肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的主要成分为肺表面活性物质蛋白(surfactant protein,SP)和磷脂。SP包含4种亚型,分别为SP-A、SP-B、SP-C与SP-D。其中SP-C与呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)的发生有着密切关联。PS的活性、功能与SP-C浓度和活性密切相关[1-2]。SP-C协助PS在肺泡表面的分布并维持其稳定性,参与降低肺泡表面张力[3]。SP-C等位基因改变与发生RDS密切相关,目前国内学者对SP-C基因多态性与RDS的相关性也有部分研究[4-5]。本研究比较蒙古族、汉族早产RDS患儿exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因型频率,分析其与发生RDS的相关性。
1 资料与方法 1.1 一般资料以2013年9月至2016年1月在本院新生儿病房住院治疗的蒙古族RDS早产儿为实验组(RDS组),入组标准:①出生体质量1 000~5 000 g,28周≤胎龄 < 37周早产儿,性别比率大致均衡;②各入选患儿间无血缘关系;③符合欧洲颁布的RDS诊断标准[1]:生后不久呼吸困难进行性加重伴血氧下降,需要吸氧才能维持PaO2 > 50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),吸空气时PaO2 < 50 mmHg或有中心性发绀,同时有特异性胸片改变。以同期住院治疗的汉族RDS患儿为对照组。
排除标准:①遗传代谢性疾病患儿;②严重先天性疾病患儿;③生后窒息患儿;④母亲妊娠期糖尿病;⑤母亲孕期有明确感染史。
本研究经医院医学伦理委员会批准,血液样本采集均获得患儿家属知情同意。
1.2 方法 1.2.1 样本采集收集及挑选样本相关临床资料,如姓名、性别、出生体质量及胎龄等。抽取各样本静脉血1.0 mL,放置抗凝管(EDTAK2)抗凝,置-80℃冰箱保存备用。
1.2.2 各样本基因组DNA的提取,浓度测定及PCR扩增取1.0 mL静脉血按血液基因组DNA提取试剂盒Tanami Blood DNA Kit(离心柱型-目录号:DP318,北京安美生医药科技有限公司,中国)的操作说明书进行基因组DNA提取。将提取DNA浓度用Thermo仪器检测(北京安美生医药科技有限公司,中国),每次使用1 µL DNA液。DNA浓度用ng/µL表示,> 25 ng/µL以上说明所提取DNA浓度较高。从样本所提取出的DNA总量当中取出1~2 µL作为待扩增的基因;委托北京安美生医药科技有限公司合成的每一对引物可扩增长度为700 bp,将SP-C基因exon5区域全长分段扩增。按照TAKARA PCR Amplification Kit(Code No.:DR011,北京安美生医药科技有限公司,中国)试剂盒的说明进行PCR实验。PCR反应体系:6.25 µL灭菌水、4 µL DNTP、12.5 µL GCI、0.5 µL上游引物、0.5 µL下游引物、1 µL DNA、0.25 µL LA Taw酶。PCR的循环参数:预变性94℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s、退火52 ℃ 45 s、72 ℃延伸7 min,循环35次。特异扩增SFTPC exon5的引物见表 1。
扩增区域 | 引物序列 | BP | Tm | GC% | 扩增片段 | 测序所用引物 |
SFTPC-E3-4F | ggaaag agggaagcgc atttgagtac | 26 | 67.9 | 50 | 666 | R |
SFTPC-E3-4R | ctggcagccaat gaggaacagtg | 23 | 68.3 | 56.5 |
取待测序样本及上下游引物各20 µL,干冰保存寄送至北京安美生医药科技有限公司,对SP-C exon5区域基因进行序列测定。应用NCBI数据库中的BLAST应用程序,将测序结果与数据库中的SP-C基因序列进行比对,SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点基因多态性分析。
1.3 统计学方法应用美国SPSS13.0版本统计软件作统计分析。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用成组t检验;计数资料以百分比或率表示,采用四格表χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般情况入选的50例实验组中,男31例、女19例,胎龄29周+6~36周+6,出生体质量1 000~ 4 550 g,剖宫产36例,规律胎肺成熟38例。入选的50例对照组中,男27例、女23例,胎龄31周+6~36周,出生体质量1 063~3 300 g,剖宫产31例,规律胎肺成熟35例。两组研究对象以上几项一般情况比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 2。
组别 | 例数 | 性别 | 胎龄 | 出生体质量 | 出生方式 | 是否规律促肺 |
(男/女) | (x±s, 周) | (x±s, g) | 剖宫产/经产道 | (是/否) | ||
实验组 | 50 | 31/19 | 33.54±2.04 | 2024.80±659 | 36/14 | 38/12 |
对照组 | 50 | 27/23 | 34.11±1.35 | 2166.26±510 | 31/19 | 35/15 |
χ2/t值 | 0.657 | 1.644 | 1.200 | 1.131 | 0.457 | |
P值 | 0.418 | 0.103 | 0.233 | 0.288 | 0.499 |
实验组中检测出SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点可检出三种基因型:即GG、AA、AG型。见(图 1、2、3)。RDS组此三种基因型频率分别为28%、62%和10%,G等位基因频率为33%,A等位基因频率为67%;对照组此三种基因型频率分别为78%、10%和12%,G等位基因频率为84%,A等位基因频率为16%;实验组A等位基因型频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=53.300,P < 0.05)见表 3。
组别 | 例数 | 基因型频率 | 等位基因频率 | ||||
GG | AA | AG | G | A | |||
实验组 | 50 | 14(28) | 31(62) | 5(10) | 33(33) | 67(67) | |
对照组 | 50 | 39(78) | 5(10) | 6(12) | 84(84) | 16(16) | |
χ2值 | 30.661 | 53.300 | |||||
P值 | < 0.05 | < 0.05 |
RDS是新生儿较常见的呼吸系统危重症之一,其发病率及死亡都很高,其发病机制是由于PS缺乏而导致肺泡表面张力增加引起肺泡塌陷,发病受多因素影响,男孩,剖宫产、母亲糖尿病、多胎、生后窒息是其危险因素[6-7]。虽然早产是发生RDS的危险因素之一,但其发病还受种族、胎膜早破、性别、多胎、产前是否规律促肺成熟、母亲患有疾病等相关因素的影响。
近年来国内外研究者对RDS的发病机制及治疗等方面研究较多[8-9]。尤其SP-C的独特结构和生理功能方面广泛研究,目前实验和临床研究证实SP-C结构和功能异常与SP-C基因变异有关[10]。国外研究发现新生儿发生RDS与SP-C基因转录水平有关,转录增高不易发生RDS[11]。2001年,Nogee等[12]通过研究一位母亲与她婴儿的基因,在同一个等位基因发现导致exon4的缺失,ProSP-C C端区域37个氨基酸缺失引起SP-C基因变异,这也证实了SP-C遗传缺陷属于常染色体显性遗传。文献报道SP-C基因变异有许多种类型,最常见于exon5区域,表明exon5区域是SP-C基因的变异热点。国内研究证实,SP-C基因编码区557位G→A杂合变异引起exon5区域S186N氨基酸改变[13]。但还有研究发现SP-C基因外显子4(T138N)、外显子5(S186N)位点基因多态性与内蒙古地区汉族RDS的发生无明显相关性[14],与本研究结果不一致,可能种族不同引起,需进一步研究证实。本研究发现SP-C exon5区域c.715G > A(S186N)位点等位基因频率在蒙古族早产儿RDS组与汉族早产儿RDS组两组之间有显著性差异,蒙古族RDS组该位点以A等位基因型频率比汉族RDS组显著增高,表明携带SP-C基因exon5区域c.715G > A(S186N)位点A等位基因的蒙古族患RDS的几率高。
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