中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (11): 1252-1255
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陈红纲, 杨蓉佳, 唐艳, 许筠, 冯友繁, 刘世杰, 张世魁, 候丽君. 姜黄素对百草枯中毒大鼠肺组织胶原面积及TNF-α、IL-6、NE表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(11): 1252-1255.
Chen Honggang, Yang Rongjia, Tang Yan, Xu Jun, Feng Youfan, Liu Shijie, Zhang Shikui, Hou Lijun. Effects of curcumin on the lung collagen area and the expressions of TNF-α, IL-6 and NE in paraquat-poisoned rats[J]. Chin J Emerg Med, 2017, 26(11): 1252-1255.
姜黄素对百草枯中毒大鼠肺组织胶原面积及TNF-α、IL-6、NE表达的影响
陈红纲, 杨蓉佳, 唐艳, 许筠, 冯友繁, 刘世杰, 张世魁, 候丽君     
730000 兰州，甘肃省人民医院急诊科(陈红纲、杨蓉佳、冯友繁、张世魁)；730046 兰州，兰州市第二人民医院急诊科(唐艳、许筠、刘世杰、候丽君)
收稿日期: 2017-03-27
基金项目: 兰州市卫生科技发展项目(LZWSKY2014-2-18)
通信作者: 杨蓉佳，Email：13909447906@139.com.
摘要: 目的 观察姜黄素对百草枯中毒大鼠肺组织胶原面积及TNF-α、IL-6、NE表达的影响，以探讨姜黄素治疗百草枯中毒的可能机制。方法 SPF级Wistar大鼠108只，随机(随机数字法)分为空白对照组(B组)、百草枯染毒组(PQ组)、姜黄素治疗组(PC组)，PQ组及PC组给予百草枯(50 mg/ kg)(北京华都生物科技)一次性灌胃染毒复制中毒模型，同时空白对照组给予等量生理盐水灌胃；灌胃30 min后，PC组给予姜黄素(sigma公司)200 mg/kg一次性腹腔注射，B组、PQ组注射等体积生理盐水，常规饲养。于3 d、7 d、14 d，行HE染色、Masson染色观察肺组织病理形态学、胶原纤维的分布及变化，酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL-6)含量，免疫组织化学法观察肺组织中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的表达及变化。结果 与B组比较，PQ组各时间点肺组织均有不同程度的肺泡炎，以7 d时最为严重；肺组织弥漫性纤维化，大量胶原纤维沉积，14 d胶原纤维沉积最严重；NE表达明显增强，14 d最明显。血清TNF-α、IL-6含量亦显著升高(P＜0.05，P＜0.01)；与PQ组比较，PC组各时间点肺泡炎及肺纤维化程度均有明显减轻，NE表达明显减弱，TNF-α、IL-6含量亦显著降低(P＜0.05)。结论 抑制炎症因子及NE的表达，降低大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度，可能是姜黄素治疗百草枯中毒肺的作用机制之一。
关键词: 百草枯     姜黄素     病理形态     胶原面积     肿瘤坏死因子     白介素-6     中性粒细胞弹性蛋白酶    
Effects of curcumin on the lung collagen area and the expressions of TNF-α, IL-6 and NE in paraquat-poisoned rats
Chen Honggang , Yang Rongjia , Tang Yan , Xu Jun , Feng Youfan , Liu Shijie , Zhang Shikui , Hou Lijun     
Emergency Department, Gansu Province People' s Hospital, Lanzhou 730000, China (Chen HG, Yang RJ, Feng YF, Zhang SK); Emergency Department, the Second People' s Hospital of Lanzhou, Lanzhou 730046, China (Tang Y, Xu J, Liu SJ, Hou LJ)
Corresponding author: Yang Rongjia, Email:13909447906@139.com.
Abstract: Objective To observe the effects of curcumin on the lung collagen area and the expression of TNF-α, IL-6 and NE in paraquat-poisoning rats at different intervals, and discuss the possible mechanism of curcumin antagonizing paraquat poisoning. Methods A total of 108 SPF Wistar rats were divided into three groups(random number): blank group(B group)for control, paraquat poisonin group(PQ group) and curcumin-treatment group(PC group). The rats of PQ group and PC group were given paraquat (50 mg/kg) by gavage, and the rats of B group were given equal volume of sterile saline solution at the same time. Thirty minutes later, the rats of PC group were given curcumin (200 mg/kg) by intraperitoneal injection, and rats of B group and PC group were given equal volume of sterile saline solution instead. At 3 d, 7 d and 14 d after modeling, the distribution and pathological changes of lung tissue and collagen fiber were observed by HE and Masson staining. The concentration of tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by enzyme-immunoassay. The lung neutrophil elastase(NE) expression was observed by immuno-histochemical method. Result Compared with B group, PQ group had pulmonary alveolitis in different degrees at different intervals, and the most serious pulmonary alveolitis was observed at 7 d after modeling. Diffused pulmonary fibrosis of the lung tissue and a large area of collagen fiber deposition were observed especially at 14 d after modeling, as well as the expression of NE was observed obviously, especially at 14 d after modeling. The concentration of TNF-α, IL-6 in serum were significantly increased(P < 0.05, P < 0.01). Compared with PQ group, the pulmonary alveolitis and fibrosis obviously in PC group with obvious reduction in the expression of NE and significant descrease in the concentrations of TNF-α and IL-6(P < 0.05). Conclusion Inhabiting inflammatory factors to alleviate the seriousness of alveolar inflammation and pulmonary fibrosis might be one of the mechanism of treatment with curcumin for paraquat poisoning rats.
Key words: Paraquat     Curcumin     Pathomorphism     Collagen area     TNF-α     IL-6     Neutrophil elastase    

百草枯(paraquat)是目前广泛使用的除草剂。对人畜毒性较强，可以引起肝、肾、肺等主要脏器损害。其中肺组织纤维化损害最为严重，并呈现进行性发展过程[1]。文献报道急性百草枯中毒病死率高达75%~80%[2]，目前缺乏特效解毒剂以及有效治疗手段。百草枯中毒特点早期表现为急性肺损伤，晚期表现为肺泡内和肺间质纤维化，患者多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭[3-4]。本实验采用百草枯灌胃染毒复制中毒模型，观察姜黄素对染毒后不同时间点大鼠肺组织胶原面积、病理形态、NE表达以及TNF-α、IL-6含量的影响，探讨姜黄素治疗百草枯中毒的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物分组

108只SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物质量合格证号：62001000000165；许可证号：SCXK(甘)2011-0001。各组大鼠适应性喂养3 d，随机(随机数字表法)分为空白对照组(B组)、百草枯染毒组(PQ组)、姜黄素治疗组(PC组)，每组36只，各组又以3，7，14 d为时间点分为3个亚组(每组12只)记录相应死亡只数并检测相应指标。

1.2 模型制备及给药

PQ组及PC组给予百草枯(50 mg/kg)(北京华都生物科技)一次性灌胃染毒复制中毒模型，同时B组给予等量生理盐水灌胃；灌胃30 min后，PC组给予姜黄素(sigma公司)200 mg/kg一次性腹腔注射，B组、PQ组注射等体积生理盐水，常规饲养。

1.3 肺组织病理形态学、胶原面积的观察

分别于模型制备后第3，7，14天取血并处死大鼠，剪开胸腔，小心分离肺组织，取右肺组织制备病理切片，HE、Masson染色后观察肺组织形态结构的改变。

1.4 TNF、IL-6含量的测定

各组大鼠于第3，7，14天分3次采集标本，股动脉取血处死，制备抗凝血，分离血清备用，采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6(购自武汉博士德生物技术有限公司)含量，具体方法严格按试剂盒说明书进行。

1.5 NE蛋白表达的观察

分别于模型制备后第3，7，14天采集血清后处死大鼠，剪开胸腔，小心分离肺组织，取右肺组织制备病理切片，免疫组化法检测NE(一抗：NE检测试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；二抗：SP-9001兔SP检测试剂盒，中杉金桥生物技术有限公司)的表达。蛋白表达阳性结果的判定标准：细胞内出现棕黄色颗粒，表达视为阳性，颜色越深表达越强，细胞中未出现棕黄色颗粒，则表达视为阴性。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较行方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实验动物一般情况观察结果

PQ组大鼠在染毒1 h后开始出现精神不佳、眯眼、拱背、步态蹒跚，2 h出现反应迟钝、呼吸急促甚至呼吸窘迫等症状。10 h后则出现口唇发绀、后肢无力、仰卧等现象。PC组大鼠染毒后中毒反应较PQ组轻微，进食水较正常，精神好，反应较灵敏，毛色较洁净，较少出现呼吸急促、口唇发绀等表现。但在实验过程中，2组大鼠均有一定数量的死亡，见表 1。

表 1 大鼠血清TNF-α和IL-6含量(x±s) Table 1 The levels of TNF-α and IL-6 in rat serum(x±s)
组别 只数 TNF-α(ng/L) IL-6(ng/L)
B组
  3 d 12 16.38±3.32 54.34±6.28
  7 d 12 18.14±2.97 58.17±7.33
  14 d 12 18.72±2.88 54.42±7.32
PQ组
  3 d 8 48.64±4.37a 87.02±8.93a
  7 d 6 50.37±4.09a 113.22±9.80b
  14 d 3 39.92±3.47a 90.87±8.55b
PC组
  3 d 10 22.23±3.69c 80.80±7.45c
  7 d 9 27.50±3.28c 75.47±8.41c
  14 d 6 27.56±4.45c 77.74±8.24c
注：与B组比较，aP＜0.05, bP＜0.01；与PQ组比较，cP＜0.05
表选项
2.2 各组大鼠不同时间点肺组织胶原面积的观察

肺组织切片经Masson染色后镜下观察显示胶原纤维呈现亮绿色，肌肉、胞浆呈现红色，胞核呈现蓝黑色。B组肺泡壁及间质有少量胶原纤维增生；PQ组可见肺组织弥漫性纤维化，大量胶原纤维沉积，肺泡间隔以及部分肺泡腔被胶原纤维占据，正常肺泡结构萎陷，14 d胶原纤维沉积最严重，于小支气管、小血管周围明显增多，肺泡间质胶原纤维呈小片状或束状分布；PC组随时间推移胶原纤维亦呈逐渐增多趋势, 但分布比PQ组明显减少，见图 1。

A：B组(3 d)；B：B组(7 d)；C：B组(14 d)；D：PQ组(3 d)；E：PQ组(7 d)；F：PQ组(14 d)；G：PC组(3 d)；H：PC组(7 d)；I：PC组(14 d) 图 1 各组大鼠肺组织胶原面积比较(Masson×20) Figure 1 Masson staining of lungs in three group of rats(×20)
图选项
2.3 各组大鼠不同时间点肺组织病理形态的观察

B组大鼠各期肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺泡间隔未见增厚，肺组织内可见轻度炎性细胞浸润。PQ组3、7、14 d肺组织均可见程度不同的肺泡炎改变，以7 d时最为严重，肺组织毛细血管充血、水肿，肺泡间隔明显增宽，肺泡壁增厚，肺泡腔内伴有大量炎性细胞浸润；14 d肺泡炎略有减轻。PC组肺泡炎程度与PQ组比较均有明显减轻，肺泡炎多呈轻、中度改变，见图 2。

A：B组(3 d)；B：B组(7 d)；C：B组(14 d)；D：PQ组(3 d)；E：PQ组(7 d)；F：PQ组(14 d)；G：PC组(3 d)；H：PC组(7 d)；I：PC组(14 d) 图 2 各组大鼠肺组织病理形态(HE×20) Figure 2 HE staining of lungs in three group of rats(×20)
图选项
2.4 各组大鼠不同时间点肺组织中NE的表达

镜下显示，NE表达分布于支气管上皮细胞与肺泡上皮细胞的胞浆内，以支气管组织中表达尤为明显，B组大鼠支气管黏膜上皮细胞的胞浆可见NE蛋白表达，肺组织结构正常；PQ组NE表达与B组比较3、7、14 d均明显增强，以7 d表达尤为明显；PC组与PQ组比较3、7、14 d NE表达均明显减弱，见图 3。

A：B组(3 d)；B：B组(7 d)；C：B组(14 d)；D：PQ组(3 d)；E：PQ组(7 d)；F：PQ组(14 d)；G：PC组(3 d)；H：PC组(7 d)；I：PC组(14 d) 图 3 各组大鼠肺组织免疫组化检测NE蛋白的表达(SABC ×400) Figure 3 The expression of NE in the lung of rats detected by immunohistochemistry(SABC ×400)
图选项
2.5 各组大鼠不同时间点血清中TNF-α、IL-6的表达

实验结果显示，PQ组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量在3、7、14 d均有明显升高，与B组比较，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，7 d的数值升高最明显；与PQ组比较，PC组在各个点的TNF-α、IL-6含量均显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 1。

3 讨论

本实验用百草枯一次性灌胃建立大鼠百草枯中毒模型，病理形态学可见各时间点肺组织均有不同程度的肺泡炎改变，以7 d时最为严重；肺组织弥漫性纤维化，大量胶原纤维沉积，14 d胶原纤维沉积最严重；TNF-α、IL-6含量显著升高、NE表达明显增强，表明百草枯中毒肺损伤及肺纤维化动物模型复制成功。

氧化应激引起的炎症反应是目前公认的百草枯中毒机制之一。Chen等[5]的研究发现百草枯中毒大鼠早期肺损伤后通过激活一系列炎症因子参与到肺部炎症的发展中，如TNF-α、IL-6、IL-8等。IL-6作为炎性细胞分化的主要调节因子，由激活的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌。IL-6不但可以促进细胞间黏附分子的表达，还可以促进淋巴细胞的分化和炎性激活。使炎性损伤反应进一步加强[6]。TNF-α是由活化的单核巨噬细胞产生、作用广泛的细胞因子，有研究表明TNF-α是百草枯中毒导致急性炎症反应的始动因子和枢纽因子，它可激活NF-κB介导IL-6、IL-8等细胞因子的合成与释放，启动炎症级联反应[7-9]。NF-κB是调控炎症反应的重要核转录因子，可在多种细胞中被激活，通过调节多种前炎性因子/趋化因子、黏附分子、生长因子的表达，在应激反应、炎症和免疫反应等过程中发挥重要甚至中心作用[10]。是参与急性肺损伤和肺纤维化的重要因子[11]。上述炎症级联反应一旦启动就难以控制，形成放大效应，加速肺泡炎的发展和放大[12]。而TNF-α、IL-6含量升高又可趋化并激活更多的中性粒细胞，刺激中性粒细胞脱颗粒，生成自由基，释放各种蛋白酶和水解酶，其中NE是中性粒细胞释放的诸多蛋白酶中最重要的一种蛋白酶，NE与人类许多疾病的发生发展相关，如肺气肿、肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征等[11-13]，中性粒细胞释放各种蛋白酶和水解酶诱导细胞凋亡，造成局部组织损伤和毛细血管通透性增高，进一步加重微循环障碍，微循环障碍反过来又诱发炎症介质的释放，使机体炎症反应和组织损伤不断放大[14-15]。本研究结果显示PQ组各时间点TNF-α、IL-6、NE表达均显著升高，与B组比较差异具有统计学意义，且表达水平是一致的，这与上述研究中的描述相符。

姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚。众多动物实验表明，它具有广泛的药理作用如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂等[16]。本实验结果表明姜黄素可显著降低炎症因子TNF-α、IL-6的含量，减轻百草枯中毒大鼠肺泡炎症，减轻早期肺损伤，这与Tyagi等[17]报道相一致。同时姜黄素还可抑制NE的表达，减少胶原纤维沉积，抑制肺纤维化。

综上所述，抑制炎症因子及NE的表达，改善大鼠肺泡炎，降低肺纤维化程度，可能是姜黄素治疗百草枯中毒的作用机制之一。

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