脓毒症（sepsis）最新定义是宿主对感染的特异性反应导致的威胁生命的器官功能障碍^[1]。CD4⁺CD25⁺Treg主要由胸腺中T细胞发育而来，具有免疫无能性和免疫抑制性两大特性^[2]。前期实验及国外学者研究均证实，脓毒症免疫抑制状态与CD4⁺CD25⁺Treg密切相关^[3-4]。miR-10a特异性表达于CD4⁺CD25⁺Treg，而在CD4⁺T和CD8+T细胞等初始T细胞中不表达或低表达，被认为是CD4⁺CD25⁺Treg的特征分子^[5-7]。有研究发现，miR-10a对于CD4⁺CD25⁺Treg免疫功能具有重要影响^[7-8]。然而，迄今为止在脓毒症中miR-10a的表达规律及其与CD4⁺CD25⁺Treg免疫抑制功能的关系尚未阐明。本项目拟探讨miR-10a与脓毒症CD4⁺CD25⁺Treg免疫功能的关系，分析调控miR-10a对脓毒症免疫功能紊乱的影响和机理，拟为脓毒症的免疫调控治疗提供新的靶点和依据。

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分选盒子及MiniMACS磁性分离仪

（试剂编号: 5160711130，美天旎生物技术有限公司，格拉德巴赫，德国）；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记抗小鼠CD4（试剂编号: 4321795）、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记抗小鼠CD25（试剂编号: 4300566）、藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记抗小鼠Foxp3（试剂编号: 4292088）、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)标记抗小鼠Foxp3、藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记抗小鼠CD25（eBioscience, 圣地亚哥, CA）；抗CD3/CD28抗体（eBioscience, 圣地亚哥, CA）（试剂编号: B240221和B236704）；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)（试剂编号: 910⁸日本同仁，日本）；总RNA提取Trizol试剂盒（试剂编号: 910⁸，TaKaRa公司，大连，中国）；逆转录-试剂盒（试剂编号: RR037A，TaKaRa公司，大连，中国）；RealMasterMix(SYBRGreen)试剂盒（试剂编号: RR820A，TaKaRa公司，大连，中国）；携带miR-10a抑制序列的慢病毒（吉凯生物有限公司，上海，中国）。

雄性清洁级BALB/c小鼠，禁食24 h，自由饮水，1 d后腹腔注射1%戊巴比妥钠10 mg/kg麻醉后，固定小鼠在泡沫板上，75%酒精棉球消毒小鼠腹部手术区域。采用正中切口1.5~2 cm，眼科剪剪开，镊子钝性分离，剪开腹膜，找到盲肠并使其游离。于盲肠根部至盲肠远端的1/2~1/3处结扎盲肠，20号针头穿透结扎线远端盲肠的两侧肠壁，使肠内容物少量自穿刺孔溢出，将盲肠还纳回腹腔，用1-0丝线逐层单纯间断缝合缝合腹膜、筋膜和腹部肌肉关腹，术毕立即皮下注射37 ℃预热的1 mL生理盐水复苏；只开腹、牵引盲肠、复位、关腹、复苏，而里面盲肠既不结扎，也不穿孔的作为假手术组。手术完成后把小鼠仰放在盛有垫料的笼子内，添加食物与水，室内温度控制在（22±2）℃，湿度为40%~60%。每12 h昼夜交替一次，每6 h观测一次小鼠的状态。

脓毒症模型稳定性:本实验制作的小鼠CLP模型均符合国内外学者提出脓毒症动物模型的标准: (1)具有典型的实验室脓毒症表现如嗜睡、精神萎靡、反应迟钝、活动较少、眼角有分泌物、腹泻、竖毛等；(2)具有较高的脓毒症病死率满足72 h病死率在40%~60%的要求；(3)一般从造模后12 h出现死亡。本实验在严格控制实验条件下，使脓毒症小鼠达到较稳定的临床表现与病死率，以满足实验需要。

健康雄性清洁级BALB/c小鼠80只，体质量20~25 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号: SCXK(沪)2012-0002。小鼠饲养及动物实验在温州医科大学实验动物中心进行，使用许可证号: SYXK (浙)2010.0150。实验遵循国际通行的动物福利和伦理准则。48只BALB/c小鼠随机分为6组:正常组、假手术组（sham）、CLP1天组、CLP3天组、CLP5天组、CLP7天组，分离CD4⁺CD25⁺Treg细胞，检测其免疫功能和miR-10a表达情况。根据实验结果，用miR-10a抑制序列的慢病毒（上海吉凯公司完成）干预，实验分为假手术组，CLP3天组，慢病毒阴性对照组（control组），miR-10a下调组（miR-10a-down组），每组8只小鼠，miR-10a下调组是在造模前24 h尾静脉注射滴度为4×10⁷TU的300 μL慢病毒，对照组则相同时间点尾静脉注射300 μL阴性对照病毒，进一步检测小鼠免疫状态。

小鼠脾脏分出单个核细胞，制备细胞悬液，调整浓度为2×10⁷/mL。染色之前加0.5 μg~ 1 μg/100 μL CD16/32抗体，孵育20 min。等分细胞悬液，每管50 μL，再补加50 μL染色液。加入适量抗体CD4-FITC 0.25 μL、CD25^-APC 0.75 μL，四度避光孵育30 min。加2 mL流式染色液，洗涤，300 g离心弃上清液，重复一次。加1 mL 1×Foxp3固定和穿透工作液（Fixation/permeabilization），斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30~60 min。每管加2 mL通透缓冲液，300 g室温离心5 min, 弃上清液。加100 μL通透缓冲液重悬细胞后，加入FOXP3-PE 2.5μL，室温避光孵育20 ~30 min。然后用2 mL通透缓冲液洗一次，300 g室温离心5 min, 弃上清液。再加入2 mL流式染色液，300 g室温离心5 min, 弃上清液。300 μL流式染色液重悬，即可上机检测。

麻醉后断颈处死小鼠，无菌取脾脏，淋巴细胞分离单个核细胞，根据细胞计数结果向细胞悬液中加入10 μL生物素鸡尾酒标记抗体（Biotin-antibody Cocktail）/10⁷细胞，4 ℃，孵育10 min。每10⁷个细胞加30 μL PBS和20 μL的Anti-Biotin Microbeads以及10 μL CD25^-PE antibody，混匀细胞，4℃，孵育15 min。应用1~2 mL PBS/10⁷细胞清洗细胞后1000 r/min离心10 min，去上清液后500 μL PBS/10⁸细胞重悬，进行磁珠分选，阴选出未被标记的细胞就是CD4⁺T细胞。加入Anti-PE Microbeads 4℃避光孵育15 min，洗完后用PBS重悬后进行磁珠分选，阳选出标记的CD4⁺CD25⁺T细胞，未标记的为CD4⁺CD25^-T细胞。流式细胞术鉴定CD4⁺CD25⁺Treg和CD4⁺T细胞纯度。

磁珠分选仪分出CD4⁺CD25⁺T细胞和CD4⁺CD25^-T细胞，向平底96孔细胞培养板孔内加入含10%胎牛血清，相应孔中加入细胞悬液（10⁶/mL），抗CD3和抗CD28包被（用于CD4⁺CD25⁺Treg细胞活化），37℃、5%CO²孵育48 h后收集上清液，-30℃保存，CD4⁺CD25⁺Treg细胞匀浆用于miR-10a的检测。

采用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至5×10⁶/mL，取0.1 mL接种于96孔培养板，另加抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激。每组设5个复孔。37℃、5%CO²孵育68 h，处理结束后加入CCK-8(每孔100 μL加10 μL CCK-8)，轻摇，37 ℃孵育4 h，然后用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度。取5孔吸光度值的平均值，按公式计算各组细胞存活率，实验重复3次。

用超纯RNA提取试剂（TaKaRa Code D9108B）提取细胞样本中总RNA。取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。然后用反转录试剂盒中的gDNA Eraser (TaKaRa code DRRO47A)对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理，离心，使管壁上的溶液收集到管底，42℃ 2 min, 4℃保存。用反转录试剂盒进行反转录，37℃孵育15 min（反转录反应），85℃ 5 s（反转录酶失活），4℃保存。用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa code DRR420A)进行扩增，扩增程序为: 95℃30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40个循环。将各样品cDNA 10倍稀释后取2 μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60~95 ℃进行溶解曲线分析。扩增的引物序列如下: miR-10a forward: 5′-TCGCTTACCCTGTAG-3′; reverse: 5′-GTGCAGGGT CC GA GGTAT-3′, and GAPDH for-ward: 5′-AAGAGGGATGCTGCCCTTAC-3′; reverse: 5′-AAGAGGGATGCTGCCCTTAC-3′。采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

数据若服从正态分布，则以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，两独立样本间比较如服从正态分布采用独立样本t检验，各时间点多组均数比较若服从正态分布则分别采用单因素方差分析(ANOVA)，模型组各时间点与假手术组相比若服从正态分布采用Dunnett-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

Balb/c小鼠造模后到1、3、5、7 d麻醉后活杀小鼠，提取脾脏单个核细胞，孵育24 h后，用调节性T细胞染色盒子进行染色，上流式机检测CD4⁺CD25⁺Treg细胞在CD4⁺T细胞中的比例及Foxp3的表达(图 1)。正常组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg在CD4⁺T细胞中的比例为（7.34±1.2）%，与假手术组相比较差异无统计学意义（t=0.189，P=0.854）。采用单因素方差分析，小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg比例在造模后1、3、5、7组比较差异具有统计学意义（F=17.75，P < 0.01），其中第3天达峰值，之后缓慢降低（图 2）。Dunnett-t检验发现模型组各时间点与假手术组相比，小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg比例明显升高（P < 0.05）。

R1:淋巴细胞；R2: CD4+T细胞；R3: CD4+CD25+T细胞；R4: CD4+CD25+Foxp3+T细胞 图 1 细胞分群 Figure 1 Cell division

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与正常组比较，aP > 0.05，与假手术组比较，bP < 0.05 图 2 脓毒症小鼠脾脏CD4+CD25+T/CD4+T细胞的比例 Figure 2 The percentages of splenic Tregs(CD4+CD25+/CD4+T) in septic mice

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为进一步观察Foxp3水平的变化，通过flowjo软件分析发现，与正常组和假手术组相比，脓毒症小鼠Foxp3直方图向右偏移，Dunnett-t检验发现模型组各时间点Foxp3的平均荧光强度（MFI）也高于假手术组（P < 0.05）（图 3）。以上结果说明脓毒症小鼠体内调节性T细胞比例升高，Foxp3表达升高，且在脓毒症3 d时最明显。

与正常组比较，aP > 0.05；与假手术组比较，bP < 0.05 图 3 脓毒症小鼠脾脏Treg中Foxp3的表达 Figure 3 The expression of Foxp3 on splenic Treg in septic mice

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小鼠脾脏单个核细胞经MiniMACS磁性分离仪两次分选后，如下图，CD4⁺T细胞的平均纯度达到90%以上；CD4⁺CD25⁺Treg细胞的纯度平均达到90%以上。所获得的CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25⁺Treg细胞经过台盼蓝检测活性均大于98%。如图 4所示。

图 4 磁珠分选调节性T细胞 Figure 4 Isolation of CD4+CD25+ Tregs and CD4+CD25-T cells

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与正常组比较，aP > 0.05，与假手术组比较，bP < 0.05 图 5 脓毒症小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞miR-10a的表达 Figure 5 The expression of miR-10a on splenic CD4+CD25+Treg in septic mice

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制作CLP脓毒症小鼠模型，在不同时间点取脾脏组织，分选出CD4⁺CD25⁺Treg细胞，real-time PCR检测miR-10a的表达，结果显示，与正常组相比，假手术组小鼠体内miR-10a的表达差异无统计学意义（t=1.866，P=0.135）。采用单因素方差分析，miR-10a在造模后1、3、5、7组之间比较差异具有统计学意义（F=16.27，P < 0.01）。Dunnett-t检验发现，与假手术组相比，脓毒症小鼠1、3、5、7 d miR-10a表达明显升高，且在3 d时升高明显（P < 0.05），差异具有统计学意义。

脓毒症小鼠尾静脉注射携带miR-10a抑制序列的慢病毒，造模后第3天，荧光显微镜下观察小鼠淋巴细胞绿色荧光GFP的表达情况。见图 6，绿色荧光视野下，淋巴细胞染色达到60%以上。慢病毒介导后，观察各组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg/CD4⁺T比例及Foxp3的表达。结果发现，与假手术组相比，脓毒症模型组CD4⁺CD25⁺T/CD4⁺T比例明显升高（t=14.57，F < 0.01）。与对照组相比，脓毒症小鼠尾静脉注射慢病毒后，CD4⁺CD25⁺T/CD4⁺T比例明显升高（t=3.973，F=0.007）（图 7），且Foxp3的平均荧光强度也明显增强（t= 9.85，F < 0.01）（图 8）。

图 6 慢病毒介导下调miR-10a Figure 6 Lentiviral vector-mediated knockdown of miR-10a

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与假手术组比较，aP < 0.05，与对照组比较，bP < 0.05 图 7 脓毒症小鼠下调miR-10a后小鼠脾脏CD4+CD25+T/CD4+T细胞的比例 Figure 7 The percentages of splenic Tregs(CD4+CD25+T/CD4+T) in septic mice after down-regulation of miR-10a

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与假手术组比较，aP < 0.05，与对照组比较，bP < 0.05 图 8 脓毒症小鼠下调miR-10a后小鼠脾脏CD4+CD25+Treg中Foxp3的表达 Figure 8 The expression of Foxp3 on splenic CD4+CD25+Treg in septic mice after down-regulation of miR-10a

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与假手术组相比，脓毒症3 d小鼠CD4⁺T细胞增殖能力下降（t=11.19，P < 0.01）。与脓毒症3 d组相比，慢病毒对照组增值能力无明显变化（t= 1.269，P=0.251）。与对照组相比，下调miR-10a后小鼠体内CD4⁺T细胞增殖能力显著下降（t=4.877，P=0.002）（图 9）。

与假手术组比较，aP < 0.05，与对照组比较，bP < 0.05 图 9 下调miR-10a对脓毒症小鼠CD4+T细胞增殖的影响 Figure 9 Effects of down-regulation of miR-10a on CD4+T cell proliferative activity in septic mice

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脓毒症是ICU常见死亡病因，近年来随着脓毒症致病机制的深入研究发现免疫功能紊乱在脓毒症致病过程中发挥着重要作用，并与脓毒症预后密切相关。很多动物实验研究和临床研究显示脓毒症经历了一个长期的免疫抑制过程^[8-10]。尽管调节性T细胞在免疫系统中占据很小的一部分，但是它们在细胞活化中有着很强的调节功能，并在脓毒症免疫功能紊乱中起着重要的作用。早期的动物实验和临床人类研究中发现脓毒症动物模型和脓毒症患者血液和脾脏的CD4⁺CD25⁺Treg比例上升^[11-13]。Venet等^[14]发现脓毒症患者中CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例升高的原因不是CD4⁺CD25⁺Treg细胞增殖致数量增加，而是脓毒症患者血液中CD4⁺CD25^-T细胞数量减少。研究也发现脓毒症小鼠存在CD4⁺T细胞凋亡增加^[15-16]。此次研究发现脓毒症3 d时免疫抑制功能最强，CD4⁺T细胞增殖能力显著减弱。Foxp3（forkhead/winged helix transcription factor p3）是叉状头转录因子家族中的一个成员，被认为是调节性T细胞（Treg）的最重要的标志性分子。Foxp3对调节性T细胞的抑制功能起着中要的作用。本研究发现脓毒症小鼠Foxp3基因表达和蛋白表达都升高，提示脓毒症中CD4⁺CD25⁺Treg免疫抑制功能显著增强，但其机理尚不明确。

microRNA是一列短的单链RNA分子，它可以在炎症反应中通过转录后微调一些基因的表达来维持免疫内环境稳定^[17-18]。Jeker等^[6]体外培养CD4⁺CD25⁺Treg发现，进一步证实miR-10a的表达能够促进Foxp3的稳定和高水平的表达，而抑制miR-10a可以导致Foxp3减少，提示miR-10a对于CD4⁺CD25⁺Treg功能状态具有潜在的正向调控作用。然而Takahashi等^[19]研究表明，TGF-β和RA共同诱导了miR-10a在Treg细胞中的表达，而后miR-10a通过抑制其靶基因Bcl-6和Ncor2(核受体辅助抑制因子2抗体)来抑制CD4⁺CD25⁺Treg细胞向Th细胞的转化，从而维持CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量的稳定性^[20]。由于Bcl-6对滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cell, TFH）细胞分化具有重要作用^[21-22]，miR-10a可以抑制Bcl-6的表达，从而限制诱导型Treg向TFH转化，间接影响CD4⁺CD25⁺Treg的数量。另据报道，在Th1为主的炎症反应中，下调miR-10a对维持Treg免疫功能其重要作用，并能抑制IFN-γ的分泌^[23]。该研究发现在Th1介导的炎症反应中，下调miR-10a对Treg抑制Th1细胞和天然T细胞至关重要。本研究也发现，脓毒症小鼠Treg中miR-10a升高。抑制miR-10a表达后，脓毒症小鼠体内CD4⁺CD25⁺Treg免疫抑制功能增强。上述结果表明，miR-10a与CD4⁺CD25⁺Treg具有重要的联系。miR-10a在体外可以通过多种机制维持Treg生产与稳定，又可以在体内通过调节炎症反应抑制CD4⁺CD25⁺Treg的表达。本次研究应用吉凯公司设计的慢病毒oligo序列插入抑制miR-10a的5p端，从而将小鼠体内的miR-10a的功能都抑制，并没有特异的抑制小鼠淋巴细胞上miR-10a，是本实验的一个缺陷。