中华急诊医学杂志  2018, Vol. 27 Issue (2): 117-119
脓毒症线粒体功能障碍及其干预对策
张卉, 李春盛, 姚咏明     
100048 北京,解放军总医院第一附属医院创伤研究中心(张卉、姚咏明);100020 北京,首都医科大学附属北京朝阳医院急诊科(李春盛)

脓毒症新定义强调机体对感染反应失调所致威胁生命的器官功能障碍。严重者经充分的液体复苏后仍需使用升压药物治疗,或者发生低血压(MAP≤65 mmHg)和(或)高乳酸血症(乳酸值> 2 mmol),即为脓毒性休克[1]。高乳酸血症意味着机体出现代谢障碍,糖类等营养物质无法得到充分利用。线粒体作为细胞的产能中心,发挥着营养物质代谢的关键作用。脓毒症状态下,线粒体损伤和功能障碍是细胞代谢异常、能量产生不足以及诱发氧化应激的根本原因[2]。进而促使靶器官细胞和免疫细胞发生凋亡和功能障碍,最终导致机体免疫抑制、器官衰竭乃至死亡[3]。因此,保护线粒体稳态是维持细胞正常功能的关键所在,对延缓或逆转病情进展具有重要意义。

1 线粒体结构与功能

线粒体是广泛存在于真核细胞中的双层膜结构细胞器,主要功能是提供细胞活动所需的能量,即ATP。糖类和脂类在胞浆中代谢产生的丙酮酸及游离脂肪酸进入线粒体中参与三羧酸循环,产生的电子通过呼吸链(electron transport chain,ETC)传递生成ATP,此过程称为氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)。ETC由四种复合物(Ⅰ~Ⅳ)、辅酶Q和细胞色素C按一定顺序排列在内膜上构成。在氧气的参与下,电子通过ETC最终由F1F0-ATP合酶催化产生ATP,为细胞供能。OXPHOS所产生的适量活性氧(ROS)也参与调控细胞内多条信号通路。此外,线粒体还是细胞内贮存钙离子的场所,具有调节细胞内钙平衡的作用。

线粒体结构损伤可以诱发凋亡和钙失衡;功能障碍影响OXPHOS及能量生成,并产生多余的ROS造成氧化应激,这些都是造成细胞和器官功能损害的重要因素[4]

2 脓毒症时线粒体变化及临床意义 2.1 形态与数量变化

脓毒症时线粒体形态会发生明显变化,电镜下观察到靶器官细胞中线粒体体积增大、内嵴消失、基质中出现空泡,甚至破裂。线粒体肿胀的原因主要有:(1)氧化应激对线粒体内膜的直接损伤[5];(2)线粒体内钙超载。这些因素造成孔蛋白通透性增加,呈持续性开放状态,使膜内外渗透压发生改变[6]

为了清除受损线粒体,细胞自噬也被激活,靶向清除线粒体的自噬称之为线粒体自噬[7]。临床观察显示,脓毒症发生后细胞中自噬体明显增多。在动物实验中,阻断自噬进程则增加细胞的凋亡和器官损害[8]。线粒体自噬通过清除损伤线粒体,减少ROS产生以减轻氧化应激,对细胞具有保护效应。

线粒体损伤被清除的同时伴有线粒体再生,胞浆中出现形态各异的线粒体,这些就是新生未完全成熟的线粒体。在脓毒症、多器官衰竭患者的骨骼肌中发现线粒体的含量成倍增多。线粒体再生受转录因子——过氧化物增殖体活化受体γ共激活因子(PGC)1-α调控,存活患者骨骼肌中PGC1-α水平和ATP含量明显高于死亡者。说明线粒体再生在维持细胞和器官能量供给中具有重要作用,直接影响患者预后[9]

2.2 呼吸链功能改变

脓毒症状态下线粒体功能也发生了显著变化,主要是ETC的功能障碍。脓毒症患者体内线粒体ETC复合物表达减弱,同时ATP产生显著下降,在病程较长和死亡者中尤其明显。在脓毒症动物模型中,心肌细胞耗氧量和ETC复合物活性明显降低[10]。外源性给予复合物Ⅳ辅酶——细胞色素C有助于改善心脏功能,通过注射咖啡因改善复合物活性后,可维持心肌收缩功能,提高动物生存率[11-12]

业已明确,ETC复合物活性下降主要与线粒体内ROS积聚密切相关。脓毒症时线粒体内ROS和活性氮,如一氧化氮(NO)水平明显升高。ETC复合物Ⅰ和Ⅳ对这些物质异常敏感。采用脓毒症患者血清处理内皮细胞后,复合物活性明显降低,而清除NO则可以维持正常的ETC功能[13]

ETC功能障碍导致ATP产生不足,同时产生大量的ROS,这不仅抑制线粒体ETC自身的功能,释放到胞浆中甚至胞外所形成的氧化应激反应也是诱导细胞器官损伤的重要原因。

2.3 氧化应激反应

正常生理条件下,由ETC反应所产生的副产物超氧化物(O2-)经过超氧化物歧化酶(MnSOD)作用转化为过氧化氢(H2O2),再经由过氧化物酶作用生成水。过量未能转化的超氧化物、过氧化氢、NO等在细胞内聚积即引起氧化应激反应。据报道,脓毒症小鼠脏器线粒体中MnSOD活性受抑,随之伴有线粒体内过氧化物的聚积;使用抗氧化剂对脓毒症动物的肝肾等多器官具有保护作用[14]

以上是线粒体的典型变化,这些形态和功能上的改变由脓毒症造成,同时也是进一步加剧病情恶化的诱因。因此,早期评价和干预线粒体功能障碍将成为脓毒症潜在的防治策略。

3 线粒体功能监测及其应用价值

目前已报道应用于临床试验的线粒体功能监测方法有:(1)分光光度法检测血小板ETC酶活性。脓毒症患者的血小板中NADH、ETC复合物Ⅰ~Ⅳ活性较对照组明显降低,但是由于脓毒症患者体内存在有血小板减少的现象,进行标准化分析后这些指标与病情预后并没有显著相关性[15]。(2)高分辨率呼吸仪测定血小板或外周血细胞的呼吸效率。脓毒症患者血小板的呼吸效率随病程进展逐渐下降,在死亡组中改变更加明显,但与SOFA评分等没有显著相关性[16]。外周血采集方便快捷,以上两种方法均可在临床开展,且后者保持完整血小板形态,能够在患者血浆中进行检测,更接近于患者体内微环境。但是上述两种方法用于评价病情和预后,尚缺乏大量临床数据支持。

除此以外,在体监测技术在动物实验中已经得到良好应用,包括:(1)NADH荧光测定法。NADH和NAD-的自发荧光波长不同(450 nm和340 nm),通过吸光度测定判断NADH/NAD-比例,可以间接反映ETC活性;(2)磁共振波谱分析。用32P标记ATP等测定线粒体的产能效率;(3)红外线分析。环氧合酶Cu A被氧化后,在830 nm波长处显示出吸收峰,以判断细胞氧利用情况,评价线粒体ETC的功能。在体监测技术虽然方便快捷,但是应用于临床尚需要开发适当的设备以保障其安全性和可靠性。

4 以线粒体为靶点的脓毒症治疗策略 4.1 稳定线粒体膜

线粒体外膜上的电压力依赖性阴离子通道(VDACs)和内膜上的线粒体KATP通道等,都是线粒体损伤后形成开放性孔道的途径。外膜通透性增高主要由于线粒体外凋亡信号引起的Bax增多转位使VDACs形成孔道,造成细胞色素C等外泄。维持外膜的完整性可通过干预线粒体的前凋亡信号实现。近年来研究发现,线粒体KATP通道能被5-羟基癸酸盐(5-HD)阻滞,在发生内膜损伤的情况下可有效防止线通透性增加、ATP外流,以及随之而来的线粒体损伤。动物实验证实,脓毒症小鼠心肌细胞线粒体破裂,胞浆中细胞色素C含量增加,5-HD不仅有效改善线粒体的膜稳定性,而且大辐降低了病死率[17]。但5-HD并非特异性线粒体KATP通道阻滞剂,是否对其他离子通道或细胞通路有影响尚待进一步考证。

4.2 改善ETC功能

ETC功能障碍是线粒体产能减少、产生大量ROS的根本原因。补充外源性ATP弥补产能不足效果不佳,因为氧化应激才是加重线粒体乃至整个细胞器官损伤的重要原因。早期已应用外源性补充酶类改善ETC代谢功能,如辅酶Q10。然而此类药物聚集到线粒体内的浓度很低,难以发挥理想作用。新近研发的线粒体靶向结构TPP(triphenylphosphonium),在与相关药物标定后可将其靶向聚集至线粒体内,使其浓度提高上百倍。此类药物包括Mito-Q(线粒体靶向辅酶Q10)、Mito-E(维生素E)等。首先相较于传统药物,线粒体内的药物浓度大辐提高;其次它可以发挥正常的酶活性[18]

动物实验显示,Mito-Q明显改善脓毒症所致ETC功能障碍,四种复合物活性均大辐提高,说明靶向补充活性酶可以维持正常的电子传递和产能过程,减少氧自由基的产生,从而阻断线粒体功能障碍—细胞损伤的恶性循环[19]。迄今为止应用Mito-Q完成的Ⅱ期临床试验有两项,一项针对阿尔默海滋症患者,研究中连续口服给药一年后,病情进展和安慰剂组差异无统计学意义[20];另一项研究针对丙型肝炎病毒感染患者,连续给药28 d后患者血浆丙氨酸转氨酶含量有所下降[21]。虽然有限的临床资料未能得到满意的结果,但其安全性已得到证实,并且在脓毒症动物模型中具有确切的靶器官保护效应,期待进一步开展临床治疗试验验证。

4.3 促进线粒体再生

当线粒体出现不可逆损伤,被自噬过程清除的同时也会激活线粒体再生。腺苷酸依赖蛋白激酶(AMPK)/PGC1-α/核呼吸因子(NRF)-1/2信号通路在调控线粒体再生中起关键作用,通过感受ATP/ADP的失衡刺激线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)的表达。TFAM进入线粒体基质内进一步调控线粒体(mtDNA)表达,促进线粒体再生。在脓毒动物模型和重症患者体内均观察到PGC1-α表达上调,并且与良好预后具有一定相关性。但由于AMPK/PGC1-α信号通路作用广泛,以其为靶点的治疗会影响其他重要的细胞生物学效应。由此可见,特异性针对TFAM的靶向治疗更加合理。目前,重组人源性线粒体转录因子A(rhTFAM)对线粒体再生的促进作用在动物实验中已经得到证实,它能够明显增加mtDNA表达,在不同的靶器官损伤模型中都可以改善线粒体功能,并且有效通过血脑屏障,对心、脑、肺等起到保护作用,降低内毒素血症动物病死率[22]

5 问题与展望

线粒体功能障碍在脓毒症、脓毒性休克状态下是导致器官功能障碍甚至死亡的重要因素。选择恰当靶点干预并改善线粒体功能,可能成为未来逆转脓毒症进程、救治患者的有效手段。

在干预靶点的选择上应注重特异性和有效性,以达到有的放矢,因此作用效果广泛的靶点并没有在此详述,例如凋亡、自噬过程的调控、激素治疗等。目前有望应用于临床的药物主要是TPP标定的线粒体靶向酶类药物,此结构已经由新西兰某公司申请获得专利,其中实现商业化生产的Mito-Q已应用于抗氧化抗衰老人群。然而用于临床治疗,尤其是脓毒症的治疗,其有效剂量、给药途径、确切疗效等关键问题仍需大样本临床试验验证。从理论上讲,rhTFAM促进线粒体再生对保护器官能量代谢和功能具有积极意义,但过度的再生是否会造成非成熟线粒体积聚,对细胞内环境带来其他影响,如氧化应激、自噬的过度活化等均有待澄清。动物实验结果显示,rhTFAM的保护作用呈剂量依赖性,那么在临床应用中就应该更加注意剂量的把控,目前还缺乏足够的临床研究数据指导治疗。

线粒体内OXPHOS系统需要若干分子和酶类的参与,选择有效的特异性强的药物联合治疗,从多方面改善线粒体功能是否可以达到更好的效果,仍需要进一步探讨。此外,在保护线粒体功能的同时,营养支持也必不可少。给予脓毒症患者充足营养,并改善机体营养代谢功能,以产生足够的能量供给并减少有害氧自由基的产生,对维持机体内环境和免疫功能具有重要价值。

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