中华急诊医学杂志  2018, Vol. 27 Issue (2): 172-176
纳米银和二氧化钛对金黄色葡萄球菌核酸的影响
蒋旭宏, 黄小民, 周卫民, 王原, 何煜舟     
310006 杭州,浙江中医药大学附属第一医院急诊科(蒋旭宏、黄小民、何煜舟);310053 杭州,浙江中医药大学实验动物中心(周卫民);310006 杭州,浙江中医药大学附属第一医院微生物中心(王原)
摘要: 目的 研究纳米银(Ag)和二氧化钛(TiO2)两种无机抗菌剂对金黄色葡萄球菌核酸含量的影响,分析抗菌剂的抗菌作用机制。方法 制备牛肉膏蛋白胨液体培养基,分别测定纳米Ag和TiO2的最低抑菌浓度(MIC);以1/2MIC纳米Ag和TiO2浓度作用于金黄色葡萄球菌的培养液,用紫外分光光度计检测培养液中从菌体漏出的DNA和DNA等大分子物质含量,确定抗菌剂对细菌细胞膜的损伤程度;用荧光显微镜观察菌体荧光强度,确定菌体内核酸染色程度;并用荧光分光光度计测定荧光值,确定菌体内核酸DNA和RNA含量。结果 纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为5.781 μg/mL和1.6 mg/mL,以1/2MIC为作用浓度,纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比培养液上清液中漏出的DNA和DNA等大分子物质含量,结果差异无统计学意义(P > 0.05),菌体核酸染色荧光强度和DNA和RNA含量,结果显示纳米Ag组和TiO2组与对照组相比显著减少(P < 0.01)。结论 纳米Ag比TiO2对金黄色葡萄球菌具有明显抗菌作用,纳米Ag比TiO2有更强的抗菌性能;纳米Ag和TiO2的抗菌机制可能与抑制了金黄色葡萄球菌核酸DNA和RNA的合成有关,从而抑制细菌蛋白合成,抑制细菌的生长。
关键词: 纳米银     二氧化钛     金黄色葡萄球菌     核酸     抗菌机制     最低抑菌浓度     荧光强度     核酸含量     抗菌性能    
Inhibitory effects of nano silver and titanium dioxide on the nucleic acid of staphylococcus aureus
Jiang Xuhong , Huang Xiaomin , Zhou Weimin , Wang Yuan , He Yuzhou     
Emergency department, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006 China(Jiang XH, Huang XM, He YZ). Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053 China(Zhou WM). Clinical Microbiology Center, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006 China(Wang Y)
Abstract: Objective To study the effects of nano silver (Ag) and titanium dioxide (TiO2) on the content of nucleic acid in staphylococcus aureus in order to explore their antibacterial mechanisms. Methods After preparation of beef extract peptone liquid cultures, the effects of minimal inhibitory concentrations (MICs) of nano Ag and TiO2 on staphylococcus aureus strains were determined. With the 1/2 MICs nano Ag and TiO2, the contents of DNA and RNA macromolecules from staphylococcus aureus cultures were measured to determine the damage degree of staphylococcus aureus cell membranes by ultraviolet spectrophotometer, and then the fluorescence intensities of the staphylococcus aureus cells were observed under fluorescence microscope and the fluorescence values were tested by fluorescence spectrophotometer to determine the contents of nucleic acid DNA and RNA. Results The MICs of nano Ag and TiO2 were 1.6 mg/mL and 5.781 μg/mL. After treatment with the 1/2 MICs nano Ag and TiO2, nano Ag group and TiO2 group were compared with the control group (culture fluid without adding antibacterial agent), respectively, and there were no significant differences in the contents of DNA and RNA macromolecules from staphylococcus aureus cultures between n anoAg group and control group as well as between TiO2 group and control group were (P > 0.05), and there were significant decreases in fluorescence intensities and the contents of nucleic acid DNA and RNA (P < 0.01). Conclusions Nano Ag and TiO2 had obvious antibacterial effects on staphylococcus aureus and the antibacterial properties of nano Ag was stronger than that of TiO2. The antibacterial mechanisms of nano Ag and TiO2 against staphylococcus aureus may be associated with the inhibition of the synthesis of nucleic acid DNA and RNA, inhibiting protein synthesis and then bacterial growth.
Key words: Nano silver     Titanium dioxide     Staphylococcus aureus     Nucleic acid     Bactericidal mechanism     Minimal inhibitory concentration     Fluorescence intensity     Content of nucleic acid     antibacterial property    

呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)是危重病患者气管插管机械通气后的常见严重并发症, 发病率高达50%以上[1],引发VAP的病原菌主要是大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、白色假丝酵母菌等,临床常常培养出多重耐药甚至泛耐药的菌株,而且这些细菌容易形成生物被膜,使VAP控制更加困难[2-3]。特别是入住ICU的患者随着住院天数延长,感染风险明显升高,而且抗生素和糖皮质激素长期使用成为气管插管机械通气引发VAP的独立危险因素[4-5]。为了有效减少气管插管引发VAP的发生率,笔者研制了载银二氧化钛抗菌气管导管,显示了优异的导管表征性能,体外实验显示具有明确的抗菌作用,能够杀灭导管表面的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等菌株,而且具有良好的生物安全性和相容性[6]。但对纳米Ag和TiO2这两种无机抗菌材料的抗菌作用机理仍不够明确,为了能更好地促进纳米Ag和TiO2等抗菌无机物在临床中的应用,本研究以金黄色葡萄球菌为实验菌株,分析纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌核酸DNA和RNA的影响,阐明抗菌的作用靶点,从而为纳米Ag和TiO2相关抗菌医用材料的进一步开发利用提供基础。

1 材料与方法 1.1 材料

实验菌种为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25922),由浙江中医药大学附属第一医院微生物中心保存;纳米Ag和TiO2母液购于杭州万景新材料有限公司;氯化三苯基四氮唑(TTC)购于国药集团化学试剂有限公司;DAPI购于美国Sigma公司。

1.2 方法 1.2.1 试剂配制

制备牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3 g和蛋白胨10 g混合,加入氯化钠5 g,溶解至800 mL双蒸水(ddH2O),pH调节至7.2~7.4之间,定容至1 000 mL。

制备PBS Buffer:磷酸氢二钠14.6 g和磷酸二氢钠1.48 g混合,加入氯化钠43.83 g,溶解于1 000 mL蒸馏水中,定容至5 000 mL,加入氢氧化钠pH调节至7.2~7.4之间,高温高压湿热灭菌121℃ 20 min后,常温保存备用。

实验条件:在色温为5 000 k的荧光灯(D50)光照下,用滤光片滤去波长小于400 nm的光后开展以下实验。

1.2.2 纳米Ag和TiO2的MIC测定

于纯化好的金黄色葡萄球菌斜面中挑取少量菌种接种于牛肉膏液体培养基中,置于37℃,120 r/min的恒温培养箱中培养24 h,至对数生长期。使用牛肉膏蛋白胨液体培养基调节菌液浓度为106~107cfu/mL。取1.5 mL菌液接种于12孔板,加入10μL经倍比稀释的各组纳米Ag和TiO2液体,37℃,120 r/min摇床培养24 h,每孔加入150 μL浓度为0.2%的2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC),37℃,120 r/min避光培养4 h后,观察其颜色变化,确定MIC值。

实验分组:对照组不加抗菌剂的菌液;TiO2组:分别加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL倍比稀释TiO2的菌液;纳米Ag组分别加入0.723,1.445,2.891,5.781,11.560μg/mL倍比稀释纳米Ag的菌液。实验重复3次,取平均值。

1.2.3 培养液中DNA、RNA等大分子物质的测定

取少量对数生长期的金黄色葡萄球菌菌种,按2%接种量分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置于37℃,120 r/min摇床培养至对数期,收集菌体。经PBS清洗2次后制成一定浓度的菌悬液,然后分别加入终浓度1/2 MIC的纳米Ag和TiO2。菌液与抗菌剂相互作用至0,2,4,6,8 h时间点,分别取菌液3 mL,4 000 r/min离心10 min,用紫外分光光度计于260 nm下测定上清液中DNA和DNA等大分子物质的吸光值,确定培养液中从菌体溢出的DNA和DNA等大分子物质含量。实验重复3次,取平均值。

1.2.4 金黄色葡萄球菌菌体荧光强度检测

取少量对数生长期的金黄色葡萄球菌菌种,按2%接种量分别接种至浓度1/2 MIC的纳米Ag和TiO2的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置于37℃,120 r/min摇床培养24 h,然后取菌液量10μL,稀释200倍,取100μL稀释后的菌液于载玻片上,并滴加100μL DAPI染色液,混合均匀后避光静置10 min后,使用荧光显微镜观察菌体内核酸染色程度。实验重复3次,取平均值。

1.2.5 金黄色葡萄球菌菌体内核酸含量检测

取少量对数生长期的金黄色葡萄球菌菌种,按2%接种量分别接种至浓度1/2 MIC的纳米Ag和TiO2的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置于37℃,120rpm摇床培养。菌液与抗菌剂相互作用至12, 16, 20, 24 h时间点,分别取菌液50μL,并滴加150μL DAPI染色液,振荡10 min混合均匀,使用荧光分光光度计测定荧光值,分别确定菌体内核酸DNA和RNA含量。设置荧光参数364 nm测定DNA含量,设置荧光参数400 nm测定RNA含量。实验重复3次,取平均值。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 纳米Ag和TiO2的MIC检测结果

TTC是一种光敏感的脂溶性氧化还原剂,为无色的常用活性菌体染色剂,该染色剂进入菌体细胞后,与活细胞内的琥珀酸脱氢酶发生反应,TTC还原成红色的甲臜化合物,而死细胞不着色。检测结果显示,培养基的颜色随纳米Ag和TiO2浓度的增加而变浅,直至无色,表明纳米Ag和TiO2可抑制金黄色葡萄球菌的生长,且抑制作用随抗菌剂浓度的增加而增强,直至细菌被全部杀灭。根据培养基颜色由红色转变成无色,得出纳米Ag对金黄色葡萄球菌的MIC为5.781μg/mL,TiO2对金黄色葡萄球菌的MIC为1.6 mg/mL(见表 1)。可见在实验条件下,纳米Ag (μg/mL)比TiO2(mg/mL)具有更强的抗菌性能。

表 1 纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌的MIC检测结果 Table 1 The MICs of nano Ag and TiO2 against Staphylococcus aureus
组别 结果
对照组 ++        
纳米Ag (μg/mL) 0.723 1.445 2.891 5.781 11.560
++ ++ + - -
TiO2(mg/mL) 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
++ ++ + + -
注: “++”为红色;“+”为浅红色;“-”为无色
2.2 培养液中DNA、RNA等大分子物质含量测定结果

细胞膜遭到损伤后,通透性会发生改变,轻度损伤时可引起细胞内钾离子、钠离子等小分子物质的外漏,而严重损伤甚至细胞崩解时,细胞内的DNA、RNA等大分子物质就会漏到细胞外。金黄色葡萄球菌培养液中DNA、RNA等大分子物质的含量变化可以反映纳米Ag和TiO2对菌体细胞膜受损的严重程度。1/2 MIC的纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后,紫外分光光度计于260 nm下测定培养液上清液中DNA和RNA等大分子物质的吸光值(A260),检测结果显示,在相应时间点,上清液中DNA和DNA等大分子物质含量,纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比没有明显差异(P > 0.05),见表 2图 1。由此可见,纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌细胞膜未形成严重损伤或细胞膜崩解,导致DNA和RNA等大分子物质外漏。

表 2 金黄色葡萄球菌培养液中DNA、RNA等大分子物质A260的检测结果 Table 2 The A260 of DNA and RNA macromolecules from staphylococcus aureus cultures
组别 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h
对照组 0.008±0.003 0.014±0.004 0.023±0.008 0.029±0.008 0.037±0.008
纳米Ag组 0.008±0.003a 0.014±0.005a 0.023±0.008a 0.030±0.009a 0.038±0.008a
TiO2 0.009±0.004a 0.015±0.005a 0.024±0.009a 0.031±0.009a 0.038±0.007a
纳米Ag组与对照组比较 P=1.000 P=1.000 P=1.000 P=0.886 P=0.879
TiO2组与对照组比较 P=0.729 P=0.787 P=0.886 P=0.774 P=0.871
注:在相应时间点,纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比aP > 0.05。

图 1 金黄色葡萄球菌培养液中DNA、RNA等大分子物质的A260 Figure 1 The A260 of DNA and RNA macromolecules from staphylococcus aureus cultures
2.3 菌体内核酸DNA、RNA含量检测结果

DAPI是一种特殊的荧光染色剂,可以穿透细胞膜与DNA和RNA结合产生比DAPI强20多倍的显蓝色荧光,发挥标记作用,核酸含量越多,荧光强度也越强,以荧光值测定核酸含量。1/2 MIC的纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后,荧光显微镜(200×)观察菌体内DAPI与DNA或RNA结合后的荧光强度,结果显示纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌24 h后,荧光强度明显减弱,两组分别与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.01),见图 2。表明纳米Ag和TiO2可使金黄色葡萄球菌菌体内核酸含量减少。

图 2 纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后菌体内DNA、RNA荧光值 Figure 2 DNA and RNA content of staphylococcus aureus treated with nano Ag and TiO2

荧光分光光度计测定DNA和RNA荧光值,分别确定菌体内核酸DNA和RNA含量。结果显示,在纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后12, 16, 20, 24 h时间点,测定荧光值,两组DNA和RNA含量较对照组显著减少(P < 0.01),见表 34图 2。表明纳米Ag和TiO2可抑制金黄色葡萄球菌菌体内核酸DNA和RNA的合成。

表 3 纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后菌体内DNA荧光值 Table 3 DNA content of staphylococcus aureus treated with nano Ag and TiO2
组别 12 h 16 h 20 h 24 h
对照组 310.67±16.56 322.67±21.55 324.67±12.66 324.67±23.50
纳米Ag组 244.00±12.49b 217.33±7.64b 228.00±9.54b 249.67±15.04b
TiO2 173.67±18.61b 156.67±10.02b 186.00±10.82b 177.00±8.72b
纳米Ag组与对照组比较 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001
TiO2组与对照组比较 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001
注:在相应时间点,纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比bP < 0.01

表 4 纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后菌体内RNA荧光值 Table 4 RNA content of staphylococcus aureus treated with nano Ag and TiO2
组别 12 h 16 h 20 h 24 h
对照组 75.33±6.51 94.00±7.00 122.33±15.53 140±14.93
纳米Ag组 49.67±3.06b 71.00±3.61b 78.33±3.06b 79.00±6.24b
TiO2 38.00±3.61b 51.00±3.00b 53.00±2.65b 67.33±4.04b
纳米Ag组与对照组比较 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001
TiO2组与对照组比较 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001 P < 0.001
注:在相应时间点,纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比bP < 0.01
3 讨论

目前,由于临床中侵入性治疗方式越来越多,细菌感染风险增加,同时抗生素的广泛使用甚至滥用,致使细菌感染后出现广泛耐药、多重耐药,给临床治疗带来极大的困难[7]。虽然新型抗菌药物被开发出来,但出现细菌耐药的风险也很大,新药开发前景不容乐观[8]。临床如COPD急性发作中的重症感染患者由于病情反复发作、抗菌药物长期使用,甚至气管插管,致使铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等耐药菌产生,大多数为多重耐药[9]。这些患者由于呼吸道感染难以控制,极易出现脓毒症而致多器官功能衰竭,危及生命[10]。急危重病患者救治中常常进行气管插管机械通气、深静脉留置、有创血流动力学检测等侵入性治疗,极易引起导管相关性感染,也会导致脓毒症增加[11]。如何有效预防和控制感染是急诊领域的重要研究方向[12-14]

纳米Ag和TiO2是物理学界广泛使用的无菌抗菌物。纳米Ag具有接触式杀菌作用,是无机纳米抗菌材料中抗菌力最强的抗菌主体,本研究发现纳米Ag能与菌体中酶蛋白质巯基(-SH)迅速结合,使一些以此为必要基团的酶失去活力,达到强效抗菌、杀灭病毒的作用[16];TiO2具有光催化式杀菌作用,在可见光或紫外光的作用下具有很强的氧化还原能力,化学性能稳定、低毒、低成本[14],能将细菌、病毒和真菌等分解,能有效除去金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌等病原菌,抑制肠病毒、流行性感冒病毒、滤过性病毒等病原体,已被物理学界广泛使用在无菌实验室的设备、抗菌涂料等方面[15-16]。前期研究中,以纳米Ag和TiO2作为抗菌剂,以气管导管为基材,成功研制了纳米Ag和TiO2相关涂层的抗菌气管导管,用以防治VAP发生[17-18]。为进一步了解纳米Ag和TiO2对细菌的损伤机制和靶点,本研究以金黄色葡萄球菌作为研究菌株,观察纳米Ag和TiO2对细菌的核酸含量变化。首先检测了纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌的MIC值,分别为5.781μg/mL和1.6 mg/mL,显示了在实验光照下纳米Ag在更低的浓度下就能达到和TiO2相当的抗菌性能,可见纳米Ag比TiO2有更强的抗菌性;以1/2MIC为作用浓度,检测培养液上清液中金黄色葡萄球菌漏出的DNA、RNA等大分子物质含量,结果显示纳米Ag组和TiO2组分别与对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05),表明纳米Ag和TiO2作用金黄色葡萄球菌后DNA、RNA等成分漏出不明显,纳米Ag和TiO2对金黄色葡萄球菌细胞膜未形成严重损伤或细胞膜崩解;进而检测了菌体内核酸DNA和RNA含量,结果显示纳米Ag组和TiO2组与对照组相比菌体内DNA和RNA含量显著减少(P < 0.01),表明纳米Ag和TiO2抑制了金黄色葡萄球菌菌体内核酸DNA和RNA的合成,从而抑制细菌蛋白合成,抑制细菌的生长。

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