2017, Vol. 26
肺缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是围手术期常见并发症之一，是临床常见的病理过程，多见于肺溶栓治疗、肺移植、心肺联合移植等手术治疗。肺缺血-再灌注损伤常引发急性肺损伤，同时也伴随远隔器官的功能障碍和病理性损伤，如脑、心脏、肝及肾脏等。脑耗氧量大，对缺血缺氧及促炎因子较为敏感，容易发生急性脑损伤(acute brain injury, ABI)，严重者可产生不可逆的脑细胞损伤。肺I/R合并脑损伤是危及患者生命的严重并发症，可明显增加病死率。研究表明，肺I/R合并急性脑水肿死亡的发生机率高于因呼吸衰竭、肝功能衰竭等引起的死亡[1]。肺缺血-再灌注引起的缺血、缺氧可诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，适度的ERS可恢复细胞内环境稳态和维持细胞存活，但过度的ERS则会导致细胞凋亡，加重组织损伤。右美托咪定是高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，笔者前期的研究结果表明，肺缺血前给予右美托咪定可降低促炎介质和炎性因子，从而减轻肺的损伤，具有肺脏保护作用[2]。同时有研究证明右美托咪定对脑神经损伤能起到一定的保护作用，除此之外，对心脏、肾脏、肝脏、肠等缺血-再灌注损伤也具有一定的保护作用[3-6]。但右美托咪定对肺缺血-再灌注致远隔脑损伤的影响仍有待探讨。本实验旨在研究右美托咪定能否通过抑制过度内质网应激来减轻小鼠肺缺血-再灌注诱发的脑损伤，为临床防治肺I/R引起的远隔器官损伤提供新治疗思路与方法。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物本实验经过温州医科大学实验动物中心实验伦理委员会批准，所有实验步骤均通过该委员会认可。雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠50只，体质量20~24 g，8~10周龄，由温州医科大学实验动物中心提供[许可证号：SYXK(浙)2012-075]。所有实验于温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所进行。
1.1.2 实验试剂及材料氯胺酮(福建古田药业有限公司，中国), 塞拉嗪(吉林长春华牧有限公司，中国); 右美托咪定、阿替美唑(江苏恒瑞制药有限公司，中国); BCA试剂盒、Caspase3活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国); TUNEL凋亡试剂盒(Roche公司，瑞士)，逆转录试剂盒(Thermo公司，美国)；兔抗大鼠GRP78，JNK，p-JNK，Caspase12一抗(英国Abcam公司)，小鼠抗大鼠CHOP一抗(美国CST公司)；辣根酶标记山羊抗兔二抗(博蕴，中国)；一抗稀释液(Beyotime，碧云天生物技术研究所，中国)；RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司，中国)；高速低温台式离心机(Thermo Fisher Scientific, 美国)；紫外分光光度计(Ultrospec 2100 pro Amersham BioSciences，美国); PCR热循环仪(LifePro，杭州博日科技有限公司, 中国)；多功能酶标仪(Thermo，美国)；UV-800全自动凝胶成像分析系统(温州奥利生物医学仪器厂，中国)；正置荧光显微镜(Nikon，日本)；蛋白电泳/转膜仪(BIO-RAD，美国)。
1.2 方法 1.2.1 实验分组实验动物按随机数字表法分为5组(n=10)：假手术组(Sham组)、缺血-再灌注损伤组(I/R组)、缺血-再灌注+阿替美唑组(atipamezole，Atip组)、缺血-再灌注+右美托咪定组(DEX组)、缺血-再灌注+右美托咪定+阿替美唑(DA组)。
1.2.2 肺缺血-再灌注模型制备依据文献采用C57BL/6J小鼠在体左侧肺门夹闭制备肺缺血-再灌注(I/R)模型[7]。100 mg/kg氯胺酮+10 mg/kg塞拉嗪联合腹腔注射进行麻醉，消毒胸颈部皮肤后切开并分离皮下组织和肌肉，暴露气管T型切开，气管插管后接呼吸机行机械通气, 呼吸机参数为：吸呼比为2: 3，呼吸频率为120次/min，100%氧体积分数，潮气量0.6~0.8 mL/min。于左胸部3~5肋间处开胸并游离左侧肺门，动脉夹阻断左肺门30 min，30 min后恢复血流再灌注180 min。灌注结束后暴露心脏，用生理盐水进行心脏灌流后开颅取脑组织。Sham组仅开胸不夹闭肺门，机械通气210 min；I/R组左肺门阻断30 min, 再灌注180 min；Atip组、DEX组、DA组分别在肺门阻断前30 min腹腔注射阿替美唑(250 μg/kg)、右美托咪定(20 μg/kg)、右美托咪定20 μg/kg+阿替美唑250 μg/kg，其余处理同I/R组。
1.2.3 光镜下脑组织形态学观察开颅取出脑组织后，取约0.5 cm3大小脑组织，经4%多聚甲醛固定数天后石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察各组标本组织学改变。
1.2.4 TUNEL法检测脑细胞凋亡指数石蜡包埋脑组织并切片，依次经染色、二甲苯、梯度乙醇、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除组织蛋白，蒸馏水漂洗后按照TUNEL试剂盒操作说明书进行操作，光学显微镜下观察脑细胞凋亡程度。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择10个高倍镜视野(400×)并记录总细胞数和凋亡细胞数，计算凋亡指数(apoptotic index, AI) =凋亡细胞数/总细胞数× 100%。
1.2.5 Caspase3酶活性检测按每3~10 mg脑组织加入100 μL的比例加入裂解液，冰上研磨成匀浆，转移到1.5 mL离心管中冰中裂解5 min。4 ℃，20 000 r/min离心10~15 min后转移上清液，按照Caspase3活性检测试剂盒操作说明书进行操作，采用分光光度计法检测脑组织中Caspase3酶活性。
1.2.6 Western blotting检测脑组织p-JNK、Caspase12和CHOP蛋白、GRP78表达水平冰上研磨脑组织，加入400 μL RIPA冰上裂解脑组织20 min，吸取匀浆液，4 ℃离心取上清液，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度并绘标准曲线，随后100 ℃煮沸10 min使蛋白变性。配胶进行电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗后分别加一抗(p-JNK、GRP78，均以1: 1 000稀释；GAPDH、Caspase12以1: 500稀释，CHOP以1: 300稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加二抗室温孵育1 h，再次TBST洗涤，加ECL工作液反应3 min，暗室曝光，Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。取目的蛋白条带灰度值和内参GAPDH条带灰度值的比值。计算p-JNK与JNK的比值，以反映p-JNK蛋白表达水平。
1.2.7 RT-PCR检测脑组织JNK、Caspase 12和CHOPG、RP78 mRNA表达水平取脑组织加液氮冰上研磨，以Trizol法提取总RNA并测定RNA浓度，按照RT-PCR试剂盒说明书进行cDNA合成及扩增。预变性:94 ℃，3 min；变性：94 ℃，30 s；退火：JNK(56 ℃)，Caspase12(58 ℃)，CHOP(54 ℃)，GRP78(49 ℃)，GAPDH(58 ℃)，30 s；延伸：72 ℃，1 min；终止延伸：72 ℃，5 min；循环33次。RT-PCR以GAPDH基因为内参照。引物序列为：Caspase12，上游引物：5’ -CTGACAG CTCCTCATGGACTC-3’，下游引物：5’ -GCCAGCA AACTGCATTAACTC-3’，309 bp；GRP78，上游引物：5’ -GATAATCAACCAACTG TTAC-3’，下游引物：5’ -GTATCCTCTTCACCAGT TGG-3’，575 bp；JNK，上游引物：5’ -CCAG GAAATGAGCTTGACA-3’，下游引物：5’ -CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’，420 bp; CHOP，上游引物：5’ -CACCTA TATCTCATCCCCAGGA-3’，下游引物：5’ -ACCACTCTGTTTCCGTTTCCTA-3’，217 bp；GAPDH，上游引物：5’ -ACTTGAAGGGT GGAGCCAAA-3’，下游引物：5’ -CCAGGAAA TGAGCTTGACA-3’，530 bp。结果用Quantity One分析。以目的基因条带灰度值和内参GAPDH条带灰度值的比值反映其表达水平。
1.3 统计学方法使用SPSS 19.0软件分析，计量资料行正态性检验，实验数据以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，多组样本的均数比较先行方差齐性检验，方差齐性者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者采用Duunet’ s检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 光镜下各组脑组织形态学变化光镜下Sham组的神经元呈圆形，可见细胞核与核仁，形态结构基本正常；I/R组、Atip组和DA组的神经元胞体轻微收缩，胞核略微深染，核仁较不明显，细胞有严重水肿现象，且变性坏死明显增多；DEX组神经元胞浆轻微肿胀，胞核变浅，细胞有轻度水肿现象，可见少量坏死细胞，见图 1。
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| A: Sham组; B: I/R组; C: Atip组; D: DEX组; E: DA组 图 1 光镜下各组脑组织形态学变化(HE×200) Figure 1 The histological changes of brain tissue in each group(HE×200) |
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与Sham组(10.00±0.04)%比较，其余各组脑细胞凋亡指数均明显升高(P＜0.01);I/R组(78.00±0.04)%与Atip组(79.00±0.04)%、DA组(80.00±0.06)%两两相互比较均差异无统计学意义(P＞0.05)；DEX组(54.00±0.07)%与I/R组、Atip组和DA组比较，脑细胞凋亡指数呈显著下降趋势(P＜0.01)，见图 2~3。
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| A: Sham组; B: I/R组; C: Atip组; D: DEX组; E: DA组 图 2 脑细胞凋亡TUNEL图(×400) Figure 2 The TUNEL staining results of brain cell apoptosis in each group(×400) |
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| 与Sham组比较，aP＜0.01;与DEX组比较，bP＜0.01 图 3 各组脑细胞凋亡指数 Figure 3 The apoptosis index of brain cell in each group |
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与Sham组(38.51±6.92)比较，其余各组Caspase3酶活性均明显升高(P＜0.01)，DEX组(99.53±8.81)与I/R(132.81±6.00)、Atip(133.46±4.77)和DA组(133.53±6.25)比较，Caspase3酶活性呈现明显下降趋势(P＜0.01)，I/R组、Atip组和DA组两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图 4。
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| 与Sham组比较，aP＜0.01;与DEX组比较，bP＜0.01 图 4 各组Caspase3酶活性变化 Figure 4 The Caspase3 activity of brain tissue in each group |
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与Sham组比较，其余各组p-JNK、Caspase12、CHOP、GRP78蛋白水平均明显升高(P＜0.01)；I/R组、Atip组和DA组两两比较，p-JNK、Caspase12、CHOP水平均差异无统计学意义(P＞0.05)，GRP78水平DA组明显升高(P＜0.01)；DEX组与I/R组比较，p-JNK、Caspase12、CHOP蛋白水平均明显下降(P＜0.01)，GRP78蛋白水平明显升高(P＜0.01)；DA组与DEX组比较，p-JNK、Caspase12、CHOP蛋白水平明显升高(P＜0.01)，GRP78蛋白水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 5~8和表 1。
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| 图 5 各组p-JNK蛋白表达量 Figure 5 The protein expressions of p-JNK in each group |
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| 图 6 各组Caspase12蛋白表达量 Figure 6 The protein expressions of Caspase12 in each group |
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| 图 7 各组CHOP蛋白表达量 Figure 7 The protein expressions of CHOP in each group |
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| 图 8 各组GRP78蛋白表达量 Figure 8 The protein expressions of GRP78 in each group |
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| 组别 | p-JNK | Caspase12 | CHOP | GRP78 |
| Sham组 | 0.16±0.07 | 0.23±0.04 | 0.23±0.07 | 0.23±0.07 |
| I/R组 | 0.73±0.06ab | 0.67±0.07ab | 0.73±0.03ab | 0.58±0.06ab |
| Atip组 | 0.75±0.04ab | 0.66±0.05ab | 0.74±0.05ab | 0.57±0.04ab |
| DEX组 | 0.45±0.08a | 0.44±0.07a | 0.44±0.09a | 0.82±0.10a |
| DA组 | 0.76±0.03ab | 0.68±0.09ab | 0.67±0.06ab | 0.80±0.05a |
| F值 | 189.673 | 87.692 | 113.858 | 124.028 |
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| 注：与Sham组比较，aP＜0.01;与DEX组比较，b P＜0.01 | ||||
与Sham组比较，其余各组JNK、Caspase12、CHOP、GRP78 mRNA水平均明显升高(P＜0.01)；I/R组、Atip组及DA组的mRNA水平两两比较，JNK、Caspase12、CHOP mRNA水平均差异无统计学意义(P＞0.05)，GRP78 mRNA水平DA组明显升高(P＜0.01)；DEX组与I/R组比较，JNK、Caspase12、CHOP mRNA水平呈显著下降趋势(P＜0.01)，GRP78 mRNA水平明显升高(P＜0.01)；DA组与DEX组比较，JNK、Caspase12、CHOP mRNA水平明显升高(P＜0.01)，GRP78 mRNA水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2和图 9~12。
| 组别 | JNK | Caspase12 | CHOP | GRP78 |
| Sham组 | 0.14±0.06 | 0.14±0.06 | 0.14±0.05 | 0.12±0.05 |
| I/R组 | 0.46±0.08ab | 0.53±0.08ab | 0.56±0.06ab | 0.38±0.03ab |
| Atip组 | 0.47±0.05ab | 0.54±0.04ab | 0.57±0.03ab | 0.39±0.05ab |
| DEX组 | 0.32±0.03a | 0.32±0.05a | 0.36±0.07a | 0.50±0.08a |
| DA组 | 0.48±0.05ab | 0.56±0.06ab | 0.55±0.08ab | 0.53±0.06a |
| F值 | 64.726 | 90.739 | 89.192 | 81.625 |
| P值 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| 注：与Sham组比较，aP＜0.01;与DEX组比较，b P＜0.01 | ||||
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| 图 9 各组JNK mRNA的表达水平 Figure 9 The JNK mRNA expression in each group |
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| 图 10 各组Caspase12 mRNA的表达水平 Figure 10 The Caspase12 mRNA expression in each group |
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| 图 11 各组CHOP mRNA的表达水平 Figure 11 The CHOP mRNA expression in each group |
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| 图 12 各组GRP78 mRNA的表达水平 Figure 12 The GRP78 mRNA expression in each group |
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右美托咪定为高选择性α2肾上腺素能受体激动药，能够激活胆碱能抗炎通路，具有抗炎、器官保护作用[8]；作用于中枢神经系统的α2肾上腺素能受体时，可使细胞产生超极化，进而抑制神经元的放电，阻断了疼痛信号向大脑传导，产生镇静、镇痛、抗焦虑和抑制交感活动、间接提高迷走神经张力的效应，其他作用还包括抗寒战、止涎和利尿等[9-11]。常用于血管疾病患者围手术期的辅助麻醉以及重症监护病房的镇静镇痛，有很好的围术期器官保护作用，能有效改善术中缺血对器官的损伤[12]。已有研究表明，对于异氟烷引起的神经细胞凋亡和大鼠认知功能损害，右美托咪定可起到积极的改善效果[13-14]。在脑缺血-再灌注损伤的48 h内，使用右美托咪定可有效防止小鼠海马区迟发性神经元死亡[1]。
器官缺血-再灌注时细胞内信号转导涉及多条途径, 其中内质网应激和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal kinase, JNK)信号转导通路在脏器I/R中起重要作用。ATP耗竭、缺血缺氧、氧化应激、葡萄糖/营养物质匮乏等均可引起ERS, 适度的ERS对机体起保护作用，但持续过强的ERS将导致细胞凋亡[15]。本实验的四种检测蛋白JNK、Caspas12、CHOP和GRP78为内质网应激相关蛋白，其中葡萄糖调节蛋白78 (glucosere gulated protein 78，GRP78)是一种位于内质网内的钙离子结合分子伴侣，当细胞受到外界刺激发生ERS时，细胞内会产生大量错误折叠或未折叠蛋白蓄积，此时GRP78也会大量表达从而与ER中错误折叠和未折叠蛋白结合，维持内环境稳定。因此，GRP78的急速上调被认为是ERS最敏感的标志[16-17]。本实验结果中，除sham组外，其余4组GRP78表达水平均有显著增高，说明肺I/R成功诱导了过度ERS发生，其中以DEX组GRP78表达水平最高，说明右美托咪定可以通过上调GRP78对组织细胞发挥着保护作用。JNK信号通路是ERS的凋亡途径之一。有研究表明，在脏器I/R损伤过程中JNK发生过度激活，而在缺血或再灌注前抑制JNK激活可明显减少细胞凋亡，减轻脏器I/R损伤[18-20]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteinylaspartate specific proteinase 12, Caspase12)广泛存在于小鼠的各组织中，是ERS的主要凋亡信号分子之一，内质网内钙离子平衡的失调或者内质网蛋白积累过多都会导致Caspase12的表达。过度的ERS可引起其他Caspase家族如Caspase9和Caspase3的活化，引起一系列的级联反应，最终导致细胞凋亡的发生[21]。CHOP是促凋亡的重要信号分子，是ERS特异的转录因子，在正常情况下表达水平很低，而在ERS时，其表达量大大增加，被认为是内质网应激的标志物[22]。细胞凋亡是程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，可被多种细胞信号激活，主要信号通路有线粒体途径与死亡受体途径。细胞内的凋亡信号通常激活线粒体途径，释放线粒体促凋亡蛋白及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)等，激活Caspase级联反应，诱发细胞凋亡，表现为Caspase3凋亡蛋白酶升高。
本研究结果显示，与假手术组比较，其余4组JNK、Caspase12、CHOP蛋白及mRNA、Caspase3凋亡蛋白酶和脑细胞凋亡指数均呈明显上升趋势，光镜下脑神经元均有不同程度的水肿，脑细胞均有损伤性的变化，说明肺I/R的确能引发脑组织发生过度ERS反应，使JNK、Caspase12和CHOP表达上升，并通过线粒体途径诱发细胞凋亡引起脑组织的损伤；与I/R组比较，DEX组JNK、Caspase12、CHOP表达水平、Caspase3凋亡蛋白酶和脑细胞凋亡指数均明显下降，光镜下脑细胞水肿和损伤性变化减轻，说明DEX可能通过抑制内质网应激反应，降低JNK、Caspase12和CHOP表达，使脑细胞凋亡数量减少，从而减轻肺I/R诱发的脑损伤，对脑组织起保护作用。为了进一步验证右美托咪定的保护机制，本研究又设置了Atip组和DA组。阿替美唑是选择性α2-肾上腺素受体阻滞剂，通过比较I/R组和Atip组的各项检测指标，发现以上检测指标均差异无统计学意义，说明阿替美唑对肺I/R诱发的脑损伤没有保护作用。而通过DEX组与DA组比较，发现右美托咪定对脑的保护作用能被阿替美唑所阻断，表现为DA组的JNK、Caspase12、CHOP表达量与Caspase3凋亡蛋白酶和脑细胞凋亡指数均呈明显上升趋势，光镜下脑细胞损伤加重，提示右美托咪定保护肺I/R诱发的脑损伤作用可能与激动α2-肾上腺素能受体有关。同时亦有研究发现，在脑缺血-再灌注模型的基础上，通过DEX预处理，可激活α2-肾上腺素能受体从而减轻大鼠脑I/R损伤[23]。据此，笔者推测，右美托咪定对小鼠肺缺血-再灌注诱发脑损伤有一定的保护作用，而这种保护作用可能是通过抑制内质网应激相关蛋白JNK、Caspase12和CHOP以及提高GRP78的稳定细胞作用，减少脑细胞凋亡，从而减轻脑损伤，其机制可能是右美托咪定通过激动α2-肾上腺素能受体，抑制内质网发生过度应激反应。
综上所述，肺缺血-再灌注前给予右美托咪定可减轻肺缺血-再灌注诱发的脑损伤，其机制可能是激动α2-肾上腺素能受体，抑制内质网过度应激，减少脑细胞凋亡。
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