蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是急诊科常见急症,病死率高,幸存者也常伴有严重的并发症。目前仍缺乏有效的治疗措施能终止蛛网膜下腔出血的病理生理学过程,主要原因是SAH的病理生理过程仍未探究清楚。过去一直认为脑血管痉挛是导致SAH患者高病死率和高致残率的主要原因,但是,临床上以脑血管痉挛为靶点的治疗效果并不理想。现在越来越多的观点认为SAH开始至72 h这段时间窗内的脑损伤,即早期脑损伤(early brain injury,EBI),是决定SAH预后的关键。导致早期脑损伤的机制极其复杂,其中神经炎症在EBI的病理生理过程中起重要作用。
雷公藤甲素(triptolide,TP)是一种具有多种生物活性的二萜内酯,最早从雷公藤的根中分离获得,相对分子质量小,亲脂性较好,易于透过血脑屏障,具有一定的抗炎及免疫抑制作用。研究证实,雷公藤甲素能抑制炎症反应,减少促炎性因子的释放,对包括脑外伤、帕金森病、阿尔茨海默病、脑缺血及缺血-再灌注在内的多种中枢神经系统疾病起保护作用,雷公藤甲素还可以缓解神经性病理痛,抑制恶性胶质瘤的增殖和侵袭能力。然而,雷公藤甲素对SAH的作用至今仍不明确。本研究利用穿刺法制作大鼠SAH模型,观察雷公藤甲素对大鼠SAH后小胶质细胞活化、细胞凋亡及促炎因子的影响,探讨雷公藤甲素用于治疗SAH的可行性及其机制,为新的治疗药物的研发提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组雄性SD大鼠从西安交通大学医学部动物实验中心购买,合格证号:SCXK(陕)08-018;大鼠遗传背景相同,约2月龄,体质量250~300 g;该实验伦理经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准。购买大鼠后,将其饲养于西安交通大学医学部动物实验中心(22±2)℃、12 h照明/12 h黑暗的环境中,食水自由,7 d后开始实验,实验前24 h禁食。按照随机数字法对大鼠进行编号、分组(1~48),将大鼠分为对照组、SAH 3 d组、SAH 3 d+DMSO组,SAH 3 d+TP组,每组12只,其中6只用于提取蛋白,6只用于免疫染色,共48只。
1.2 主要试剂和仪器雷公藤甲素购自德国Merck公司,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司,细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司,SP染色试剂盒购自北京中杉金桥公司,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自美国R & D System公司,Iba-1抗体购自日本Wako公司,BI-2000图像分析系统购自中国泰盟科技公司。
1.3 SAH模型的建立及给药利用改良后的颈内动脉穿刺法制作大鼠SAH模型,大鼠经100 g/L水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g),沿颈中线切开皮肤,分离皮下组织,暴露左侧颈总动脉及其分叉,暴露颈内动脉和颈外动脉,于颈外动脉远心端结扎并剪断,拉直颈外动脉残端,使其与颈内动脉成一直线。将3-0单丝锐化尼龙线经颈外动脉导入,用缝线轻扎尼龙线,并拉紧颈外动脉残端,减少出血,从颈总动脉分叉部开始,刺入18~20 mm,有阻力感后再插入2 mm左右刺破willis环,造成蛛网膜下腔出血,停留尼龙线15 s后,迅速将尼龙线拔出,再阻断颈总动脉2 min,限制蛛网膜下腔的出血量,整个过程不超过5 min[1]。对照组只把尼龙线导入血管,不刺破。造模后立即给药,将雷公藤甲素溶于二甲基亚砜,经腹腔注射给药,剂量为0.2 mg/kg,间隔12 h,连续给药3 d。SAH 3 d+DMSO组给予相同剂量的DMSO。
1.4 实验方法 1.4.1 HE染色大鼠先后经生理盐水、质量分数4%的多聚甲醛灌注后取脑,取出的脑组织于多聚甲醛中继续固定48 h,石蜡包埋、切片。切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化。然后用苏木精溶液染色10 min,水洗后用盐酸乙醇分化,切片经自来水浸泡后再置入伊红液染1 min,然后常规脱水,透明,封片。
1.4.2 免疫组织化学取切片,烘烤后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化,用微波辐射法修复抗原,采用SP染色法检测小胶质细胞标志物Iba-1的表达,抗原修复后用山羊血清封闭30 min,4 ℃过夜孵育一抗(1:300),滴加二抗,37 ℃孵育20 min,加试剂SABC,37 ℃孵育20 min,DAB显色试剂盒显色,镜下掌握显色程度,苏木精复染1 min,常规脱水、透明、封片。每个组织重复3次,BI-2000图像分析系统在每张切片上随机取6个视野采集图像。利用Image-Pro Plus 6.0软件对阳性细胞数进行统计。
1.4.3 TUNEL法切片常规脱蜡、水化,严格按照TUNEL试剂盒提供的实验步骤操作,4%多聚甲醛固定,室温下20 μg/mL蛋白酶K处理组织15 min,平衡液孵育10 min,TUNEL反应混合液37 ℃反应1 h,终止反应后加链霉亲和素标记HRP,DAB显色,苏木精复染,梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。BI-2000图像分析系统在每张切片上随机取6个视野采集图像。利用Image-Pro Plus 6.0软件对阳性细胞数进行统计。
1.4.4 ELISA大鼠经生理盐水灌注后,分离皮层并匀浆,离心后提取上清液,采用ELISA法检测IL-6,IL-1β及TNF-α浓度,操作按试剂盒说明进行,计算上述指标在单位质量皮层组织中的含量(pg/mg)。
1.5 统计学方法用SPSS 18.0分析数据,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 大鼠SAH标本观察对照组脑组织表面洁净,发白,无血块;由于血液进入蛛网膜下腔,SAH 3 d组的脑组织呈红色,表面有明显血凝块存在,提示SAH模型成功,见图 1。
2.2 大鼠皮层HE染色对照组大鼠脑组织皮层内结构清晰,细胞核形态正常,核仁清晰可见。SAH 3 d组可见部分神经细胞丢失、皱缩,细胞核固缩、深染,细胞外间隙增大、组织结构疏松;SAH 3 d+DMSO组皮层内的病理改变与SAH 3 d组相似,SAH 3 d+TP组组织结构疏松减轻,形态异常的神经细胞的数量减少,见图 2。
2.3 大鼠皮层Iba-1免疫组化染色对照组大鼠皮层内的Iba-1阳性的细胞数量极少,为(2.20±0.96) 个/视野;与对照组比较,SAH 3 d组(20.25±4.57) 个/视野、SAH 3 d+DMSO组(19.50±4.93) 个/视野,SAH 3 d+TP组(10.00±4.54) 个/视野的Iba-1阳性的细胞数量均增加(t=-7.70,P=0.003;t=-6.87,P=0.005;t=-3.34,P=0.039);与SAH 3 d组比较,SAH 3 d+DMSO组的Iba-1阳性的细胞数量无明显变化(t= 0.22,P=0.831),而SAH 3 d+TP组的Iba-1阳性的细胞数量有明显减少(t= 3.18,P=0.019)。Iba-1阳性细胞数在各组间差异有统计学意义(F=17.51,P<0.01)(图 3)。
2.4 大鼠皮层TUNEL法检测凋亡细胞数对照组皮层内的几乎没有凋亡细胞(1.50±1.29) 个/视野;与对照组比较,SAH 3 d组(39.75±4.11) 个/视野、SAH 3 d+DMSO组(41.75±6.08) 个/视野,SAH 3 d+TP组(18.00±3.92) 个/视野的凋亡细胞数量均增加(t=-17.75,P<0.01;t=-12.96,P=0.001;t=-8.00,P=0.002);与SAH 3 d组比较,SAH 3 d+DMSO组的凋亡细胞数量无明显变化(t=-0.55,P=0.605),而SAH 3 d+TP组的凋亡细胞数量有明显减少(t= 7.66,P<0.01)。TUNEL阳性细胞数在各组间的表达差异有统计学意义(F=82.76,P<0.01)(图 4)。
2.5 大鼠皮层炎性因子的表达对照组、SAH 3 d组、SAH 3 d+DMSO组及SAH 3 d+TP组TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量见表 1。三种炎性因子在各组间的表达差异有统计学意义(F=18.30,P<0.01;F=9.036,P<0.01;F=14.62,P<0.01)。与对照组比较,SAH 3 d组、SAH 3 d+DMSO组、SAH 3 d+TP组的三种炎性因子的水平均升高(均P<0.05);与SAH 3 d组比较,SAH 3 d+DMSO组三种炎性因子的水平无明显变化(均P> 0.05),而SAH 3 d+TP组三种炎性因子的水平均有明显降低(均P<0.05)。
组别 | TNF-α | IL-1β | IL-6 |
对照组 | 13.25±10.14 | 15.50±14.06 | 11.75±9.98 |
SAH 3 d组 | 75.50±12.48a | 247.00±32.49a | 59.25±10.14a |
SAH 3 d+DMSO组 | 84.25±13.12ab | 284.00±31.44ab | 73.25±24.17ab |
SAH 3 d+TP组 | 43.75±22.02ac | 96.75±24.10ac | 35.00±4.24ac |
注:与对照组比较,aP<0.05;与SAH 3 d组比较,bP>0.05,cP<0.05 |
炎症反应与多种中枢神经系统疾病的病理生理过程息息相关,动物及临床试验证实,炎症反应在SAH的病理生理过程中也起重要作用,可造成继发性脑损伤及脑血管痉挛,进而导致脑缺血缺氧,加重损伤。进一步的实验证实,SAH后炎性反应与脑水肿、细胞死亡均直接相关。SAH后在脑脊液、脑实质、血管中均有炎性因子存在,且其表达升高,降低炎性因子水平起到一定的脑保护作用[2]。例如TNF-α可直接造成神经元损伤,而阻断TNF-α的表达可以减少SAH后细胞凋亡[3]。此外,SAH后炎症反应也存在于脑外系统,给予抗炎治疗可以减轻SAH患者的肺损伤[4]。因此,抗炎治疗可能是改善SAH预后的方法之一。
雷公藤甲素是从雷公藤的根中分离得到的一种具有多种生物活性的二萜内酯,具有抗炎及免疫抑制作用。雷公藤甲素可以通过阻断小胶质细胞的激活,逆转内毒素产生的神经毒性,促进α-突触核蛋白的清除,增加星型胶质细胞内NGF的合成,改善帕金森病[5-9]。雷公藤甲素也能呈剂量依赖性地增加突触素水平,抑制淀粉样前体蛋白裂解酶的表达,减少Aβ的生成及沉积,促进Aβ的代谢,减轻树突棘的退行性变,缓解阿尔茨海默病的进展[10-12]。此外,雷公藤甲素还能通过减少IL-6,IL-1β及TNF-α等炎性因子的释放,减轻脑缺血、缺血-再灌注、脑外伤造成的神经损伤;并通过抑制T细胞的活化及增殖,改善神经性病理痛[13-15];雷公藤甲素还可以促进胶质母细胞瘤的凋亡,并抑制细胞的增殖和侵袭能力[16-17]。因此,雷公藤甲素对多种神经系统疾病起保护作用。
本研究证实,给予SAH大鼠连续腹腔注射雷公藤甲素可以改善大脑皮层的病理改变,减轻细胞水肿,减少TUNEL阳性的凋亡细胞数及小胶质细胞的激活,而雷公藤甲素的这种保护作用可能与IL-6,IL-1β及TNF-α三种炎性因子的下降有关。雷公藤甲素对SAH的保护作用也可能与其他机制有关。SAH后,脑组织存在一定程度的缺血,雷公藤甲素可以减少脑缺血后炎性因子的表达,降低神经功能缺损、脑梗死范围和脑含水量,并减少细胞凋亡,增加细胞自噬,对脑缺血起保护作用[18-20]。雷公藤甲素不但能增加星型胶质细胞内神经生长因子蛋白和mRNA水平,还能通过抑制NF-κB途径,降低星型胶质细胞内环氧酶-2、前列腺素E2的表达,并抑制小胶质细胞激活后释放的NO[21-23]。雷公藤甲素可以增加血液中皮质酮及ACTH的浓度,并增加垂体中ACTH阳性细胞的数量,具有类似于皮质激素的功能,其能通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴促进肾上腺皮质的功能[24],雷公藤甲素的此作用可能也能保护脑组织。
综上所述,雷公藤甲素可以改善SAH大鼠皮层的病理改变,减少凋亡细胞数,抑制小胶质细胞的激活,并降低炎性因子水平,雷公藤甲素对SAH后的早期脑损伤也有一定的保护作用。随着SAH时间的延长,血管痉挛也是SAH的主要并发症之一,雷公藤甲素是否可以减少血管痉挛的发生仍需进一步实验证实。
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