2018, Vol. 27
巨噬细胞在全身各个组织和器官广泛分布，在免疫炎症反应及内环境稳定中发挥着重要作用[1]。当外界病原微生物入侵时，首先发挥作用的便是单核/巨噬细胞系统。巨噬细胞通过表面的受体识别病原菌并将其吞噬消化，经抗原呈递作用呈递给T淋巴细胞，并产生大量炎症细胞因子及趋化因子调节适应性免疫应答[2]。因此，巨噬细胞不仅在固有免疫中发挥主要作用，还连接了固有免疫和适应性免疫。脓毒症的定义为一个对感染反应失调的宿主引起的威胁生命的器官功能障碍[3-4], 是一种涉及固有免疫和适应性免疫反应的复杂综合征，多继发于严重的感染、创伤、休克和大手术后，是危重病患者的主要死因之一[5-6]。因而巨噬细胞在脓毒症的发生发展中发挥着重要作用。巨噬细胞的激活取决于细胞、组织、炎症因子等多方面[7]。巨噬细胞针对不同刺激可分化成不同表型, 即M1(促炎)型和M2(抗炎)型，这个过程称为巨噬细胞的极化。脓毒症时，巨噬细胞发生M1型分化，大量释放促炎因子，导致过度炎症反应，最终导致组织损伤和细胞凋亡; 抑制M1型巨噬细胞的表达，能减弱过度的炎症反应，对机体起到保护作用。根据文献报道，高压氧对于炎症性疾病有积极作用[8-9]，是一种对脓毒症有效的治疗方式[10]。高压氧是否能通过影响巨噬细胞功能抑制过度的炎症反应进而对机体产生保护作用尚不清楚。为此，本研究通过观察高压氧对脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达的影响，探讨高压氧治疗是否通过影响巨噬细胞功能进而对机体产生保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验材料C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司[检疫合格证号：SCXK（辽）2015-0001];酵母多糖购自美国Sigma公司; 磁珠分选试剂盒、F4/80-FITC、CD11b-APC均购自德国美天妮公司; NOS2-PE、ELISA试剂盒（IL-10、IL-12）购自美国eBioscience公司; Fixation/Permeabilization Solution Kit购自美国BD公司; PCR相关试剂盒购自日本TaKaRa公司; 内参GAPDH及iNOS引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 方法 1.2.1 小鼠分组和脓毒症模型建立100只C57BL/6小鼠，雄性，鼠龄6~8周，体质量18~22 g。采用随机数字法，分为空白组、脓毒症组、高压氧组、脓毒症+高压氧组, 每组25只，采用浓度25 mg/mL的酵母多糖按500 mg/kg的标准通过腹腔注射法复制经典腹腔感染脓毒症动物模型，空白组：呼吸空气+注射等体积生理盐水; 脓毒症组：呼吸空气+注射酵母多糖; 高压氧组：高压氧+注射等体积的生理盐水; 脓毒症+高压氧组：高压氧+注射酵母多糖。
1.2.2 腹腔巨噬细胞的获取分别于造模后的4 h、11 h分别给予高压氧组、脓毒症+高压氧组的小鼠吸氧2 h(2个大气压纯氧稳定供氧，1个大气压=101 325 Pa)。造模后第18 h用预冷的不含小牛血清RPMI1640腹腔冲洗获取腹腔细胞，再严格按照磁珠分选试剂盒说明书分离纯化单核巨噬细胞。
1.2.3 M1型巨噬细胞比例检测取经过磁珠分选后的单个核细胞悬液调整至适当浓度，每管100 μL细胞悬液含1×106个细胞; 按说明书的要求加入F4/80-FITC、CD11b-APC荧光标记抗体，经Fixation/Permeabilization Solution固定破膜处理后加入iNOS-PE荧光标记抗体，避光孵育30 min，perm/wash工作液洗2次，PBS 150 μL重悬后上流式仪检测，以流式细胞仪分选CD11b+F4/80+ iNOS+细胞即为M1型巨噬细胞占腹腔单核巨噬细胞的比例。
1.2.4 RT-PCR检测腹腔巨噬细胞iNOS mRNA的相对表达水平按试剂说明书要求提取总RNA，反转录合成cDNA第一条链。以cDNA为模板扩增iNOS的基因片段，引物序列见表 1，扩增条件为95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环。以GAPDH的表达量为内参照，计算iNOS与GAPDH相对浓度的比值作为mRNA表达的相对水平。
| 基因 | 引物序列5'→3' | 长度 |
| iNOS | 前引物GAACGGAGAACGTTGGATTTG | 100 bp |
| 后引物TCAGGTCACTTTGGTAGGATTT | ||
| GAPDH | 前引物GGTTGTCTCCTGCGACTTCA | 183 bp |
| 后引物TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC |
于注射酵母多糖后18 h采用眼球取血法取小鼠外周血，将全血放入促凝管中，离心分离血清，-80 ℃保存。严格按照ELISA试剂盒说明书的要求进行IL-12和IL-10的检测。
1.2.6 小鼠72 h存活情况每组小鼠5只获取细胞，剩余20只小鼠正常饲养72 h，观察各组小鼠的存活情况。
1.3 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（方差齐采用LSD-t检验、方差不齐采用Dunnett's T3检验），小鼠存活情况采用χ2-Fisher精确概率法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠72 h存活情况空白组和高压氧组小鼠存活数均为20只，脓毒症组小鼠72 h存活9只, 脓毒症+高压氧组小鼠72 h存活16只，差异有统计学意义（P < 0.01）。
2.2 各组M1型巨噬细胞占腹腔单核巨噬细胞的比例磁珠分选后单核巨噬细胞（CD11b-APC+、F4/80-FITC-）所占的比例90.5%，见图 1 Q3区; 各组M1型巨噬细胞（CD11b-APC+、F4/80-FITC+、iNOS-PE+）的比例，空白组(A) M1型巨噬细胞比例为（1.15±0.40）%，高压氧组（C）M1型巨噬细胞比例为（1.24±0.80）%两组间差异不具有统计学意义（P > 0.01）; 与脓毒症组（B）M1型巨噬细胞比例（4.75±0.14）%相比，脓毒症+高压氧组（D）M1型巨噬细胞比例（2.25±0.16）%明显下降，两组间差异有统计学意义（F=803.438，P < 0.01），见图 2 Q2区。
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| 图 1 单核巨噬细胞所占比例 Figure 1 The proportion of mononuclear macrophages |
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| 图 2 M1型巨噬细胞的比例 Figure 2 The proportion of M1 macrophages |
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空白组（3.59±0.63）和高压氧组（3.16±0.60）两组表达水平较低且两组之间表达水平差异不具有统计学意义（P > 0.01）; 脓毒症+高压氧组的水平（39.62±1.74）比脓毒症组（48.32±3.34）明显降低，两组间表达水平差异有统计学意义（F=31.992，P < 0.01），见图 3。
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| 与脓毒症组表达水平比较，P < 0.01 图 3 iNOS mRNA相对表达水平 Figure 3 The relative expression level of iNOS mRNA |
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IL-12空白组和高压氧组两组表达水平较低且两组之间表达水平差异无统计学意义（P > 0.01）; 脓毒症+高压氧组的水平比脓毒症组明显降低（F=102.282，P < 0.01）。IL-10空白组和高压氧组两组表达水平较低且两组之间表达水平差异无统计学意义（P > 0.01）; 脓毒症+高压氧组的水平比脓毒症组明显升高（F=5 896.006，P < 0.01），见表 2。
| 组别 | 例数（n） | IL-12(pg/mL) | IL-10(pg/mL) |
| 空白组 | 6 | 9.11±2.75a | 5.92±0.31a |
| 脓毒症组 | 6 | 242.62±19.10b | 188.83±8.53b |
| 高压氧组 | 6 | 11.79±2.21c | 6.59±0.55c |
| 脓毒症+高压氧组 | 6 | 159.51±6.35d | 521.26±6.30d |
| 注：与空白组IL-12表达水平比较，bP < 0.01，cP > 0.01，dP < 0.01;与脓毒症组比较，dP < 0.01;与空白组IL-10表达水平比较，bP < 0.01，cP > 0.01，dP < 0.01;与脓毒症组比较，dP < 0.01 | |||
脓毒症可引起全身炎症反应综合征。大量研究证实，给予实验动物腹腔注射酵母多糖可诱导出全身炎症反应综合征模型。最早由Goris等[11]第一次向小鼠腹腔注射酵母多糖，后来研究者逐渐完善了相关的指标评定[12]。采用酵母多糖引发全身炎症反应动物模型能较好地模拟临床的全身炎症反应病理生理过程，在全身炎症反应的相关研究中已广泛应用[13]。酵母多糖引发全身炎症反应的发病过程不引入外源性细菌和内毒素, 致病因素明确，便于复制[14]。磁珠分选法纯化小鼠腹腔巨噬细胞的分选纯度比较高，但是其价格也相对较高。巨噬细胞在机体中分布广泛，具有功能多样性和异质性[15-16]。其暴露的病原体或者细胞因子微环境不同决定了巨噬细胞向M1型或M2型的分化[17]。巨噬细胞存在一系列连续的功能状态, 而M1型和M2型巨噬细胞是这一连续状态两个极端。巨噬细胞不同表型的转化对炎症性疾病的起始、发展以及终止起调节作用[18]。静息状态的巨噬细胞可识别脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等从而向M1型巨噬细胞转化[15, 19]，高表达iNOS、膜蛋白CD16/32和促炎细胞因子，如IL-12和肿瘤坏死因子（TNF-α）等; NOS主要分为三种亚型, Ⅰ型主要存在于神经细胞，称为神经型NOS（nNOS）; Ⅲ型主要存在于内皮细胞，称为内皮型NOS（eNOS）, eNOS和nNOS能在组织中固有表达，所以又称固有型NOS(cNOS); Ⅱ型主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞中，称为诱导型NOS（iNOS）。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-10、1L-13和转化生长因子-β(TGF-β)、糖皮质激素等诱导分化[15, 19]，高表达抑炎因子如IL-10、精氨酸酶1（Arg1）、甘露糖受体（CD206）、类几丁质酶（YM）等。通过表型鉴定巨噬细胞的类型, 在研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下所发挥的功能具有重要的意义。文献报道，iNOS可以用于鉴定M1型巨噬细胞[20]; 而Arg1则是鉴定M2型巨噬细胞的指标。
经本研究发现脓毒症+高压氧组小鼠72 h存活数16只，较脓毒症组小鼠9只明显增多，差异有统计学意义; 脓毒症+高压氧组小鼠外周血中促炎因子IL-12水平（159.51±6.35）pg/mL较脓毒症小鼠水平（242.62±19.10）pg/mL明显下降、抗炎因子IL-10水平（521.26±6.30）pg/mL较脓毒症小鼠水平（188.83±8.53）pg/mL明显上升，差异也有统计学意义。由此推断高压氧治疗能减轻脓毒症小鼠的炎症反应，对小鼠起保护作用。
本实验以F4/80+CD11b+iNOS+细胞表示腹腔M1型巨噬细胞，脓毒症+高压氧组小鼠M1型巨噬细胞的比例（2.25±0.16）%较脓毒症组比例（4.75±0.14）%明显下降，差异有统计学意义; 同时发现脓毒症+高压氧组小鼠iNOSmRNA的相对表达水平(39.62±1.74)与脓毒症组水平(48.32±3.34)相比呈现同样趋势，差异亦有统计学意义。因此，笔者认为高压氧治疗能抑制脓毒症小鼠M1型巨噬细胞的表达。
综上所述，高压氧治疗可以通过抑制M1（促炎）型巨噬细胞的表达减轻炎症反应，对机体起保护作用。相关机制可能与氧自由基，肾上腺素能以及胆碱能抗炎通路有关[21-22]，有待进一步研究。
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