中华急诊医学杂志  2017, Vol. 26 Issue (10): 1164-1166
雷公藤甲素对H9c2心肌细胞缺氧再灌注损伤保护作用的研究
孙凤娟, 许建江, 赵圣刚, 张祥宇, 江力勤     
233000安徽省蚌埠, 蚌埠医学院(孙凤娟); 314000嘉兴, 嘉兴学院附属第二医院心血管内科(许建江、赵圣刚、张祥宇、江力勤)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心血管疾病中导致死亡的主要原因之一,也是冠心病中最严重的类型,常因持久而严重的心肌缺血导致部分心肌急性坏死,或诱发恶性心律失常而致死,具有起病急、病情重、病死率高、预后较差、发病年龄年轻化[1, 2]的特点。近年来,随着冠状动脉介入治疗和溶栓治疗的广泛开展,心肌梗死患者得到有效救治,但是再灌注心肌在减轻缺血缺氧的同时,部分心肌损伤进一步加重,甚至导致心肌梗死面积增加,称之为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[3],严重制约心肌梗死患者再灌注治疗后的获益[4]。随着对缺血再灌注损伤机制的深入研究,目前普遍认为脂质过氧化及氧自由基生成是促进缺血再灌注损伤进展的重要因素[5]

本研究采用缺氧再灌注方法诱导H9c2大鼠心肌细胞发生损伤,观察雷公藤甲素(triptolide,TP)对心肌细胞缺氧再灌注损伤的保护作用,并探讨其作用机制,为TP用于临床治疗缺血性心脏病提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 药物与试剂

TP,纯度≥98%(北京索宝生物科技有限公司)。首先用DMSO配成20 μg/mL储备液,分装后4 ℃保存。DMEM高糖培养基,胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(P/S)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)(美国Gibco公司);CCK-8试剂盒(杭州诺杨生物技术有限公司);DCFH-DA探针,乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株

H9c2大鼠胚胎心肌细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.3 仪器

Multiskan GO酶标仪,Sorvall ST16离心机,HERACELL 240iCO2培养箱(美国Thermo公司);Axio Vert.A1倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司);MIC-101细胞缺氧装置(美国Billups-Rothenberg公司);SHP-150上海精宏电热生化培养箱,DK-8D上海精宏电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)。

1.4 方法 1.4.1 细胞培养

H9c2细胞用含10% FBS,1% P/S的DMEM高糖培养基,于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养,待细胞铺满瓶底的80%~90%时用0.5%胰蛋白酶消化,并按1: 3进行传代或进行后续实验。

1.4.2 H9c2心肌细胞缺氧再灌注损伤模型制备

将H9c2贴壁细胞加胰酶消化制成细胞悬液,按细胞密度为4×104/mL接种于96孔板,待细胞贴壁80%以上,首先用N2 95%和CO25%的混合气体置换出培养基中溶解的氧气的方法制备无糖-缺氧培养基,然后用无糖-缺氧培养基取代细胞培养孔板中的正常培养基,加入浓度梯度为100、50、20、10、5、1 nmol/L的TP,对照组加入同样密度的细胞悬液但不加入TP,另设正常培养液孔作为空白孔,之后将孔板放入缺氧装置中,置于37 ℃电热生化培养箱中缺氧4 h,换正常培养基后再置于CO2培养箱中复氧4 h[6],作用完毕后,每孔加入CCK-8 10 μL继续培养1 h后,用酶标仪在450 nm处测各孔吸光度值,计算出各组细胞增值率。同时倒置显微镜观察各组细胞生长情况及形态变化。

1.4.3 TP对缺氧再灌注处理H9c2细胞存活率及细胞形态的影响

细胞接种方法如“2.2”。作用结束后,按“2.2”进行细胞存活率检测及形态学观察。

1.4.4 TP对缺氧再灌注处理H9c2细胞上清液中CK、LDH、SOD和MDA水平的影响

H9c2细胞以密度5×105/mL、每孔500 μL接种于24孔板中。细胞指数增长期加入TP 100、50、20、10、5、1 nmol/L,对照组加入等量的正常培养液,按缺氧再灌注损伤模型制备方法处理,检测细胞培养上清液中CK、LDH、SOD和MDA的水平,实验操作按照对应检测试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法

所测得计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,统计作图使用GraphPad Prism6.0软件进行,数据间差异比较采用单因素方差分析或t检验。所有实验重复至少3次。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 H9c2细胞缺氧再灌注损伤模型制备

缺氧再灌注处理对细胞存活的影响分别加入TP 100、50、20、10、5、1 nmol/L进行处理(图 1),正常培养组细胞增殖率与缺氧再灌注处理组相比,两组相应TP浓度组比较,TP 100、50、20、10 nmol/L组差异无统计学意义,而TP 5、1 nmol/L组差异有统计学意义(P<0.05),说明TP对缺氧再灌注损伤H9c2细胞具有保护作用,且存在浓度依赖。

缺氧再灌注处理组与正常培养组相比, 黑色表示缺氧再灌注处理组,灰色表示正常培养组,两组比较,aP<0.05 图 1 缺氧再灌注损伤对H9c2细胞增值率的影响

选择未加入TP的缺氧再灌注组及正常培养组,倒置显微镜下观察到(图 2):正常培养的H9c2细胞呈长梭形,大小均匀,形状规则,细胞膜完整,胞核清楚可见。缺氧再灌注损伤组细胞出现形态改变,细胞皱缩、体积缩小,部分细胞失去梭形外观,甚至变圆,细胞膜不完整,边界不清,细胞间隙增宽。

图 2 缺氧再灌注处理对H9c2心肌细胞形态的影响(×50)
2.2 TP对H9c2细胞缺氧再灌注损伤的保护作用 2.2.1 对H9c2细胞存活率及细胞形态的影响

实验结果表明(图 3),H9c2细胞进行缺氧再灌注处理后,加用TP 100、50、20、10、5、1 nmol/L组的细胞存活率与对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。

与对照组比较,aP<0.05、bP<0.01 图 3 TP对缺氧再灌注损伤H9c2细胞存活率的影响

倒置显微镜下观察到(图 4):缺氧再灌注后细胞呈现不同程度皱缩、体积缩小,部分细胞失去梭形外观,细胞周边突起减少或消失,细胞膜不同程度损伤,边界不清,细胞间隙增宽,贴壁细胞脱落较多。TP 100、50、20、10 nmol/L组细胞上述形态改变程度较轻,说明TP对缺氧再灌注损伤的H9c2细胞有明显保护作用。

图 4 TP对缺氧再灌注损伤H9c2心肌细胞形态的影响
2.2.2 对细胞上清液中CK、LDH、SOD、MOD水平的影响

CK和LDH在心肌细胞损伤时从细胞内进入细胞上清液,是心肌细胞损伤的标志。本实验结果表明(图 5),与对照组相比,TP 100、50、20、10 nmol/L组细胞上清液中CK和LDH的水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比(图 5),TP 100、50、20、10 nmol/L组SOD活力显著增高,差异有统计学意义(P<0.05、0.01),TP 100、50、20、10 nmol/L组MDA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。而TP 5、1 nmol/L组对SOD、MDA的影响不明显。

与对照组比较,aP<0.05、bP<0.01 图 5 TP对缺氧再灌注损伤H9c2细胞上清液中CK、LDH、SOD、MDA水平的影响
3 讨论

MIRI是冠状动脉因多种急慢性病因导致血管闭塞,进而血管开通,血流恢复灌注时的必然结果[7],越来越多的研究表明,MIRI的发生发展是非常复杂而精密的过程,受多种机制的影响,目前普遍认为其发病机制中,有线粒体损伤、活性氧的产生(reactive oxygen species, ROS)、Ca2+超载等学说[8]。其中活性氧簇可激活多种细胞因子,间接引起自身和周围细胞的非特异性损伤,与细胞膜的磷脂、酶或膜受体相关的多不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应形成MDA等脂质过氧化产物,进而损伤细胞膜,引起心肌酶外漏,改变蛋白酶表面结构使其功能受损,甚至可损伤DNA,RNA分子结构。另外,亦可激活TNF-α等细胞因子导致心肌细胞坏死[9]。正常机体内氧化系统与抗氧化系统维持在动态平衡,当各种原因打破这种平衡后,机体将会发生氧化应激损伤。有研究发现,心肌细胞缺血再灌注后,MDA水平明显增加,并导致心肌细胞功能障碍,结构破坏,凋亡坏死增加[8, 10]。本研究用大鼠H9c2心肌细胞制备缺氧再灌注损伤模型,统计缺氧处理与正常培养组的细胞增值率,结果显示,缺氧处理组细胞增殖率明显低于正常培养组,并且镜下观察心肌细胞形态不规则,大小不一,失去典型的梭形外观,细胞膜不清晰,细胞间隙增宽,此结果表明,缺氧再灌注损伤可明显降低细胞增殖率,并导致H9c2细胞形态学发生改变,同时也提示本研究缺氧再灌注损伤模型制备成功。

TP是从卫矛科植物雷公藤的根中提取的生物活性成分之一,是活性最高的环氧化二萜内酯类化合物,难溶于水,易溶于DMSO、无水乙醇等,长期以来被用以治疗麻风反应、风湿性关节炎等,后有研究表明雷公藤内脂具有明显的免疫抑制,抗炎,抗肿瘤等作用,近年来主要用于治疗多种自身免疫性疾病以及肿瘤等[11-12]

本研究探讨了TP对H9c2心肌细胞缺氧再灌注损伤的保护作用。研究发现不同浓度TP处理均可使H9c2心肌细胞的生存率明显高于对照组,并且TP 100、50、20、10 nmol/L组镜下细胞的大小、形态、细胞膜完整性及细胞间隙改变较对照组明显减轻,其中以TP 100、50、20 nmol/L组保护作用更为显著。同时,作为心肌细胞损伤标志物的心肌酶CK和LDH在TP 100、50、20、10 nmol/L组的外漏明显少于对照组。此外,TP 50、20 nmol/L处理使H9c2细胞内MDA水平显著降低,而抗氧化酶SOD活性在TP 100、50、20、10 nmol/L组显示明显增加。这一实验结果表明TP可通过降低活性氧的生成和脂质过氧化,增加抗氧化酶的活性来恢复细胞内的氧化/抗氧化平衡,从而对H9c2细胞缺氧再灌注损伤发挥保护作用,并存在浓度依赖。此前也有研究表明TP可降低小鼠肝脏缺血再灌注损伤的炎症反应[13],降低MDA水平,同时SOD等抗氧化物质水平升高[14-15],与本实验结果一致。

参考文献
[1] 杨帆, 王丽, 赵洛沙, 等. 低钠血症对急性心肌梗死经皮冠脉介入治疗患者近期预后的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(3): 328-332. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2017.03.018
[2] 王越越, 汪琦瑛, 韩国鑫, 等. 青年冠心病患者临床特点及危险因素分析[J]. 中华急诊医学杂志, 2015, 24(4): 386-390. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.04.010
[3] Tan ME, He CH, Jiang W, et al. Development of solid lipid nanoparticles containing total flavonoid extract fromDracocephalum moldavica L. and their therapeutic effect against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Int J Nanomedicine, 2017, 12: 3253-3265. DOI:10.2147/IJN.S131893
[4] Ibanez B, Heusch G, Ovize M, et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 65(14): 1454-1471. DOI:10.1016/j.jacc.2015.02.032
[5] Wagner S, Ruff HM, Weber SL, et al. Reactive oxygen species-activated Ca/calmodulin kinase Ⅱdelta is required for late I(Na) augmentation leading to cellular Na and Ca overload[J]. Circ Res, 2011, 108(5): 555-565. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.110.221911
[6] 杨晋静, 陈海波, 王宪云, 等. 溶血磷脂酸对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制[J]. 中国循环杂志, 2013(03): 222-225. DOI:10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.018
[7] Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury:a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 92-100. DOI:10.1172/JCI62874
[8] Sterba M, Popelova O, Vavrova A, et al. Oxidative stress, redox signaling, and metal chelation in anthracycline cardiotoxicity and pharmacological cardioprotection[J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18(8): 899-929. DOI:10.1089/ars.2012.4795
[9] Chen S, Li S. The Na+/Ca(2)+ exchanger in cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Med Sci Monit, 2012, 18(11): A161-A165. DOI:10.12659/MSM.883533
[10] Murray TV, Ahmad A, Brewer AC. Reactive oxygen at the heart of metabolism[J]. Trends Cardiovasc Med, 2014, 24(3): 113-120. DOI:10.1016/j.tcm.2013.09.003
[11] Li XJ, Jiang ZZ, Zhang LY. Triptolide:progress on research in pharmacodynamics and toxicology[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 155(1): 67-79. DOI:10.1016/j.jep.2014.06.006
[12] Zhang B, Song C, Feng B, et al. Neuroprotection by triptolide against cerebral ischemia/reperfusion injury through the inhibition of NF-kappaB/PUMA signal in rats[J]. Ther Clin Risk Manag, 2016, 12: 817-824. DOI:10.2147/TCRM.S106012
[13] 薛佩彤, 李宏. 中药预处理保护肝脏缺血再灌注损伤的研究进展[J]. 中国中西医结合外科杂志, 2016, 22(5): 511-514. DOI:10.3969/j.issn.1007-6948.2016.05.029
[14] Ge HL, Zhou YJ, Ma HY, et al. Effectiveness of triptolide-coated stent on decreasing inflammation and attenuation of intimal hyperplasia in a pig after coronary angioplasty[J]. Angiology, 2011, 62(3): 265-269. DOI:10.1177/0003319710385337
[15] Wu C, Wang P, Rao J, et al. Triptolide alleviates hepatic ischemia/reperfusion injury by attenuating oxidative stress and inhibiting NF-kappaB activity in mice[J]. J Surg Res, 2011, 166(2): e205-213. DOI:10.1016/j.jss.2010.10.005