中华急诊医学杂志  2018, Vol. 27 Issue (6): 611-614
蒙汉族早产儿呼吸窘迫综合征与S186N基因多态性相关性研究
梅花, 新春, 张钰恒, 刘春枝, 张亚昱, 刘春丽, 宋丹, 马金柱     
010050 呼和浩特,内蒙古医科大学附属医院新生儿科(梅花、新春、张钰恒、刘春枝、张亚昱、刘春丽、宋丹);普外科(马金柱)
摘要: 目的 研究蒙古族、汉族早产儿呼吸窘迫综合征(RDS)与肺表面活性物质蛋白(SP)C基因外显子5(exon5)区域基因多态性的相关性。方法 选择同时间、同民族和同群体中无血缘关系的蒙古族RDS早产儿50例(男31例,女19例)为实验组、汉族RDS早产儿50例为对照组(男27例,女23例),分别用聚合酶链式反应(PCR)基因多态性分析和基因检测技术对SP-C exon5区域基因进行测序,分别比较两组患儿SP-C exon5 c.715G > A(S186N)位点基因型频率的差异。结果 实验组中检测出SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点有3种基因型,为GG、AA、AG,三种基因型频率分别为28%、62%和10%,G等位基因频率为33%,A等位基因频率为67%;对照组三种基因型频率分别为78%、10%和12%,G等位基因频率为84%,A等位基因频率为16%;两组间A等位基因型频率的差异有统计学意义(χ2=53.300,P < 0.05)。结论 携带SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点A等位基因的蒙古族早产儿患RDS的风险更高。
关键词: S186N     呼吸窘迫综合征     蒙古族     汉族     早产儿     基因多态性     肺表面活性物质蛋白C     外显子    
The correlation between S186N gene polymorphism and the premature infants with respiratory distress syndrome in Mongolian and Han ethnic
Mei Hua , Xin Chun , Zhang Yuheng , Liu Chunzhi , Zhang Yayu , Liu Chunli , Song Dan , Ma Jinzhu     
Department of Pediatrics, (Mei H, Xin C, Zhang Yh, Liu Cz, Zhang Yy, Liu Cl, Song D); Department of Surgery, The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Huhehaote, Inner Mongolia 010050 China
Abstract: Objective To study the correlation between pulmonary surfactant protein C exon5 area's gene polymorphism and the premature infants with respiratory distress syndrome (RDS) among Mongolian and Han ethnic in Inner Mongolia District. Methods Fifty unrelated Mongolian RDS premature infants (28 weeks≤ gestational age < 37 weeks) were recruited as study group (31 male and 19 female), and another 50 unrelated Han ethnic RDS premature infants (28 weeks≤ gestational age < 37 weeks) were enrolled at the same time, as control group (27 male and 23 female).Polymerase chain reaction was used for gene polymorphism analysis and gene detection technology was employed to determine the sequence of SP-C gene exon5 area, respectively. At last, the difference in genotype frequency of SP-C gene exon 5 area C. 715G > A(S186 N) was compared between two groups. Results There were three genotypes could be checked out from SP-C gene exon 5 area C. 715G > A(S186N)locus; namely GG, AA, AG types, and in study group, genotype frequencies of these three genotypes were 28%, 62% and 10%, respectively, and G allele frequency was 33%, and A allele frequency was 67%. Genotype frequencies in control group were 78%, 10% and 12%, respectively, and G allele frequency was 84%, A allele frequency was 16%. The A allele genotype frequency in study group at SP-C exon 5 area C. 715G > A(S186N) significantly higher than that in control group. There was statistically significant difference in alleles variations between two groups (χ2 = 53.300, P < 0.05). Conclusions SP-C exon 5 area C. 715G > A(S186N)locus polymorphism related to Inner Mongolia Mongolian premature RDS. Individuals carrying SP-C exon 5 area C. 715G > A(S186N)A alleles have higher risk of suffering from RDS.
Key words: S186N     Respiratory distress syndrome     Mongolian nationlity     Han nationlity     premature infants     Gene polymorphism     Pulmonary surfactant surfactant proteinC     Exon    

肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的主要成分为肺表面活性物质蛋白(surfactant protein,SP)和磷脂。SP包含4种亚型,分别为SP-A、SP-B、SP-C与SP-D。其中SP-C与呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)的发生有着密切关联。PS的活性、功能与SP-C浓度和活性密切相关[1-2]。SP-C协助PS在肺泡表面的分布并维持其稳定性,参与降低肺泡表面张力[3]。SP-C等位基因改变与发生RDS密切相关,目前国内学者对SP-C基因多态性与RDS的相关性也有部分研究[4-5]。本研究比较蒙古族、汉族早产RDS患儿exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因型频率,分析其与发生RDS的相关性。

1 资料与方法 1.1 一般资料

以2013年9月至2016年1月在本院新生儿病房住院治疗的蒙古族RDS早产儿为实验组(RDS组),入组标准:①出生体质量1 000~5 000 g,28周≤胎龄 < 37周早产儿,性别比率大致均衡;②各入选患儿间无血缘关系;③符合欧洲颁布的RDS诊断标准[1]:生后不久呼吸困难进行性加重伴血氧下降,需要吸氧才能维持PaO2 > 50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),吸空气时PaO2 < 50 mmHg或有中心性发绀,同时有特异性胸片改变。以同期住院治疗的汉族RDS患儿为对照组。

排除标准:①遗传代谢性疾病患儿;②严重先天性疾病患儿;③生后窒息患儿;④母亲妊娠期糖尿病;⑤母亲孕期有明确感染史。

本研究经医院医学伦理委员会批准,血液样本采集均获得患儿家属知情同意。

1.2 方法 1.2.1 样本采集

收集及挑选样本相关临床资料,如姓名、性别、出生体质量及胎龄等。抽取各样本静脉血1.0 mL,放置抗凝管(EDTAK2)抗凝,置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 各样本基因组DNA的提取,浓度测定及PCR扩增

取1.0 mL静脉血按血液基因组DNA提取试剂盒Tanami Blood DNA Kit(离心柱型-目录号:DP318,北京安美生医药科技有限公司,中国)的操作说明书进行基因组DNA提取。将提取DNA浓度用Thermo仪器检测(北京安美生医药科技有限公司,中国),每次使用1 µL DNA液。DNA浓度用ng/µL表示,> 25 ng/µL以上说明所提取DNA浓度较高。从样本所提取出的DNA总量当中取出1~2 µL作为待扩增的基因;委托北京安美生医药科技有限公司合成的每一对引物可扩增长度为700 bp,将SP-C基因exon5区域全长分段扩增。按照TAKARA PCR Amplification Kit(Code No.:DR011,北京安美生医药科技有限公司,中国)试剂盒的说明进行PCR实验。PCR反应体系:6.25 µL灭菌水、4 µL DNTP、12.5 µL GCI、0.5 µL上游引物、0.5 µL下游引物、1 µL DNA、0.25 µL LA Taw酶。PCR的循环参数:预变性94℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s、退火52 ℃ 45 s、72 ℃延伸7 min,循环35次。特异扩增SFTPC exon5的引物见表 1

表 1 特异扩增SFTPB、SFTPC exon5的引物 Table 1 Primers for specific amplification of SFTPB and SFTPC exon5
扩增区域 引物序列 BP Tm GC% 扩增片段 测序所用引物
SFTPC-E3-4F ggaaag agggaagcgc atttgagtac 26 67.9 50 666 R
SFTPC-E3-4R ctggcagccaat gaggaacagtg 23 68.3 56.5
1.2.3 DNA目的片段的序列测定及采用PCR-RFLP技术检测多态性

取待测序样本及上下游引物各20 µL,干冰保存寄送至北京安美生医药科技有限公司,对SP-C exon5区域基因进行序列测定。应用NCBI数据库中的BLAST应用程序,将测序结果与数据库中的SP-C基因序列进行比对,SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因多态性分析。

1.3 统计学方法

应用美国SPSS13.0版本统计软件作统计分析。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用成组t检验;计数资料以百分比或率表示,采用四格表χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

入选的50例实验组中,男31例、女19例,胎龄29周+6~36周+6,出生体质量1 000~ 4 550 g,剖宫产36例,规律胎肺成熟38例。入选的50例对照组中,男27例、女23例,胎龄31周+6~36周,出生体质量1 063~3 300 g,剖宫产31例,规律胎肺成熟35例。两组研究对象以上几项一般情况比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 2

表 2 实验组与对照组患儿一般情况比较 Table 2 Comparison of general data of experiment group and control group
组别 例数 性别 胎龄 出生体质量 出生方式 是否规律促肺
(男/女) x±s, 周) x±s, g) 剖宫产/经产道 (是/否)
实验组 50 31/19 33.54±2.04 2024.80±659 36/14 38/12
对照组 50 27/23 34.11±1.35 2166.26±510 31/19 35/15
χ2/t 0.657 1.644 1.200 1.131 0.457
P 0.418 0.103 0.233 0.288 0.499
2.2 基因型频率比较

实验组中检测出SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点可检出三种基因型:即GG、AA、AG型。见(图 123)。RDS组此三种基因型频率分别为28%、62%和10%,G等位基因频率为33%,A等位基因频率为67%;对照组此三种基因型频率分别为78%、10%和12%,G等位基因频率为84%,A等位基因频率为16%;实验组A等位基因型频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=53.300,P < 0.05)见表 3

图 1 SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因多态性碱基序列图 Figure 1 Gene polymorphic sequence map of exon5 region c. 715G > A(S186N)

图 2 SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因多态性碱基序列图 Figure 2 Gene polymorphic sequence map of exon5 region c. 715G > A(S186N)

图 3 SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因多态性碱基序列图 Figure 3 Gene polymorphic sequence map of exon5 region c. 715G > A(S186N)

表 3 2组患儿SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点等位基因及基因型分布(例,%) Table 3 Allele and genotype distribution of SP-C gene exon5 region c.715G > A (S186N) loci in 2 groups (case, %)
组别 例数 基因型频率 等位基因频率
GG AA AG G A
实验组 50 14(28) 31(62) 5(10) 33(33) 67(67)
对照组 50 39(78) 5(10) 6(12) 84(84) 16(16)
χ2 30.661 53.300
P < 0.05 < 0.05
3 讨论

RDS是新生儿较常见的呼吸系统危重症之一,其发病率及死亡都很高,其发病机制是由于PS缺乏而导致肺泡表面张力增加引起肺泡塌陷,发病受多因素影响,男孩,剖宫产、母亲糖尿病、多胎、生后窒息是其危险因素[6-7]。虽然早产是发生RDS的危险因素之一,但其发病还受种族、胎膜早破、性别、多胎、产前是否规律促肺成熟、母亲患有疾病等相关因素的影响。

近年来国内外研究者对RDS的发病机制及治疗等方面研究较多[8-9]。尤其SP-C的独特结构和生理功能方面广泛研究,目前实验和临床研究证实SP-C结构和功能异常与SP-C基因变异有关[10]。国外研究发现新生儿发生RDS与SP-C基因转录水平有关,转录增高不易发生RDS[11]。2001年,Nogee等[12]通过研究一位母亲与她婴儿的基因,在同一个等位基因发现导致exon4的缺失,ProSP-C C端区域37个氨基酸缺失引起SP-C基因变异,这也证实了SP-C遗传缺陷属于常染色体显性遗传。文献报道SP-C基因变异有许多种类型,最常见于exon5区域,表明exon5区域是SP-C基因的变异热点。国内研究证实,SP-C基因编码区557位G→A杂合变异引起exon5区域S186N氨基酸改变[13]。但还有研究发现SP-C基因外显子4(T138N)、外显子5(S186N)位点基因多态性与内蒙古地区汉族RDS的发生无明显相关性[14],与本研究结果不一致,可能种族不同引起,需进一步研究证实。本研究发现SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点等位基因频率在蒙古族早产儿RDS组与汉族早产儿RDS组两组之间有显著性差异,蒙古族RDS组该位点以A等位基因型频率比汉族RDS组显著增高,表明携带SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点A等位基因的蒙古族患RDS的几率高。

参考文献
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