高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）是一种存在于真核细胞核内与染色体紧密结合，参与维持核苷酸稳定和调控基因转录的非组蛋白。研究证实，HMGB1可被分泌至细胞外，作为一种免疫激活信号，可直接活化抗原呈递细胞和介导初始T细胞分化^[1]。笔者既往研究证实，HMGB1在体外可直接介导T淋巴细胞Th1/Th2功能性分化，并与其刺激剂量及时间呈相关性^[2]，但目前对于其中受体机制尚不明确。鉴于糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)为HMGB1一个重要受体^[3]，本研究通过体外实验探讨HMGB1对CD4⁺T细胞Th1/Th2功能性分化的调控作用是否与RAGE相关，旨在既往研究基础上进一步阐明HMGB1对T淋巴细胞免疫调节的受体机制。

培养液RPMI 1640、10%胎牛血清和其他细胞培养材料均购自北京天润善达生物科技公司；重组HMGB1（rhHMGB1，编号1690-HMB）、刀豆素A（ConA，编号2656）来源于R & D公司；抗小鼠CD4⁺T淋巴细胞MieroBeads（编号130-090-860）购自MiltenyiBiotee公司；RAGE中和抗体为Immunoway Technology公司产品（编号YT3993）；小鼠干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（interleukin 4, IL-4）检测ELISA试剂盒购自美国Biosouree公司（编号分别为MBS734963，MBS2882941）；总RNA提取Trizol试剂盒（编号LS1040）、逆转录-试剂盒（编号A5001）均为美国Promega公司产品；RealMasterMix(SYBRGreen)试剂盒来源于北京天根生化科技公司；荧光定量PCR引物及内参照β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成。

BALB/c小鼠禁食8 h，处死后固定、皮肤消毒，无菌留取脾脏，置于平皿中，用1 mL注射器和25 G针头将500 μL胶原酶D注入每个脾脏，将组织切成小片。脾脏碎片在37 ℃孵育25 min，加入10 mmol/L EDTA后再孵育5 min；用活塞在钢网上研磨，用缓冲液洗平皿和滤网。收集细胞悬液，注入尖体离心管中，1 500 r/min×5 min离心，弃上清，加入3 mL PBS制成细胞悬液后，加入到6 mL淋巴细胞分离液中，3 000 r/min×15 min离心，可见中间层云雾状低密度细胞层，小心吸出后用PBS离心洗涤2次得到淋巴细胞悬液；进一步采用MiniMACs免疫磁性分离系统进行分离CD4⁺T细胞，通过孵育、分选、洗脱等步骤得到CD4⁺T细胞；台盼蓝检测分离细胞的活性大于97%，用10%FCS-RPMl l640完全培养基重悬CD4⁺T细胞，备用。

将CD4⁺T细胞调整浓度为2×10⁶/L，接种至96孔培养板，0.2 mL/孔，37 ℃5%CO₂孵箱孵育2 h使得细胞适应体外环境，加入终浓度为3 μg/L的ConA，孵育12 h；在实验中依据HMGB1刺激剂量随机分成4组：对照组、10 ng/mL组、100 ng/mL组和1 000 ng/mL，分别在不同组别加入相应PBS或溶于PBS的相应终浓度的HMGB1，刺激12 h、24 h和48 h时间点收集细胞上清液，检测白介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）浓度，计算两者比值。分析HMGB1对于CD4⁺T细胞Th1/Th2分化影响的量效和时效关系，选择最佳刺激剂量及时间；根据选定HMGB1刺激时间剂量，调整CD4⁺T细胞浓度为2×10⁶/L，实验分组分为对照组、A组(HMGB1刺激)、B组（HMGB1+PBS刺激）、C组（HMGB1+RAGE抗体刺激）；A、B、C组加入HMGB1工作液，对照组则加入等量的HMGB1工作液的溶剂PBS液；C组提前2 h加入经PBS液1:200稀释的RAGE中和抗体，终浓度为5 μg/L；B组加入相同体积的PBS液；每组4个重复孔，HMGB1刺激相应时间后，收集培养上清液和细胞标本。

严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作步骤进行。

收集各组处理后的细胞，加入150 μL/孔RIPA裂解液，轻轻吹打混匀；裂解液转移至离心管防止冰上20 min，4 ℃ 12 000×g离心30 min；取上清，用BCA法进行蛋白定量；利用上样缓冲液对样本蛋白浓度进行标化，100 ℃水浴5 min，各组50 μg蛋白上样，进行十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法进行蛋白转膜。含5%牛血清白蛋白封闭液封闭1.5 h。先后予以RAGE一抗4 ℃孵育过夜（1:1 000），二抗室温孵育1 h（1:5 000）；洗涤、显影、灰度扫描后，以目的蛋白条带和内参β-actin条带灰度比值表示RAGE蛋白表达情况。

收取各组2×10⁷细胞，采用Trizol萃取法提取细胞总RNA，利用逆转录-试剂盒进行cDNA合成，具体操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行；反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和实时荧光定量PCR仪进行定量检测；内参β-actin上游引物为5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG -3’，下游引物为5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG -3’。RAGE上游引物为5’-GCC CTC CAG TCT ACT CTC G-3’，下游引物为5’-TGT GTG GCC ACC CAT TCC AG-3’。CATA-3上游引物为5’-ATA CTG GAA GGG TGG TGA GGT-3’，下游引物为5’-TCC AAA AAG TGC AAA AAG GTG-3’。采用7500型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行PCR循环检测，PCR反应条件：95 ℃变性20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40循环，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，Gelpro32分析软件进行分析，取目的基因相对值（目的基因/β-actin）进行比较。

用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，并用LSD-t检验进行组间两两比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

鉴于CD4⁺T淋巴细胞可分化成以分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等促炎细胞因子的Th1细胞和以IL-4、IL-10等为主的Th2细胞^[4]，本实验中分别检测IFN-γ、IL-4表达情况，采用两者比例来评估Th1/Th2分化情况。如图 1A所示，与对照组相比，10 ng/mL的HMGB1刺激CD4⁺T细胞IFN-γ/IL-4比值明显升高（P < 0.05），而100 ng/mL、1 000 ng/mL HMGB1刺激CD4⁺T细胞IFN-γ/IL-4比值显著降低（P < 0.05）；而100 ng/mL的HMGB1刺激CD4⁺T细胞24h，IFN-γ/IL-4比值显著降低（P < 0.05），48 h则更为明显（P < 0.05）；结合本实验结果以及既往文献[5]报道，本研究中选择HMGB1刺激浓度为100 ng/mL，刺激时间为24 h。

与对照组比较，aP < 0.05 图 1 HMGB1对CD4+T细胞Th1/Th2功能性分化的影响 Figure 1 The effect of HMGB1 on Th1/Th2 differentiation of CD4+ T lymphocytes

图选项

如图 2A所示，与对照组比较，100 ng/mL HMGB1刺激CD4⁺T细胞24 h，A组的RAGE蛋白表达显著升高（P < 0.05）；RAGE mRNA较对照组亦明显升高（图 2B）（P < 0.05）。

与对照组比较，aP < 0.05 图 2 HMGB1对CD4+T细胞RAGE表达的影响 Figure 2 The effect of HMGB1 on expression of RAGE in CD4+ T lymphocytes

图选项

如表 1和图 3所示，与对照组比较，A组IFN-γ/IL-4明显降低（P < 0.05），GATA3 mRNA显著升高（P < 0.05）；而与A组比较，C组IFN-γ/IL-4显著升高（P < 0.05），GATA3 mRNA下降（P < 0.05），而B组的IFN-γ/IL-4和GATA3 mRNA差异无统计学意义（P > 0.05）。

图 3 抗-RAGE中和抗体对CD4+T细胞GATA3 mRNA表达的影响 Figure 3 The effect of anti-RAGE neutralizing antibody on HMGB1-mediated GATA3 mRNA expression in CD4+ T lymphocytes

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如图 4所示，与对照组比较，A组RAGE表达显著增加（P < 0.05）；与A组比较，C组较A组RAGE表达明显降低（P < 0.05），而B组RAGE的表达差异无统计学意义（P > 0.05）；而C组较对照组RAGE的表达仍有明显增加（P < 0.05）。

与对照组比较，aP < 0.05；与A组比较，bP < 0.05 图 4 RAGE中和抗体对HMGB1介导CD4+T细胞RAGE表达的影响 Figure 4 The effect of anti-RAGE neutralizing antibody on HMGB1-mediated RAGE expression in CD4+ T lymphocytes

图选项

脓毒症（sepsis）是机体对于病原体感染而发生的全身炎症反应综合征，进一步发展可导致脓毒性休克（septic shock）、多脏器功能不全(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等，是ICU危重症患者主要死亡原因之一^[6]。业已明确，脓毒症发病过程中，T淋巴细胞增殖能力下降，数目减少，并出现了以白介素(IL)-4和IL-10生成增加为特征的Th2型免疫反应，最终导致机体免疫抑制状态的形成，是脓毒症发生和发展的重要因素^[7]。尽管如此，目前对于脓毒症相关的T细胞免疫功能紊乱形成的确切机制尚未阐明。

HMGB1最初作为一种在真核细胞核内参与维持核苷酸稳定和调控基因转录，与染色体紧密结合的非组蛋白而被人们所认识。在过去的十几年里，大量的研究证实，核内的HMGB1可由炎症细胞主动分泌和受损细胞被动释放两种方式分泌至细胞外。细胞外的HMGB1作为一种“免疫预警信号”通过激活各种免疫细胞，包括T淋巴细胞、调节性T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等^[8-9]，从而参与机体免疫功能的调节。在严重烫伤延迟复苏大鼠模型中，血清中HMGB1大量产生的同时，观察到T淋巴细胞免疫功能明显受到抑制，其中包括了其增殖能力、IL-2和IL-2R表达下降以及初始T细胞功能性分化向Th2漂移。而且，HMGB1特异性拮抗剂——丙酮酸乙酯（EP）治疗后可以一定程度逆转烫伤大鼠T细胞免疫抑制现象，提示HMGB1可能参与了T淋巴细胞免疫功能的调节^[10]。笔者既往研究证实，较大剂量HMGB1和延长刺激时间可直接导致T淋巴细胞增殖能力下降、IL-2分泌减少以及向Th2免疫反应分化^[2]。本研究资料也证实小剂量（10 ng/mL）HMGB1能诱导CD4⁺T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子增加，而100 ng/mL和1 000 ng/mL浓度的HMGB1刺激则导致CD4⁺T淋巴细胞功能性分化向Th2漂移，呈剂量依懒性；同样100 ng/mL HMGB1刺激24 h、48 h导致CD4⁺T淋巴细胞分泌Th2型细胞因子增加，呈时效关系。尽管如此，目前对于HMGB1对T淋巴细胞免疫功能调控作用的受体机制尚未见报道。

RAGE是晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)的一种特征性细胞表面受体, 为免疫球蛋白超家族成员，活化后可激活细胞内氧化应激，调节蛋白激酶和核因子的活性。目前已知，RAGE是一个具有多种配体的受体，包括AGEs、S100蛋白、淀粉样蛋白-β肽(Aβ)、磷脂酰丝氨酸和HMGB1等^[11]。据报道，RAGE的配体影响DCs的分化，而DCs分泌的HMGB1对于初始T淋巴细胞的克隆增殖和功能性分化是需要的，提示HMGB1/RAGE细胞途径的激活，有助于获得性免疫反应的发生^[12]。Moser等^[13]发现RAGE存在于T淋巴细胞表面，包括静止期的CD4⁺ T细胞和CD8+ T细胞亚群，而且RAGE表达沉默的T细胞与野生型T细胞相比，其对于抗原诱导的T细胞增殖反应能力下降。因此笔者推测HMGB1可能通过RAGE受体途径调控CD4⁺ T细胞的功能性分化。本研究资料显示，HMGB1刺激下CD4⁺ T细胞RAGE蛋白和RAGE mRNA表达均显著上升，且采用RAGE中和抗体干预后能一定程度上逆转HMGB1介导的CD4⁺ T细胞向Th2分化。与本研究结果不同的是，Chen等^[14]利用RAGE基因敲除小鼠发现，RAGE-/-小鼠T淋巴细胞较野生型小鼠对于抗CD3 mAb和抗CD28 mAb刺激分泌更多IL-10；而采用RAGE小分子阻断剂TTP488干预野生型小鼠T细胞发现其分泌IFN-γ减少；RT-PCR发现在Th1型细胞因子环境下，RAGE mRNA表达水平明显增加，提示RAGE活化有助于T细胞向Th1功能性分化。因此，本研究观察了该剂量的RAGE中和抗体对HMGB1介导RAGE表达变化的影响，发现RAGE中和抗体干预下，与对照组比较，HMGB1介导RAGE表达增加并未完全受到抑制，RAGE仍有部分活化。由此，笔者认为本实验中该剂量的HMGB1可能过度激活了RAGE受体，从而导致下游信号通路的过度活化，产生了CD4⁺ T细胞向Th2分化。这与笔者在既往研究证实100 ng/mL HMGB1刺激T淋巴细胞24 h导致细胞内信号蛋白丝裂原活化激酶（MAPK）过度活化，而利用特异性阻断剂适当降低其活化程度可一定程度减轻HMGB1介导的T淋巴细胞功能性分化向Th2漂移^[2]相一致，但两者是否具有联系性仍有待于进一步研究。

核转录因子GATA3为Th2细胞分化特异性转录因子，其不仅能诱导初始T淋巴细胞向Th2功能性分化，还能对Th1细胞分化具有抑制作用^[15]。研究证实，坏死细胞所释放的核酸、免疫复合物以及组织蛋白可明显诱导T淋巴细胞GATA3表达增加，进一步诱导T淋巴细胞向Th2分化^[16]。因此，本实验利用RT-PCR检测了GATA3 mRNA表达，发现与对照组比较，HMGB1刺激能显著增强CD4⁺ T细胞GATA3 mRNA的表达，而RAGE中和抗体干预后能降低HMGB1介导的GATA3 mRNA的表达，进一步提示GATA3可能参与了HMGB1介导的CD4⁺ T细胞免疫功能障碍过程。

综上所述，本研究证实HMGB1介导T淋巴细胞向Th2功能性分化的免疫调控作用至少部分是通过过度活化RAGR/GATA3途径来实现的，在笔者既往研究基础上为HMGB1的免疫调节功能提供了一定理论基础。尽管如此，对于其中的详尽分子机制还有待于进一步研究；虽然RAGE是HMGB1第一个被识别的受体，但随着对HMGB1生物学功能的深入研究，发现HMGB1具有多种非特异性受体，如Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）等等，这些受体是否同样参与HMGB1对T细胞免疫功能调节过程目前仍然不清楚，有待以后的研究中逐步阐明。