.474 | 0.019 | 2.512 | 1.161~5.433 |
根据WML评分,对WML组不同分级组间进行比较,表明rs1043994的基因型频率以及等位基因频率分布差异无统计学意义(P > 0.05),见表 4。
WML分级 | 基因型 | 等位基因 | ||||
AA | AG | GG | A | G | ||
1级 | 8(12.3) | 19(29.2) | 38(58.5) | 35(26.9) | 95(73.1) | |
2级 | 6(15.4) | 11(28.2) | 22(56.4) | 23(29.5) | 55(70.5) | |
3级 | 6(17.1) | 9(25.7) | 20(57.1) | 21(30.0) | 49(70.0) | |
4级 | 5(15.2) | 9(27.3) | 19(57.6) | 19(28.8) | 47(71.2) | |
χ2值 | 0.540 | 0.276 | ||||
P值 | 0.997 | 0.964 |
WML常见于老年人群,发病率和严重程度随着年龄增加而增加,高血压也是公认的危险因素[10]。除了年龄和高血压外,遗传因素在WML发病中也起着重要作用,一项包括7 773例老年人的全基因组研究结果显示,WML的遗传率为6.5%,表明WML具有较高的遗传倾向[11]。前瞻性研究表明WML将会增加认知功能障碍、卒中和死亡的风险[2]。目前认为WML是脑小血管病(small vessel disease, SVD)的一种表现[12],近年来成为中枢神经领域的研究热点之一,发病机制尚不清楚,可能与内皮细胞功能紊乱、血脑屏障破坏、大脑炎性反应和慢性脑灌注不足有关[13-14]。其病理学改变表现为棘细胞层水肿、神经胶质细胞增生、脱髓鞘等[15-17]。WML可分为脑室旁白质病变(PVWML)和深部白质病变(DWML),虽然两者常常同时存在,但是有研究认为它们的病理特征和临床意义存在不同之处[18]。PVWML与认知功能下降的关系更密切,而DWML则更容易导致抑郁等情绪相关疾病。
NOTCH3基因编码的是含有2 321个氨基酸的跨膜蛋白,参与细胞信号传导。NOTCH3基因编码蛋白参与血管平滑肌细胞的增殖、分化和凋亡,调控小动脉结构和功能,NOTCH3基因突变导致蛋白功能异常,影响平滑肌细胞生长发育,导致小动脉壁增厚、纤维化,血管内皮细胞损害,脑血流调节功能障碍[19-22]。脑室周围白质主要接受长穿支血管的血液供应,而这些穿支是脉络膜或纹状体动脉的终末支,与软脑膜血管的长穿支吻合,解剖学特征使得脑室周围白质易受缺血的影响。动脉硬化导致的血管狭窄可能导致脑白质缺血性损害。
本研究发现NOTCH3基因rs1043994多态与WML之间的关联性,WML组与对照组之间基因型频率以及等位基因频率分布差异有统计学意义,A等位基因是WML发生的危险因素。多因素分析表明AA基因型是WML的独立危险因素,而年龄、高血压也是WML的独立危险因素,这与大多数研究结果相符[23]。WML组与对照组MMSE评分差异有统计学意义,提示WML影响老年人群的认知功能,但是不同部位WML组间MMSE差异无统计学意义,未发现不同部位WML与认知功能的相关性。本研究存在以下不足之处:第一,选择偏倚,研究对象来自医院而非社区人群;第二,样本量小,需要扩大样本量进一步研究以证实两者的相关性。未来的研究将致力于改进这些不足之处,进一步研究WML有关的基因多态性,有助于确认WML病因,最终为疾病预防和临床治疗提供有效的指导。
随着年龄增长,WML的严重程度也随之增加,将会影响老年人的生活质量,临床工作应予以重视。而目前此类疾病的治疗和预防尚无有效的方法,进一步开展NOTCH3基因的功能研究,有望为WML的治疗和预防提供新的方法。
利益冲突:本研究无利益冲突
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