中华急诊医学杂志  2018, Vol. 27 Issue (2): 215-219
Clin-TOF基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在临床病原菌鉴定中的应用评价
马继华, 黄洪, 沈凌炜, 周宏伟, 胡燕燕, 陈功祥     
310052 杭州,浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心(马继华);310009 杭州,浙江大学医学院附属第二医院检验科(黄洪、沈凌炜、周宏伟、胡燕燕、陈功祥)

随着科技地进步,细菌的鉴定方法不断改进,从最初地通过细菌形态、染色、抗原、生化和血清学等方法对细菌进行鉴定到后续的分子生物学方法,以及近些年来快速发展的质谱技术,使得临床微生物检验有了革命性的发展[1-2]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)具有快速、准确、高通量、操作简单等优点,不仅可准确鉴定临床细菌和酵母菌,还可用于分枝杆菌、丝状真菌的鉴定[3-4],微生物分类学和流行病学的研究[5-6],直接样本的快速检测以及细菌耐药方面的研究[7]

目前商品化质谱主要包括Biotyper MS (BrukerDaltonics, Bremen, Germany)与Vitek MS (bioMérieux, Marcy-l’ Etoile, France)。而国内临床质谱仪的自主研发生产逐渐成熟,并且开始走进临床实验室。国产Clin-TOF质谱仪(毅新博创,北京,中国)已通过SFDA,FDA认证,可用于临床病原微生物的鉴定。目前Clin-TOF系统的研究多局限于生物标志物及特定菌种的研究[8-9],用于临床细菌的鉴定还未有系统的评价。本研究旨在使用Clin-TOF系统对临床病原菌进行鉴定,评价其性能,使得国产质谱仪更好地在临床应用和推广。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

收集2015年12月至2016年12月浙江大学医学院附属第二医院临床分离非重复菌株1259株,样本种类包括:血液、痰液、脑脊液、分泌物和尿液等。

1.1.2 试剂与仪器

Vitek2 compact细菌鉴定系统和药敏系统(BioM6rieux公司,里昂,法国);Clin-TOF基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Clin-TOF MS) (北京毅新博创生物科技有限公司,北京,中国);PCR扩增仪及紫外成像系统(德国Biometra公司,耶拿,德国);DYY-1l型电泳仪(北京市六一仪器厂,北京,中国);PCR反应试剂盒[(宝生物工程(大连)有限公司,大连,中国)];细菌和真菌基因组DNA小量质粒抽提试剂盒[(爱思进生物技术(杭州)有限公司,杭州,中国)];Clin-TOF MS专用试剂盒(北京毅新博创生物科技有限公司,北京,中国)。

1.2 方法 1.2.1 菌种分离鉴定

临床常规细菌分离鉴定采用Vitek-2 Compact全自动细菌鉴定仪,对于只能鉴定到复合群或未给出结果以及疑似鉴定不准确细菌,进行PCR扩增。常规细菌采用16S rRNA,不动杆菌复合群采用16S-23S rRNA,洋葱伯克霍尔德菌采用hisA,酵母菌采用ITS分别扩增,引物序列及条件按照文献报道[10-12]。PCR产物送至上海生物工程股份有限公司,测序结果与基因文库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对,确定菌种。

1.2.2 质谱鉴定

采用直接涂布法将细菌单菌落均匀涂布于Clin-TOF专用靶板(384孔)上,干燥后加1 μL飞行时间质谱系统微生物前处理试剂盒组分Ⅰ,干燥后再添加1 μL组分Ⅱ(使用前震荡混匀),室温干燥后使用Clin-TOF质谱仪进行检测。在线性模式下设置如下参数:激光频率20 Hz、加速电压20 kV、脉冲电压1.9 kV、离子透镜电压5 kV、相对分子质量范围2 000~13 000。将质谱图导入BioExplorer V2.0软件数据库,生成鉴定报告。

2 结果 2.1 鉴定结果

本次研究收集到1 259株临床菌株覆盖134个种,主要包括非发酵菌,肠杆菌科细菌,葡萄球菌,肠球菌,链球菌,棒状杆菌,芽孢杆菌,奴卡菌,放线菌,奈瑟氏菌,厌氧菌,酵母菌以及其他临床细菌,Clin-TOF质谱对这1 259株临床细菌的属水平鉴定准确率为97.06% (1 222/1 259),种水平(包括鉴定到复合群)鉴定准确率为96.67% (1 217/1 259),其中对84种的细菌都能准确鉴定,包括临床常见葡萄球菌(85株),肠球菌(57株),念珠菌(62株)鉴定准确率均为100%。对21种肠杆菌科细菌(407株),除枸橼酸杆菌外,其他细菌均鉴定准确,种水平鉴定准确率为98.7%(400/407)。对13种链球菌种水平鉴定准确率为98.04%(100/102),属水平鉴定率100%,见表 1

表 1 Clin-TOF MS对1259株临床病原菌鉴定结果 Table 1 Results of 1259 clinical isolates identified by Clin-TOF MS
细菌种类 菌株数 有结果的细菌株数(%)
准确鉴定的水平 鉴定错误 无鉴定结果
种水平 复合群 属水平
非发酵菌 371 293(79.0) 78(21.0) 0(0) 0(0) 0(0)
  鲍曼不动杆菌 152 152(100) - - - -
  铜绿假单胞菌 85 85(100) - - - -
  嗜麦芽寡养单胞菌 36 36(100) - - - -
  脑膜脓毒伊金氏菌 8 8(100) - - - -
  琼氏不动杆菌 2 2(100) - - - -
  唐菖蒲伯克霍尔德菌 2 2(100) - - - -
  蒙氏假单胞菌 1 1(100) - - - -
  泰国伯克霍尔德菌 1 1(100) - - - -
  维氏气单胞菌 1 1(100) - - - -
  约翰逊不动杆菌 1 1(100) - - - -
  腐败希瓦菌 2 1(50) 1(50) - - -
  吡咯菌素伯克霍尔德菌 3 - 3(100) - - -
  产吲哚黄杆菌 1 - 1(100) - - -
  多嗜伯克霍尔德菌 17 - 17(100) - - -
  花园伯克霍尔德菌 1 - 1(100) - - -
  皮氏不动杆菌 5 - 5(100) - - -
  嗜水气单胞菌 1 - 1(100) - - -
  双栖伯克霍尔德菌 2 - 2(100) - - -
  新洋葱伯克霍尔德菌 23 - 23(100) - - -
  洋葱伯克霍尔德菌 17 - 17(100) - - -
  医院感染不动杆菌 4 - 4(100) - - -
  越南伯克霍尔德菌 1 - 1(100) - - -
  栖稻假单胞菌 2 2(100) - - - -
  放射不动杆菌 1 1(100) - - - -
  拉氏无色杆菌 1 - 1(100) - - -
  木糖无色杆菌 1 - 1(100) - - -
肠杆菌科细菌 407 349(85.7) 51(12.5) 0(0) 7(1.7) 0(0)
  肺炎克雷伯菌 129 129(100) - - - -
  大肠埃希菌 108 108(100) - - - -
  产气肠杆菌 32 32(100) - - - -
  粘质沙雷菌 20 20(100) - - - -
  摩根摩根菌 7 7(100) - - - -
  解鸟氨酸拉乌尔菌 5 5(100) - - - -
  沙门菌属 5 5(100) - - - -
  科氏枸橼酸杆菌 4 4(100) - - - -
  产酸克雷伯菌 2 2(100) - - - -
  普通变形杆菌 1 1(100) - - - -
  斯氏普罗威登菌 1 1(100) - - - -
  弗劳地枸橼酸杆菌 22 17(77.3) - - 5(22.7) -
  布氏枸橼酸杆菌 7 5(71.4) - - 2(28.6) -
  阿氏肠杆菌 8 - 8(100) - - -
  阪崎肠杆菌 1 - 1(100) - - -
  霍氏肠杆菌 14 - 14(100) - - -
  克氏肠杆菌 6 - 6(100) - - -
  路氏肠杆菌 1 - 1(100) - - -
  阴沟肠杆菌 21 - 21(100) - - -
  奇异变形杆菌 12 12(100) - - - -
  迟钝爱德华菌 1 1(100) - - - -
葡萄球菌属 85 85(100) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
  金黄色葡萄球菌 28 28(100) - - - -
  表皮葡萄球菌 24 24(100) - - - -
  溶血葡萄球菌 8 8(100) - - - -
  头葡萄球菌 8 8(100) - - - -
  路邓葡萄球菌 2 2(100) - - - -
  腐生葡萄球菌 1 1(100) - - - -
  木糖葡萄球菌 1 1(100) - - - -
  松鼠葡萄球菌 1 1(100) - - - -
  科氏葡萄球菌 6 6(100) - - - -
  人葡萄球菌 6 6(100) - - - -
肠球菌属和链球菌属 169 149(88.2) 14(8.3) 2(1.2) 4(2.4) 0(0)
  屎肠球菌 39 39(100) - - - -
  粪肠球菌 16 16(100) - - - -
  鸟肠球菌 2 2(100) - - - -
  无乳链球菌 10 10(100) - - - -
  化脓性链球菌 8 8(100) - - - -
  停乳链球菌 5 5(100) - - - -
  副血链球菌 4 4(100) - - - -
  溶血孪生球菌 4 4(100) - - - -
  变异链球菌 3 3(100) - - - -
  咽峡炎链球菌 3 3(100) - - - -
  泛口腔链球菌 2 2(100) - - - -
  嵴链球菌 1 1(100) - - - -
  肺炎链球菌 30 29(96.7) - 1(3.3) - -
  唾液链球菌 18 17(94.4) 1(5.6) - - -
  缓症链球菌 6 4(66.7) 2(33.3) - - -
  毗邻颗粒链菌 5 1(20.0) - - 4(80.0) -
  口腔链球菌 11 - 11(100) - - -
  婴儿链球菌 1 - - 1(100) - -
  解没食子酸链球菌 1 1(100) - - - -
棒状杆菌和芽孢杆菌 56 52(92.9) 1(1.8) 0(0) 0(0) 3(5.4)
  纹带棒杆菌 40 40(100) - - - -
  假白喉棒杆菌 2 2(100) - - - -
  接近棒杆菌 1 1(100) - - - -
  解谷氨酸棒杆菌 1 1(100) - - - -
  金黄微杆菌 1 1(100) - - - -
  抗逆棒杆菌 1 1(100) - - - -
  斯特拉斯堡棒杆菌 1 1(100) - - - -
  无枝菌酸棒杆菌 3 2(66.7) 1(33.3) - - -
  假生殖器棒状杆菌 1 - - - - 1(100)
  结核硬脂酸棒状杆菌 1 - - - - 1(100)
  科伊尔棒状杆菌 1 - - - - 1(100)
  灿烂类芽孢杆菌 1 1(100) - - - -
  坚强芽孢杆菌 1 1(100) - - - -
  蜡样芽胞杆菌 1 1(100) - - - -
诺卡菌属和放线菌属 10 2(20.0) 0(0) 0(0) 0(0) 8(80.0)
  巴西诺卡菌 1 - - - - 1(100)
  北京诺卡菌 1 - - - - 1(100)
  皮疽诺卡菌 1 - - - - 1(100)
  龋齿放线菌 2 - - - - 2(100)
  口腔放线菌 3 - - - - 3(100)
  纽氏放线菌 2 2(100) - - - -
奈瑟氏菌属 18 15(83.3) 0(0) 2(11.1) 0(0) 1(5.6)
  浅黄奈瑟菌 9 9(100) - - - -
  粘液奈瑟菌 5 5(100) - - - -
  猴奈瑟菌 1 1(100) - - - -
  灰色奈瑟菌 2 - - 2(100) - -
  长奈瑟氏球菌 1 - - - - 1(100)
厌氧菌 10 6(60) 0(0) 0(0) 0(0) 4(40.0)
  脆弱类杆菌 2 2(100) - - - -
  痤疮丙酸杆菌 2 2(100) - - - -
  发酵乳杆菌 2 2(100) - - - -
  贪婪丙酸杆菌 3 - - - - 3(100)
  约翰逊乳杆菌 1 - - - - 1(100)
其他菌属 71 60(84.5) 0(0) 1(1.4) 3(4.2) 7(9.9)
  粘滑罗斯菌 19 19(100) - - - -
  副流感嗜血杆菌 15 15(100) - - - -
  流感嗜血杆菌 10 10(100) - - - -
  河流漫游球菌 2 2(100) - - - -
  皮氏罗尔斯顿菌 2 2(100) - - - -
  缺陷乏养菌 2 2(100) - - - -
  奥斯陆莫拉菌 1 1(100) - - - -
  耳炎戈登菌 1 1(100) - - - -
  霍乱弧菌 1 1(100) - - - -
  气罗氏菌 1 1(100) - - - -
  乳酪短杆菌 1 1(100) - - - -
  沙梨欧文氏菌 1 1(100) - - - -
  索氏梭菌 1 1(100) - - - -
  佐治亚克吕沃尔氏菌 1 1(100) - - - -
  卡他莫拉菌 3 2(66.7) - 1(33.3) - -
  大芬戈尔德菌 2 - - - - 2(100)
  分散泛菌 2 - - - 2(100) -
  根癌土壤杆菌 1 - - - 1(100) -
  解脲寡源菌 1 - - - - 1(100)
  念珠状链杆菌 1 - - - - 1(100)
  偶发分枝杆菌 1 - - - - 1(100)
  龋齿罗氏菌 1 - - - - 1(100)
  腿伤凯斯特菌 1 - - - - 1(100)
念珠菌属 62 62(100) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
  白色念珠菌 28 28(100) - - - -
  热带念珠菌 24 24(100) - - - -
  近平滑念珠菌 6 6(100) - - - -
  光滑念珠菌 3 3(100) - - - -
  阿萨希丝孢酵母 1 1(100) - - - -
总计 1259 1073(85.2) 144(11.4) 5(0.4) 14(1.1) 23(1.8)
2.2 复合群菌种和属水平鉴定

本次研究选取菌株中包括临床常见复合群中细菌,通过生化方法,16S rRNA、16S-23S rRNA、hisA等基因扩增方法鉴定到种水平,Clin-TOF将144株细菌鉴定到各自所在复合群,包括阴沟肠杆菌复合群、缓症链球菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鲍曼不动杆菌复合群、产吲哚/黏金黄杆菌复合群、豚鼠/嗜水/简氏气单胞复合群、木糖氧化无色杆菌复合群、无枝菌酸棒杆菌/干瘪棒杆菌以及腐败希瓦菌/海藻希瓦菌复合群。

5株细菌鉴定到属水平(1株卡他莫拉菌,2株灰色奈瑟氏菌,1株肺炎链球菌,1株婴儿链球菌)。

2.3 错误鉴定和无鉴定结果

鉴定错误的细菌比例为1.08%(14/1 259),无鉴定结果比例为1.83%(23/1 259),表 1

3 讨论

MALDI-TOF MS具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等特点,已成为一项高效的微生物快速鉴定技术,被用于全球的临床微生物实验室,并有望逐步取代常规的检测方法。目前在中国大陆临床广为推广的两种质谱系统(Biotyper MS和Vitek MS)已经非常成熟,其对临床常见的细菌鉴定结果准确率都达到了95%以上[1-2]。鉴于质谱仪在病原菌鉴定上的优势,近两年出现了包括Clin-TOF在内的国产质谱仪,本研究针对临床常见的病原菌采用Clin-TOF进行鉴定并评估该仪器的性能。结果显示对于1 259株临床菌株(134个种),Clin-TOF鉴定到种水平准确率可达96.67%,属水平准确率为97.06%,显示Clin-TOF质谱用于临床细菌鉴定的性能十分优异,有文献报道用Biotyper MS对1 660株临床分离菌株(109个菌种)进行检测,并通过16S rRNA和rpoB基因测序确定[13]。结果显示属的鉴定水平达95%,种的鉴定水平在84%以上。而Vitek MS鉴定了767株常规临床分离株(124个种),同样采用直接涂布的方法,种水平准确率为86.7%,属水平准确率96.2%[14],从鉴定结果显示Clin-TOF在常规菌株的鉴定上完全不亚于BiotyperMS和Vitek MS。范欣等对Clin-TOF MS鉴定于革兰阴性菌的能力进行了评价,结果显示Clin-TOF MS对阴性杆菌的鉴定准确率高达98.05%[15],略高于本研究的鉴定准确率,这可能与所选菌种类别有关。并且值得一提的是Clin-TOF质谱具有一次同时鉴定384个样本的高通量靶板,且可重复使用,对临床样本量大的实验室具有更大的优势。

Clin-TOF质谱在酵母菌的鉴定上有一定的特色。目前真菌的鉴定方法主要包括显微镜形态学和生化反应以及DNA为基础的分子技术,如18S rRNA基因、内转录间隔区(ITS)DNA测序和实时PCR测定。文献报道采用质谱技术对真菌进行鉴定准确性不如细菌,102株酵母菌(14个不同种)分别采用Vitek MS和BioTyper MS进行检测,鉴定准确的酵母菌(准确率)分别为81个(79%)和92个(90%)[16]。目前尚无报道Clin-TOF MS对真菌鉴定能力的评估,而本次试验仅仅鉴定了62株临床分离的酵母菌,且多为念珠菌,Clin-TOF鉴定准确率为100%,因此有待以后采用更多的菌种和菌株进行评估。

临床上有一些较为常见但不易区分的细菌复合群主要包括醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合群、阴沟/霍氏肠杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、弗劳地枸橼酸杆菌复合群、缓症链球菌复合群等,这些复合群菌株基因型和表型非常相似,通常采用常规生化反应、全自动细菌鉴定和药敏系统以及16S rRNA都较难区分。虽然MALDI-TOF MS是利用细菌特征性蛋白进行区分,若细菌蛋白图谱太过相似也会无法区分,如链球菌属细菌中亲缘关系比较相近的唾液链球菌、口腔链球菌和缓症链球菌等[17],Clin-TOF对这类链球菌属的鉴定同样也将其分到缓症链球菌复合群中,因此本次试验将鉴定到复合群细菌认为准确鉴定到种。虽然Clin-TOF质谱数据库涵盖枸橼酸杆菌复合群中不同的菌种,主要包括:弗劳地枸橼酸杆菌、杨氏枸椽酸杆菌、布氏枸椽酸盐杆菌、沃克马尼枸椽酸盐杆菌、赛德拉克枸橼酸杆菌等。但从结果来看,还存在一定缺陷,本次研究中22株弗劳地枸橼酸杆菌中5株鉴定错误,其中4株鉴定为布氏枸橼酸杆菌,1株鉴定为杨氏枸橼酸杆菌;7株布氏枸橼酸杆菌中5株鉴定为弗劳地枸橼酸杆菌。因此Clin-TOF在具体细分复合群上还需要进一步优化数据库,若直接鉴定常见复合群中细菌还应辅以其他的方法对结果加以验证。

本次未给出鉴定结果的23株细菌主要为临床少见细菌,还包括一些环境菌,如根癌土壤杆菌、龋齿放线菌,奴卡菌属,这类细菌目前Clin-TOF数据库中还未包含,因此无鉴定结果,可进一步对数据库进行建库补充,以完善数据库提高这类细菌的鉴定准确率。随着质谱技术在国内的迅速发展,质谱的国产化也是非常重要的一个环节。对临床微生物实验室来说,需要建立MALDI-TOF MS的规范化使用,提升微生物鉴定的整体水平,最终更好的服务于临床。

参考文献
[1] Eigner U, Holfelder M, Oberdorfer K, et al. Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory[J]. Clin Lab, 2009, 55(78): 289-296.
[2] Martiny D, Busson L, Wybo I, et al. Comparison of the Microflex LT and Vitek MS systems for routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(4): 1313-1325. DOI:10.1128/JCM.05971-11
[3] Mediavilla-Gradolph MC, De Toro-Peinado I, Bermudez-Ruiz MP, et al. Use of MALDI-TOF MS for identification of nontuberculous mycobacterium species isolated from clinical specimens[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 854078. DOI:10.1155/2015/854078
[4] Becker PT, de Bel A, Martiny D, et al. Identification of filamentous fungi isolates by MALDI-TOF mass spectrometry: clinical evaluation of an extended reference spectra library[J]. Med Mycol, 2014, 52(8): 826-834. DOI:10.1093/mmy/myu064
[5] Spinali S, van Belkum A, Goering RV, et al. Microbial typing by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: do we need guidance for data interpretation?[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(3): 760-765. DOI:10.1128/JCM.01635-14
[6] 张婷婷, 于静波, 薛文成, 等. 质谱分析仪对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型的应用研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2016, 32(4): 730-732. DOI:10.11816/cn.ni.2016-150920
[7] 蔡加昌, 张嵘. MALDI-TOF MS在细菌耐药性检测中的应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2013, 33(2): 152-155. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2013.02.017
[8] Zheng H, Li R, Zhang J, et al. Salivary biomarkers indicate obstructive sleep apnea patients with cardiovascular diseases[J]. Sci Rep, 2014, 4: 7046. DOI:10.1038/srep07046
[9] Zhang Y, Liu Y, Ma Q, et al. Identification of Lactobacillus from the saliva of adult patients with caries using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e106185. DOI:10.1371/journal.pone.0106185
[10] 张嵘, 黄永禄, 喻华, 等. 洋葱伯克霍尔德菌复合群的分子分型和药敏情况比较[J]. 中华急诊医学杂志, 2013, 22(12): 672-675. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.12.032
[11] 吴伟根, 黄永禄, 杨旭峰, 等. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪在醋酸钙鲍曼不动复合群鉴定中的应用[J]. 中华检验医学杂志, 2013, 36(12): 1-5. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2013.12.012
[12] Khodadadi H, Karimi L, Jalali-Zand N, et al. Utilization of size polymorphism in ITS1 and ITS2 regions for identification of pathogenic yeast species[J]. J Med Microbiol, 2017, 66(2): 126-133. DOI:10.1099/jmm.0.000426
[13] Seng P, Drancourt M, Gouriet F, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Clin Infect Dis, 2009, 49(4): 543-551. DOI:10.1086/600885
[14] Dubois D, Grare M, Prere MF, et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(8): 2568-2576. DOI:10.1128/JCM.00343-12
[15] 范欣, 肖盟, 徐志鹏, 等. 国产基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统Clin-TOF-ⅡMS与Bruker Biotyper质谱系统在革兰阴性菌的鉴定效能评估[J]. 中华检验医学杂志, 2017, 40(1): 41-45. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2017.01.009
[16] Rosenvinge FS, Dzajic E, Knudsen E, et al. Performance of matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry for identification of clinical yeast isolates[J]. Mycoses, 2013, 56(3): 229-235. DOI:10.1111/myc.12000
[17] van Prehn J, van Veen SQ, Schelfaut JJ, et al. MALDI-TOF mass spectrometry for differentiation between Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pseudopneumoniae[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2016, 85(1): 9-11. DOI:10.1016/j.diagmicrobio