2018, Vol. 27
糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)是普遍存在于真核生物内的多功能的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，它可能在多种信号传导过程中发挥着重要的调节作用[1]。近年来研究表明，GSK-3β在脓毒症、缺血-再灌注损伤、关节炎、休克等多种疾病并发多器官功能障碍过程中发挥重要作用[2-6]。GSK-3β作为一个可行有效的治疗靶点已成为研究者们关注的热点话题。
GSK-3β抑制剂干预急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)动物模型已有文献报道[7]，但其中采用的实验动物、诱导的实验模型、GSK-3β抑制剂的类别、给药途径和剂量各不相同，导致各研究结果缺乏一致性和可比性。因此，本研究通过牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备大鼠重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)模型，应用GSK-3β的常用抑制剂TDZD- 8 (4-benzyl-2-methyl-1, 2, 4 -thia Diazolidine-3, 5-dione, TDZD-8)，观察静脉注射TDZD-8干预大鼠SAP合并急性肾损伤模型的量效关系，并将三种常用GSK-3β抑制剂TDZD-8、氯化锂(lithium chloride, LiCl)、3-(2, 4-dichlorophenyl)-4- (1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2, 5- dione (SB216763)对该模型的作用效果进行对比，以探讨针对SAP并发肾损伤最有效的GSK-3β抑制剂类别及其最有效、安全的合理剂量，为GSK-3β抑制剂的临床应用提供理论支持和实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组SPF级雄性SD大鼠96只、体质量150~200 g（湖北省疾病预防控制中心提供）。随机（随机数字法）分为8组（n=12）：假手术组（sham operation group，SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）、TDZD-8预处理组0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg（SAP+TDZD-8 pretreatment group，TD组，分别标记为TD1、TD2、TD3、TD4组），LiCL预处理组(L组)和SB216763预处理组(SB组)，均以12 h为观察点。实验过程未到观察时间点死亡大鼠弃之不用，直至达到实验目标数。
1.2 动物模型制备及处理重症急性胰腺炎大鼠模型造模方法：实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。采用5%异氟烷对SD大鼠进行诱导和2%异氟烷维持麻醉，无菌操作下行上腹正中切口进腹，采用1 mL注射器针头穿过十二指肠对系膜缘经乳头逆行插入主胰管，以约0.1 mL/min恒速向主胰管注射5%牛磺胆酸钠溶液(1 mL/kg，Sigma公司)制备重症急性胰腺炎大鼠模型[8]。
分组及处理具体如下：（1）重症急性胰腺炎组（SAP组），按照上述方法制备重症急性胰腺炎大鼠模型，造模前30 min经股静脉注射无菌处理的10% DMSO溶液(0.1 mL/100 g)；（2）假手术组（SO组），假手术组制备同重症急性胰腺炎组，但不向胆胰管注入5%牛磺胆酸钠溶液，而是注射等量生理盐水；术前30 min经股静脉注射与SAP组等体积的溶剂10% DMSO；（3）TDZD-8预处理组（TD组），操作处理同SAP组，于模型制备前30 min由股静脉穿刺给予0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg的TDZD-8溶液，分别标记为TD1、TD2、TD3、TD4组；（4）LiCl预处理组（L组，SAP+LiCl组），操作处理同TDZD-8组，SAP造模前30 min经大鼠股静脉注射GSK-3β抑制剂LiCl（40 mg/kg，溶于10% DMSO溶液，该剂量参考前期文献[9]）；（5）SB216763预处理组（SB组，SAP+SB216763组），操作处理同TDZD-8组，SAP造模前30 min经大鼠股静脉注射GSK-3β抑制剂SB216763（1 mg/kg，溶于10% DMSO溶液，该剂量参考前期文献[10]）。
1.3 标本采集所有大鼠均于造模后12 h时处理取材；下腔静脉穿刺采血，离心后分离血清-20℃保存备用；取部分胰腺组织和左侧肾脏组织4%多聚甲醛固定用于光镜组织病理学检查；其余肾脏组织立即经液氮冻存后转入-80℃冰箱保存备用。
1.4 指标检测方法胰腺、肾脏组织病理学检查。胰腺、肾脏组织4%多聚甲醛固定、石蜡包埋制片，HE染色后光镜下观察，依据Schmidt标准[11]按胰腺水肿、腺泡、腺管坏死程度、出血和脂肪液化坏死、炎症和血管周围炎性浸润四方面对胰腺损伤进行病理学评分，按Paller等[12]对肾脏损伤程度的病理评分方法并改良方法进行评分。
腹水量测定。提前称量干棉球质量(D, g)，以干棉球吸附干净各组大鼠腹水后称其湿质量(W, g)。腹水量(ascites)=湿棉球质量(W)-干棉球质量(D)。
血清淀粉酶（AMY）、血脂肪酶（LIPA）、血清肌酐(Cr)、血清尿素氮(BUN)及谷丙转氨酶（ALT）水平在武汉大学人民医院检验中心予以检测。
Western-Blot检测肾脏组织GSK-3β及磷酸化p-GSK-3β (ser9)蛋白的表达。冻存的各组肾脏组织以蛋白裂解液匀浆，冰上孵育30 min后，4℃、13 000 r/min离心30 min，取上清液，得总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；取40 μg蛋白样品上样行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白电转至NC膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，加入GSK-3β兔抗大鼠多克隆抗体（1:1 000，Cell signalling Technology公司）、p-GSK-3β (ser9)兔抗大鼠多克隆抗体（1:1 000，Cell signalling Technology公司）或β-actin一抗（1:2 000，cell signaling technology公司），置于4℃冰箱振荡孵育过夜后，TBST漂洗，加辣根过氧化酶标记二抗(1:3 000)，室温孵育1 h后以ECL化学发光试剂于暗室显影，凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带。
1.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析ANOVA检验，组间两两比较用LSD-t检验，方差不齐则进行秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 腹水量测定结果SO组大鼠腹腔仅可见极少量腹水，为无色透明。SAP组大鼠腹水量较SO组明显增多(P < 0.05)，且颜色呈红褐色。TD2、TD3、TD4组均较SAP组大鼠腹水量明显减少(P < 0.05)，TD1组较SAP组差异无统计学意义(P > 0.05)，TD2、TD3、TD4组腹水减少量差异无统计学意义(P < 0.05)，但均较TD1组显著(P < 0.05)，L组和SB组大鼠均较SAP组腹水量明显减少(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组腹水减少量差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 1。
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| 与SO组比较，aP < 0.05；与SAP组比较，bP < 0.05；与TD1组比较，cP < 0.05 图 1 各组大鼠腹水量测定 Figure 1 Determination of the amount of ascites in rats of each group |
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以造模后12 h作为观察点，SAP组大鼠血清淀粉酶(AMY)含量较SO组显著增高(P < 0.05)；TD1组大鼠血清AMY水平与SAP组比较，差异无统计学意义(P < 0.05)；TD2、TD3、TD4组AMY水平均较TD1组、SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD2、TD3、TD4组三组之间比较，TD3、TD4组之间AMY水平差异无统计学意义(P > 0.05)，但均较TD2组降低，且差异有统计学意义(P < 0.05)。L组和SB组AMY水平均较SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组三组之间比较，TD3组明显较L组和SB组AMY含量更低，且差异有统计学意义(P < 0.05)。L组和SB组AMY水平差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 2A。
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| A：血清淀粉酶（AMY）的变化；B：血清谷丙转氨酶(ALT)的变化；C：血清肌酐(Cr)；D：尿素氮(BUN)的变化；与SO组比较，aP < 0.05；与SAP组比较，bP < 0.05；与TD1组比较，cP < 0.05；与TD2组比较，dP < 0.05；与TD3组比较，eP < 0.05；与L组比较，fP < 0.05 图 2 各组大鼠血情指标变化情况 Figure 2 Changes of blood index of rats in each group |
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SAP组大鼠ALT水平较SO组显著增高(P < 0.05)；TD2、TD3、TD4组大鼠血清ALT水平与SAP组相比显著降低(P < 0.05)；TD1组ALT水平与SAP组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。TD4组大鼠血清ALT水平高于TD3组，差异有统计学意义(P < 0.05)。L组和SB组血清ALT水平均较SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组三组之间比较，血清ALT水平差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 2B。
SAP组大鼠血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)均较SO组显著增高(P < 0.05)；TD2、TD3、TD4组大鼠血清Cr和BUN水平与SAP组相比显著降低(P < 0.05)，TD1组与SAP组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)；TD2、TD3、TD4组三组之间比较，TD3、TD4之间Cr和BUN水平差异无统计学意义(P > 0.05)，但均较TD2组降低，且差异有统计学意义(P < 0.05)。L组和SB组Cr和BUN水平均较SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组三组之间比较，TD3组明显较L组和SB组Cr和BUN含量更低，且差异有统计学意义(P < 0.05)。L组Cr和BUN水平较SB组含量低，且差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 2C, D。
2.3 胰腺组织病理学变化SO组大鼠光镜下可见胰腺小叶结构完整，偶见轻度水肿，无出血及炎症细胞浸润；SAP组光镜下可见胰腺正常结构被严重破坏，小叶间隔增宽，腺泡大量坏死，甚至原有结构消失；胰腺小血管出血明显，扩张的叶间隔之间可见部分红细胞，部分切片可见典型的胰周脂肪坏死；胰腺小叶间可见炎症细胞浸润明显，血管周围也可见大量炎症细胞渗出。给予各梯度剂量TDZD-8及各类GSK-3β抑制剂预处理后，胰腺腺泡水肿、坏死、胰腺小叶间隔内出血及炎症细胞浸润均较SAP组有不同程度减轻。
胰腺组织病理学评分：SAP组病理评分较SO组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)。TD1组胰腺病理评分与SAP组比较差异无统计学意义(P < 0.05)，TD2、TD3、TD4组大鼠胰腺病理评分与SAP组相比显著降低(P < 0.05)；TD2、TD3、TD4组随着药物浓度的提高，胰腺病理评分逐渐降低(P < 0.05)，但TD3与TD4组差异无统计学意义。L组和SB组胰腺组织病理学评分较SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组三组之间比较，TD3组较L组和SB组胰腺组织病理评分均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。L组较SB组评分稍降低，且差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 3。
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| 与SO组比较，aP < 0.05；与SAP组比较，bP < 0.05；与TD1组比较，cP < 0.05；与TD2组比较，dP < 0.05；与TD3组比较，eP < 0.05；与L组比较，fP < 0.05 图 3 各组大鼠胰腺、肾脏组织病理学评分 Figure 3 Histopathological score of pancreas and kidney in rats of each group |
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SO组大鼠肾脏结构完整，肾小管上皮无水肿，细胞界限清楚，肾间质无血管充血、无炎症细胞浸润等表现；SAP组可见大量肾小球淤血性改变，细胞界限模糊，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔内可见大量管型形成，肾小管管腔变窄或闭塞，大量炎症细胞浸润。给予各梯度剂量TDZD-8及各类GSK-3β抑制剂预处理后，肾小球淤血，肾小管上皮细胞水肿、坏死及炎细胞浸润程度均较SAP组有不同程度减轻，见图 4。
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| A：SO组大鼠肾脏组织结构完整，肾小管上皮无水肿，细胞界限清楚，肾间质无血管充血、出血样改变，无炎症细胞浸润等表现；B：SAP组可见大量肾小球淤血性改变，细胞界限模糊，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔内可见大量管型形成，肾小管管腔变窄或闭塞，大量炎症细胞浸润；C：TD3组；D：L组；E：SB组；三个药物干预组中肾小球淤血，肾小管上皮细胞水肿、坏死及炎细胞浸润程度均较SAP组有不同程度减轻 图 4 各组大鼠肾脏病理组织学改变(HE×200) Figure 4 Histopathologcial changes of kidney in rats of each group(HE×200) |
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肾脏组织病理学评分：SAP组病理评分较SO组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)。TD1组肾脏病理学评分与SAP组比较差异无统计学意义(P < 0.05)，TD2、TD3、TD4组大鼠肾脏病理评分与SAP组相比显著降低(P < 0.05)；TD2、TD3、TD4组随着药物浓度的提高，肾脏病理评分逐渐降低(P < 0.05)，但TD3与TD4组差异无统计学意义。L组和SB组肾脏组织病理学评分较SAP组显著降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，TD3组、L组和SB组三组之间比较，TD3组较L组和SB组肾脏组织病理评分均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。L组较SB组大鼠肾脏病理学评分稍降低，且差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 3。
2.5 Western blot检测各组肾脏组织中GSK-3β和p-GSK-3β ser9蛋白的表达结果应用Western blot法对各组大鼠肾组织GSK-3β表达进行半定量分析发现，各组中GSK-3β蛋白表达均处于较一致的水平，差异无统计学意义(P > 0.05)。而p-GSK-3β ser9表达在SAP组中表达明显低于SO组，差异有统计学意义(P < 0.05)；而TD3、L、SB三组中的p-GSK-3β ser9均较SAP组明显增强，其中以TD3组表达最强，强于L组和SB组，L组表达强于SB组，组间比较差异均有统计学意义(P < 0.05)，见图 5。
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| 与SO组比较，aP < 0.05；与SAP组比较，bP < 0.05；与TD3组比较，cP < 0.05；与L组比较，dP < 0.05 图 5 各组大鼠肾组织GSK-3β及磷酸化p-GSK-3β(ser 9)蛋白表达 Figure 5 The expression of GSK-3 beta and phosphorylated p-GSK-3 beta (SER 9) protein in renal tissues of rats in each group |
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急性胰腺炎是临床上一种常见的急腹症，发病急、进展快、严重危害患者的生命健康[13-14]。GSK-3β抑制剂在精神紊乱性疾病、糖尿病、阿尔茨海默病以及癌症、缺血-再灌注损伤等多种疾病中的研究已成为国内外研究和关注的热点，有关GSK-3β及其抑制剂在急性胰腺炎及其胰外脏器损伤中的作用的报道少见。本实验观察了GSK-3β的常用抑制剂TDZD-8对SAP的治疗作用，并将三种常用GSK-3β抑制剂TDZD-8、氯化锂(LiCl)、SB216763对该模型的作用效果进行对比，旨在探讨GSK-3β抑制剂在防治SAP及其胰外脏器损伤中合理的类别及剂量-效应关系。
Cuzzocrea等[7]证实，GSK-3β抑制剂TDZD-8能显著降低SAP小鼠模型血浆和胰腺组织中TNF-α、IL-1β水平，减少胰腺组织中炎症细胞的浸润，降低血浆中胰淀粉酶和胰脂肪酶含量，减轻胰腺损伤程度。另外有研究发现，TDZD-8治疗能显著降低细胞的凋亡及星形胶质细胞的增生，改善新生儿缺氧缺血性脑损伤[15]。在其他模型中，GSK-3β抑制剂也被广泛应用，在大鼠小肠缺血-再灌注模型中，给予GSK-3β抑制剂TDZD-8能降低回肠组织中TNF-α、IL-1β含量，减少肠组织中炎症细胞的浸润，表明TDZD-8能缓解肠道缺血-再灌注引起的炎症发应，减轻肠道损伤[16]。在心肌缺血-再灌注损伤模型中，抑制GSK-3β的活性，可明显减少线粒体通透性转换孔的开放，从而改善心肌缺血-再灌注的损伤[17]。
目前开发的GSK-3β抑制剂在化学结构上差异很大，按作用机制可主要分为小分子ATP竞争性抑制剂和非ATP竞争抑制剂。小分子ATP竞争性抑制剂特点是多数为小分子疏水的杂环化合物，相对分子质量一般小于600，多数通过与GSK-3βSer9磷酸化位点ATP竞争性地结合抑制GSK-3β活性，SB216763即为其代表药物。非ATP竞争性抑制剂一般以无机离子抑制剂锂(Li)和TDZD-8作为代表，Li是第一个发现的GSK-3β抑制剂但锂抑制GSK-3β活性的机制目前不完全清楚。TDZD-8是GSK-3β的非ATP竞争小分子抑制剂，它主要磷酸化GSK-3β ser9从而降低GSK-3β的活性。它的特点是不阻断其他一系列的激酶如蛋白激酶A和C，酪蛋白激酶Ⅱ和依赖细胞周期素激酶1等的活性。又有研究发现TDZD-8的结合口袋除了T-loop区外，还可以与ATP竞争催化区域，也可以作为与ATP竞争的小分子抑制剂。因此可以认为TDZD-8是有双重抑制作用。TDZD-8是最广泛应用于实验的GSK-3β抑制剂，因此本研究将其作为主要研究药物，鉴于目前SAP的模型制备未完全统一，参考相关的炎症疾病模型中的剂量使用情况[18]，本研究将TDZD-8设立为0.25、0.5、1.0和2.0 mg/kg四个剂量梯度进行量效关系探讨。本实验研究结果显示，静脉给予不同剂量的TDZD-8均能不同程度地减少SAP大鼠的腹水量，降低药物组血清AMY、Cr、BUN及ALT水平，并显著降低胰腺病理评分，表明了TDZD-8对SAP时胰腺及胰外脏器的损伤均具有保护作用。但使用不同剂量TDZD-8，其治疗效果有显著差别，TD1(0.25 mg/kg)组几乎对SAP无缓解作用，TD4 (2.0 mg/kg)组可显著降低血清AMY、Cr、BUN以及胰腺病理评分，但其ALT水平较高，对肝脏功能有一定损坏作用，而TD2(0.5 mg/kg)组对上述各个指标均有效果，但效果不如TD3组(1.0 mg/kg)作用明显，可显著降低上述各指标。综合实验结果可见，TD3组使用1.0 mg/kg TDZD-8均较TD1(0.25 mg/kg)组、TD2(0.5 mg/kg)组和TD4组(2.0 mg/kg)具有明显效果，而且更安全，对药物的代谢器官损伤较小。
本研究将常用的三种不同的GSK-3β抑制剂，TDZD-8、氯化锂(LiCl)、SB216763对该模型的作用效果进行对比，结果发现三种抑制剂均对SAP大鼠肾损伤具有治疗作用，降低血清AMY、Cr、BUN及ALT水平，并能降低胰腺及肾脏的病理评分。通过Western blot法评估各组肾脏组织中GSK-3β和p-GSK-3β ser9蛋白的表达结果发现，各组大鼠肾脏GSK-3β蛋白表达处于较一致的水平，并未发生明显变化，而磷酸化的p-GSK-3β ser9在SO组大鼠肾脏组织中的表达稍弱，在SAP组表达最弱，而TD3和L、SB组中的表达均增强，均强于SO组，其中TD3组表达最强，L组表达稍强于SB组。已有研究证明，GSK-3β在细胞内通常呈活性状态，其通过磷酸化下游底物而发挥其生物学作用。在受到外界刺激后，GSK-3β Ser9磷酸化而使该酶活性降低，从而改变下游成份的活性或功能，本研究证明使用GSK-3β抑制剂可以使p-GSK-3β Ser9表达增强，更加证实了这一点，增强p-GSK-3β ser9的表达，其实是抑制了GSK-3β的活性，从而抑制其损伤作用，本研究结果还可以得出三种抑制剂中以TDZD-8预处理组中TD3组效果最佳的结论。推断可能与其具有非ATP竞争小分子抑制和ATP竞争小分子抑制的双重抑制作用有关，当然其具体机制仍有待进一步证实。
综上所述，对于牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠模型，静脉给予TDZD-8 1.0 mg/kg体质量预处理对该模型具有最佳合理安全的量效关系。然而，TDZD-8等GSK-3β抑制剂的给药途径、给药方式和给药时间，以及其具体作用机制仍有待进一步的研究。
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